1. Introducción

Los nematodos gastrointestinales (GIN) son uno de los endoparásitos más importantes en los animales de pastoreo, especialmente los rumiantes (1). En las ovejas, estos parásitos pueden causar diversos efectos negativos, incluyendo enfermedades subclínicas con pérdida de peso y reducción de la producción animal, o enfermedades clínicamente manifestadas con signos de anemia, diarrea, pérdida de proteínas, anorexia, disminución de la inmunidad y fertilidad (2-4). En el caso de una carga alta de gusanos, puede ocurrir un desenlace posiblemente fatal (5). Por lo tanto, debido a la disminución de la productividad, los altos costos de tratamiento y la posible muerte de los animales, el parasitismo GIN puede tener un gran impacto económico (6). Los antihelmínticos disponibles comercialmente se han utilizado con éxito durante décadas para controlar estos parásitos (7). Sin embargo, como resultado de su uso irracional, se ha desarrollado resistencia a los antihelmínticos (RA), por lo que se consideran factores de alto riesgo los siguientes: subdosificación, tratamientos demasiado frecuentes, tratamiento masivo y regímenes de un solo fármaco (8, 9).

Por lo tanto, se ha informado un aumento de la resistencia de los nematodos al conocido grupo de antihelmínticos como los benzimidazoles, las lactonas macrocíclicas y los imidazotiazoles, a veces simultáneamente a varias clases diferentes (10, 11). El problema también está presente en nuevos grupos antihelmínticos como el monepantel, un derivado del aminoacetonitrilo (12). Las pérdidas económicas anuales resultantes del desarrollo de la RA se estiman en 38 millones de euros en Europa, con un crecimiento esperado en el futuro (10). Otros problemas asociados con el uso de antihelmínticos comerciales son los residuos presentes en productos animales como la carne y la leche o en el ecosistema y la biodiversidad. Esto representa un grave problema asociado con muchos medicamentos quimioterapéuticos disponibles actualmente, junto con el aumento del precio (13, 14). Todas las cuestiones mencionadas sugieren la necesidad urgente de desarrollar estrategias novedosas para futuros tratamientos (4).

Como posible solución para lograr un control sostenible de los GIN de ovejas, muchos investigadores han propuesto un enfoque integrado (1, 15-19). Esto se refiere al uso racional de antihelmínticos comerciales, junto con el uso de alternativas. Por un lado, el uso racional de los antihelmínticos debe basarse en estrategias de refugios como los tratamientos dirigidos (TT) o los tratamientos selectivos dirigidos (TST), que implican solo el tratamiento de rebaños o animales que lo requieren por razones clínicas o económicas (19-21). Además, el uso racional de medicamentos comerciales puede referirse a la combinación o rotación de antihelmínticos de diferentes clases químicas para evitar el uso excesivo de un solo medicamento (5, 7). Por otro lado, el control integrado implica la incorporación de diversas estrategias alternativas en la práctica, como la selección genética de ovejas naturalmente resistentes a los GIN, el manejo de pastos, la manipulación dietética, el desarrollo de vacunas, el control biológico (uso directo de hongos nematófagos, bacterias y nematodos depredadores o uso indirecto de lombrices de tierra o escarabajos peloteros), o el uso de antihelmínticos de origen vegetal (taninos condensados, varios extractos, o aceites esenciales) (6, 15, 19, 22, 23).

Como mezclas aromáticas, complejas y concentradas de compuestos volátiles no polares, los aceites esenciales (OE) pertenecen al grupo de metabolitos secundarios de las plantas que son responsables de permitir que las plantas sean competitivas en su propio entorno (24, 25). Por lo tanto, estas mezclas contienen varios compuestos como terpenos, terpenoides y fenilpropanoides que pueden usarse para diversos fines farmacológicos (26, 27). Los AE y sus compuestos se pueden obtener de las plantas mediante diversos métodos de extracción y, junto con sus extractos, se utilizan cada vez más en medicina veterinaria en los últimos tiempos. Entre otros, las indicaciones para su aplicación incluyen el uso como coccidiostáticos para aumentar la inmunidad y mejorar el rendimiento de las aves de corral, para prevenir la diarrea en lechones (debido a sus propiedades antimicrobianas), como suplementación dietética de peces, para usar contra Varroa destructor en apicultura o contra Malassezia pachydermatis y garrapatas en mascotas, etc. (28–31). En rumiantes, los posibles beneficios de la OE, entre otros, incluyen la mejora de la fermentación y digestión ruminal y la reducción de la metanogénesis y la excreción de nitrógeno (29). Además, diversos estudios han demostrado la eficacia de las OE frente a los GIN en ovejas. La lista es amplia e incluye orégano, tomillo, cilantro, árbol de té y lavanda, así como varias especies de hierba de limón, eucalipto, lippia, menta, etc. (32, 33).

La menta (Mentha x piperita L.) representa una hierba aromática y medicinal bien conocida derivada del cruce entre la menta verde (Mentha spicata L.) y la menta de agua (Mentha aquatica L.). Pertenece a la familia Lamiaceae y es originaria de la región mediterránea, pero ahora se cultiva en varias partes del mundo (34). La menta es una de las especies vegetales más importantes en las industrias farmacéutica y cosmética, cuya OE es ampliamente producida y utilizada. Muchas propiedades farmacológicas de la menta se han demostrado previamente e incluyen efectos analgésicos, antivirales, antibacterianos, antifúngicos y antiparasitarios (35, 36). Además, el efecto de M. piperita EO contra los GIN de ovejas también se demostró en varios estudios, por lo que mostró resultados prometedores contra diferentes etapas del parásito (37-39). Sin embargo, hasta ahora solo se ha demostrado la eficacia en condiciones de laboratorio, lo que requiere la confirmación de estos resultados en ensayos de campo. Por lo tanto, junto con in vitro, el objetivo del presente estudio fue examinar el efecto in vivo de M. piperita EO contra GIN de ovejas, así como evaluar la seguridad de su uso en los huéspedes.

2. Materiales y métodos

2.1. Análisis químicos

Mentha piperita La OE se obtuvo del Instituto de Cultivos de Campo y Hortalizas, Novi Sad, Serbia, por lo que la composición química (caracterización cualitativa y semicuantitativa) de la OE probada se determinó mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) en el Departamento de Química, Bioquímica y Protección del Medio Ambiente, Facultad de Ciencias, Universidad de Novi Sad, Serbia. Los parámetros exactos relativos a las condiciones técnicas para el análisis se describen en Knežević et al. (40) y Štrbac et al. (41) como sigue: volumen de inyección de EO 1 μL; temperatura del inyector 250°C; relación de división 1:10; gas portador helio; caudal: 1 mL/min; columna capilar: HP-5 (30 m × 0,25 mm, 0,25 μm); programa de temperatura 50–270°C; temperatura de la fuente de iones 230°C; energía del electrón 70 eV; temperatura cuadrupolo 150°C. Los compuestos se identificaron mediante la comparación de espectros de masas con bibliotecas de datos (Wiley Registry of Mass Spectral Data, 7th ed., y NIST / EPA / NIH Mass Spectral Library 05) y se confirmaron por comparación con índices de retención aritmética (IA) con datos de literatura (42). El gasóleo, que contiene n-alcanos C8-C28, se utilizó como estándar para la determinación de los índices de retención. Las cantidades relativas de los componentes, expresadas en porcentajes, se calcularon mediante el procedimiento de normalización de acuerdo con el área pico en el cromatograma iónico total.

2.2. Ensayo in vitro–ensayo de eclosión de huevos

Los análisis restantes se realizaron en el Centro Regional de Monitoreo de Parasitosis (CREMOPAR) ubicado en Eboli (SA), Italia, en 2021. Para el examen in vitro del potencial antihelmíntico de M. piperita EO, se eligió la prueba de eclosión de huevos (EHT). Los huevos de EST se recolectaron de muestras fecales tomadas directamente de la ampolla rectal de ovejas (n = 40) con infección natural-mixta, y se procesaron dentro de las 2 h posteriores a la recolección por el método de recuperación (43). Para separar los huevos de las heces, las muestras primero se agruparon, homogeneizaron y filtraron bajo agua corriente a través de mallas de diferentes tamaños (1 mm, 250 μm, 212 μm y 38 μm). Los huevos de GIN que se retuvieron en la malla más pequeña se lavaron con agua destilada y se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 minutos, después de lo cual se desechó el sobrenadante. Luego, la centrifugación se realizó utilizando una solución de azúcar al 40% para flotar los huevos, que luego se aislaron en nuevos tubos y se mezclaron con agua destilada. Finalmente, se realizaron algunas centrifugaciones más para retirar los pellets y obtener una solución acuosa que contenía huevos GIN.

Similar a nuestro estudio anterior (41), el EHT se realizó a ocho concentraciones diferentes (50, 12.5, 3.125, 0.781, 0.195, 0.049, 0.025 y 0.0125 mg / ml) de la EO probada obtenida por la dilución. Para ello, se utilizaron placas de 24 pocillos en las que cada concentración de EO se emulsionó con Tween 3% al 80%. Se agregó una solución acuosa (40 mL) que contenía aproximadamente 150 huevos GIN a cada pozo, que luego se completó con agua destilada para alcanzar un volumen final de 0.5 mL en los pozos. El control positivo fue tiabendazol en las dos concentraciones más bajas utilizadas para EO, y los controles negativos fueron 3% Tween 80 en la cantidad utilizada para la emulsión, así como agua destilada. Tras un período de incubación de 48 h a 27 °C, los huevos GIN y la primera fase eclosionada (L₁) las larvas se contaron bajo un microscopio invertido y se calculó la inhibición de la incubabilidad. El experimento se realizó en tres réplicas, y los valores obtenidos se expresaron como media aritmética ± desviación estándar.

2.3. Ensayo in vivo: ensayo de reducción del recuento fecal de huevos

El ensayo in vivo se realizó en dos granjas diferentes en el sur de Italia (región de Campania), donde la prevalencia de GIN es alta (3). En la granja 1, los animales estaban en libertad, y en la granja 2, los animales se mantuvieron en cajas durante el tratamiento. Se utilizaron ovejas con infección natural-mixta y diferentes cargas de lombrices, principalmente la raza lechera mixta Lacaune/Bagnolese, homogénea en cuanto a edad (2 años ±0,5) y época de pastoreo, con un peso corporal promedio (p.v.) de 50 kg ± 5. Los animales probados fueron alimentados con pastos y forraje (cebada y granos de maíz), y la dieta no se modificó durante el experimento. Ninguno de los tratamientos comerciales se aplicó al menos 6 meses antes del ensayo, y los animales ayunaron y permanecieron en ayunas hasta 2 h después de la administración de OE. En ambas granjas estudiadas, las ovejas se dividieron en tres grupos de tratamiento diferentes:

G1: 150 mg/kg de M. piperita EO (n = 12 animales/grupo/granja).

G2: 3,8 mg/kg de albendazol, control positivo (n = 12 animales/grupo/granja).

G3: 50 mL de aceite de girasol por animal, control negativo (n = 12 animales/grupo/granja).

La formulación de AE se preparó diluyendo M. piperita EO en aceite de girasol (1,4.5) para evitar el efecto del aceite puro sobre las membranas mucosas del tracto gastrointestinal. En un intento de garantizar que el mayor número posible de ingredientes activos de AE lleguen a los sitios objetivo (abomaso e intestino), la formulación (así como los controles) se aplicaron directamente en el rumen de los animales. Las muestras fecales individuales se recogieron por vía rectal antes del tratamiento (D0) y 7 y 14 días después del tratamiento (D7 y D14) y se almacenaron a 4 ° C antes del procesamiento. Las muestras recogidas se analizaron mediante la novedosa técnica Mini-FLOTAC (44) con un límite de detección de cinco huevos por gramo (EPG) de heces, utilizando una solución de flotación de cloruro de sodio (gravedad específica = 1,200). Los porcentajes de reducción de EPG se evaluaron en D7 y D14 mediante el cálculo de medias dentro de cada grupo, por lo que los resultados finales para cada grupo se presentaron como medias aritméticas de las dos granjas examinadas.

2.4. Coprocultura

El estudio de coprocultura se realizó de acuerdo con el protocolo desarrollado por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación del Reino Unido (45) con el fin de identificar los géneros de GIN en las granjas muestreadas y los cambios en su población después del tratamiento. Antes del almacenamiento a 4 ° C, se recolectó una cantidad igual de heces de cada muestra para formar un grupo formado para la prueba in vivo (M. piperita EO, albendazol y aceite de girasol) en diferentes puntos de tiempo (D0, D7 y D14). Las larvas desarrolladas en la tercera etapa (L₃) fueron identificados a partir de las claves morfológicas propuestas por van Wyk y Mayhew (46). La identificación y porcentaje de cada género de nematodos se realizó en 100 L₃, por lo que se identificaron todas las larvas si una muestra contenía 100 L o menos₃. De esta manera, el porcentaje de cada género podría determinarse a partir del número total de larvas identificadas (41).

2.5. Estudios de toxicidad

Todos los animales tratados fueron observados clínicamente por la presencia de posibles efectos adversos, con especial atención a su alimentación, defecación y comportamiento. Además, se recogieron muestras de sangre de la vena yugular en D0 y D14 para evaluar los efectos de la OE utilizada sobre los parámetros sanguíneos. Para los parámetros hematológicos, las muestras de sangre se recogieron en tubos de vacío que contenían EDTA y se procesaron poco después (dentro de 2-4 h), mientras que, para los parámetros bioquímicos, la sangre se recogió en tubos de vacío sin coagulante y posteriormente se analizó. Para este último, se prestó especial atención a la urea, creatinina y AST y GGT, que representan parámetros de función renal y hepática, respectivamente.

2.6. Análisis estadísticos

La inhibición de la incubabilidad (IH) en el EHT se calculó utilizando la siguiente fórmula propuesta por Coles et al. (47) y Pinto et al. (22):

IH (%) = número de huevos/(número de huevos + número de larvas L1) × 100.

Para la comparación mutua del efecto ovicida de diferentes concentraciones, así como con los controles, se realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de Tukey post hoc con un valor de p umbral de 0,05. Se utilizó regresión no lineal/distribución logarítmica para evaluar la presencia de un efecto dependiente de la dosis y calcular la concentración inhibitoria semimáxima (IC₅₀) (48).

En el FECRT, la reducción de la EPG media en cada grupo de tratamiento en cada punto temporal se calculó utilizando la siguiente fórmula (48, 49):

FECR (%) = (1 − (T₂/t₁ × C₁/C₂)) × 100.

En esta fórmula, T₂ representa la EPG después del tratamiento (D7 o D14); T₁ representa la EPG antes del tratamiento (D0), C₁ representa la EPG antes del tratamiento en el grupo control negativo y C₂ representa la EPG después del tratamiento (D7 o D14) en el grupo control negativo. Los valores obtenidos se compararon utilizando el ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey para evaluar las diferencias en el efecto dentro de un grupo y ubicación para diferentes días, así como dentro del mismo día y ubicación para diferentes grupos (valor del umbral p de 0,05).

Finalmente, para el análisis de los resultados de los análisis hematológicos y bioquímicos de sangre, también se realizó un ANOVA bidireccional. Para la comparación de los valores en el mismo grupo en D0 y D14 después del tratamiento, se utilizó la prueba de Sidak post hoc (p < 0,05), mientras que para la comparación de los valores obtenidos para diferentes grupos en el mismo día, se utilizó la prueba de Tukey post hoc (p < 0,05).

3. Resultados

3.1. Análisis químicos

Los análisis químicos revelaron una composición compleja de M. piperita EO con un total de 31 compuestos diferentes, de los cuales se identificaron 27 (Gráfico 1; Tabla 1). Los compuestos pertenecen a diferentes clases químicas, donde predominaron los monoterpenos: alcohol (mentol, 32,6%), cetonas (mentona, 22,0%; isomentona, 9,39%), éster (acetato de mentilo, 10,0%) y éter (eucaliptol, 5,22%) (Gráfico 1).

3.2. Ensayo in vitro–ensayo de eclosión de huevos

En el ensayo in vitro, M. piperita EO mostró actividad ovicida con inhibición de la incubabilidad que varió de 20,0 a 90,3% dependiendo de la concentración utilizada (Tabla 2). La concentración más alta mostró actividad similar con tiabendazol en ambas concentraciones probadas (p > 0,05), mientras que todas las concentraciones de EO probadas mostraron una actividad significativamente mayor que los controles negativos (p < 0,05). La R calculada² fue 0,96, lo que sugiere una actividad dosisdependiente con un CI determinado₅₀ valor de 0,43 mg/ml (Gráfico 2).

3.3. Prueba in vivo: prueba de reducción del recuento fecal de huevos

Los resultados del ensayo in vivo también mostraron el potencial antihelmíntico de M. piperita EO con una eficacia media del 26,86% (Día 7) y del 46,04% (Día 14) (Tabla 3). El aceite aplicado redujo significativamente el número de EPG en comparación con un valor obtenido antes del tratamiento (p < 0,05) en la granja 2, así como en total. En general, el efecto de la OE fue mejor en la granja 2 (gráfico 3) y alcanzó una eficacia del 33,63 y 63,35% en los días 7 y 14, respectivamente. Sin embargo, los valores de EPG en dos fincas diferentes no fueron significativamente diferentes (p > 0,05) en el grupo de M. piperita, en contraste con los grupos control donde las EPG fueron significativamente mayores en la granja 1 (p < 0,05).

3.4. Estudios de toxicidad

No se observaron efectos secundarios durante la observación clínica de los animales probados en los días 7 y 14 después del tratamiento. Del mismo modo, los valores de los parámetros hematológicos no cambiaron significativamente (p > 0,05) después de la administración de OE (Tabla Suplementaria S1). En los análisis bioquímicos de sangre, los valores de urea y creatinina también fueron similares en el día 14 en comparación con el día 0, mientras que las enzimas hepáticas mostraron una actividad significativamente menor después del tratamiento con M. piperita EO y albendazol (Tabla 4).

3.5. Coprocultura

Como se muestra en las Tablas 5, 6, se identificaron cuatro géneros de GIN de ovejas en proporciones variables en las dos granjas examinadas: Trichostrongylus, Teladorsagia, Haemonchus y Chabertia. En total, su representación antes del tratamiento fue de 43.67, 39, 11 y 6.33% en la Granja 1 y 44.33, 43.67, 10 y 2% en la Granja 2. Estos porcentajes no cambiaron significativamente después del tratamiento en ninguno de los grupos probados (p > 0,05).

4. Discusión

El problema urgente asociado con el desarrollo y la propagación de AR en GIN de ovejas requiere la búsqueda activa de estrategias alternativas, por lo que los antihelmínticos botánicos se consideran una de las opciones más prometedoras (50). Sin embargo, encontrar la formulación vegetal más adecuada entre el gran número de especies, tanto desde el punto de vista de la eficacia y la seguridad, como desde el punto de vista del precio, es una tarea difícil. Por lo tanto, las OE y los extractos de un gran número de plantas se han probado hasta ahora en la eficacia contra los GIN de oveja, como se discutió anteriormente (32, 33). Como se puede observar, la mayoría de estos estudios se refieren a pruebas in vitro. Aunque estas pruebas son apropiadas para la evaluación inicial del potencial antihelmíntico debido a su velocidad, reproducibilidad, fácil aplicación, ausencia de animales y precio (48), las pruebas in vivo y la evaluación de la seguridad también son partes cruciales del proceso de desarrollo de un nuevo fármaco antihelmíntico y son necesarias antes de que la formulación se introduzca en la práctica (51). La elección de los ensayos también es importante, ya que el EHT y el FECRT se recomiendan debido a su precisión y fiabilidad. De hecho, estas pruebas son las más utilizadas para tales estudios (23, 52).

Teniendo en cuenta el número de estudios realizados hasta el momento y sus resultados, la OE de M. piperita puede considerarse uno de los candidatos potenciales para el desarrollo de un nuevo agente antihelmíntico. Así, en un estudio de Katiki et al. (37), mostró actividad significativa contra Haemonchus contortus en el EHT con un CI obtenido₅₀ valor de 0,26 mg/ml. Junto con la actividad ovicida, la OE también mostró un efecto sobre el desarrollo larvario y la alimentación con CI₅₀ valores de 0,26 y 0,07 mg/ml, respectivamente. A continuación, un estudio de Chagas et al. (38) ha demostrado ovicida moderada (CI₅₀ = 1,44 mg/ml) pero larvicida alto (CI₅₀ = 0,10 mg/mL) actividad de la OE antes mencionada, también contra H. contortus. En nuestro último estudio (39), M. piperita EO mostró una fuerte dosis-dependiente (R² = 0,98) actividad contra una mezcla de géneros GIN de ovejas (Hemonchus, Trichostrongylus, Teladorsagia, y Chabertia) con una inhibición de la incubabilidad de huevos que varía de 72,5 a 99,8% (IC₅₀ = 0,28 mg/ml) en el rango de concentración de 0,049–50 mg/ml. Desde esa perspectiva, los resultados del EHT en el presente estudio mostraron un menor efecto ovicida de M. piperita EO, lo que puede atribuirse al uso de diferentes muestras de EO en comparación con ese estudio. Además, en el presente estudio, utilizamos un método diferente para obtener las concentraciones (método de dilución en comparación con micropipetas en el último estudio).

En el FECRT, la formulación ensayada (EO diluido en aceite de girasol) exhibió una actividad antihelmíntica del 46,04% en total el día 14 a la dosis probada de 150 mg/kg (Tabla 3). Al igual que en nuestro estudio realizado con orégano EO (41), la eficacia fue mejor en la Granja 2 en comparación con la Granja 1 (63,35 y 28,73%, respectivamente, en D14) (Gráfico 3), lo que puede explicarse por las diferencias en la cría de animales. Es decir, en la segunda granja, las ovejas se mantuvieron en cajas durante el tratamiento, lo que facilitó la manipulación de los animales y la aplicación de formulaciones. En contraste, en la primera granja, las ovejas se mantuvieron completamente en libertad. Otros factores, como las diferencias en la alimentación (debido a las diferencias en la cría de animales) y, en consecuencia, la composición y el volumen del contenido ruminal, también pueden afectar los resultados. Por otro lado, el albendazol mostró un alto efecto (>95%) en ambas granjas en los días 7 y 14, lo que indica que no se desarrolló resistencia a los antihelmínticos en las granjas probadas. La menor eficacia de la muestra analizada en comparación con el control positivo puede explicarse por las interacciones de fitoquímicos a lo largo del tracto gastrointestinal y, por lo tanto, su inactivación parcial y su biodisponibilidad limitada consecutiva (29). A continuación, los altos valores de desviación estándar de EPG en ambas granjas en todos los grupos de tratamiento sugieren una gran variación en el grado de carga parasitaria de los animales individuales. Esta suele ser una característica de los GIN, donde el mayor número de parásitos se acumula en un número menor de animales en cierto rebaño (3). Por otro lado, esto sugiere la importancia de las estrategias de TST durante los tratamientos (19-21).

De acuerdo con los análisis GC-MS, el mentol y la mentona fueron los principales responsables del efecto antihelmíntico mostrado, ya que sus representaciones porcentuales fueron de 32,6 y 22,0%, respectivamente. De hecho, estos dos compuestos se consideran los más importantes para diversas propiedades farmacológicas de M. piperita EO y su amplio uso (35). Sin embargo, el mentol puro no logró reducir la EPG de H. contortus durante las pruebas in vivo. En contraste, toda la OE de M. arvensis, cuyo componente principal fue el mentol (86,7%), mostró una eficacia de aproximadamente el 50% en los días 1, 14 y 21 (38). En otros estudios similares, los OE completos también fueron generalmente más efectivos que sus componentes principales aislados, como se muestra para Croton Zehtneri – anetol (53) y Thymus vulgaris-timol (54). Esto sugiere la importancia de todos los compuestos de EO para su actividad, potencialmente debido a su efecto sinérgico. La ausencia de un efecto del mentol puro en la investigación mencionada se explica por su limitada biodisponibilidad y por el hecho de que el mentol se excreta en forma de glucurónidos a través de la orina (38).

En comparación con la composición de M. piperita EO en nuestro estudio previo (39), se pueden observar diferencias en los compuestos presentes y sus porcentajes. Es decir, los principales compuestos de esa muestra fueron piperiota (25,4%) y trans-dihidrocarvona (14,6%). En otros estudios mencionados, la composición química de M. piperita EO corresponde más a la muestra del presente estudio. Así, el mentol (42,5%) seguido de la mentona (27,4%) fueron los principales compuestos de la muestra en un estudio de Katiki et al. (37), y el mentol (30,5%) también fue el compuesto principal de la muestra en un estudio de Chagas et al. (38). Esto sugiere que la composición de la OE puede variar considerablemente, incluso entre las obtenidas de la misma especie vegetal. Desde ese aspecto, pueden estar involucrados diversos factores como la edad y parte de la planta, el origen geográfico, la precipitación, la luz y las propiedades del suelo que se refieren al pH, la estructura y la salinidad, así como la presencia de diversos organismos y microorganismos en un entorno vegetal. Además, los métodos utilizados para la extracción de aceites, los productores de los que se obtienen los aceites y la forma en que se almacenaron antes de su uso también pueden afectar la composición química (55, 56). En consecuencia, estos factores también pueden conducir a diferencias menores o mayores en la eficacia, como se puede observar si se comparan los resultados de los estudios mencionados, incluido el presente. La pregunta que se plantea es hasta qué punto estas variaciones pueden obstaculizar el desarrollo de la preparación comercial, y si las formas de estandarizar la composición de ciertas OE deberían ser un tema de estudios adicionales.

A pesar de su creciente popularidad, uno de los principales problemas asociados con el uso más amplio de OE en la práctica parece ser la falta de estudios de toxicidad (33). Los posibles efectos tóxicos y secundarios de los OE y sus componentes generalmente se prueban en animales de experimentación como roedores, mientras que las pruebas de toxicidad aguda realizadas hasta ahora en ratas mostraron que la mayoría de los OE tienen una LD₅₀ de 1 a 20 g/kg, lo que indica su baja toxicidad (57). Sin embargo, rara vez se realizan estudios que evalúan los efectos sobre el huésped. En el presente estudio, los resultados de las pruebas preliminares de toxicidad mostraron la ausencia de efectos secundarios y tóxicos de M. piperita EO en ovejas, es decir, su comportamiento, parámetros hematológicos, así como funciones renales y hepáticas. Esto sugiere la seguridad del uso de la formulación aplicada en ovejas, al menos cuando se trata de efectos a corto plazo. Los mismos resultados se obtuvieron para la OE de hierba limón (Cymbopogon schoenanthus L.) aplicada a ovejas (180 y 360 mg/kg, p.o.), y para la combinación encapsulada de anetol y carvona aplicada a corderos (20 y 50 mg/kg, p.o.), con la ausencia de efectos tóxicos sobre el comportamiento animal, así como las funciones hepáticas y renales, sugiriendo su seguridad (58, 59).

En un estudio de Chagas et al. (38), no se observaron síntomas de toxicidad en ovejas tratadas con M. arvensis EO. Esto y los resultados del presente estudio pueden considerarse esperados, ya que el compuesto principal de estos dos OE, el mentol, tiene una toxicidad oral aguda muy baja (LD₅₀ > 2000 mg/kg p.v.) y, por lo tanto, es generalmente reconocido como seguro por la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos). Además, la FDA ha aprobado el uso de mentol en los alimentos (38, 60). Según el informe de evaluación de Mentha x piperita L., folium y aetheroleum (61) pueden utilizarse con seguridad en humanos a las dosis recomendadas (oral, cutánea e inhalación) para el tratamiento de diversos trastornos gastrointestinales o el alivio sintomático de dolores de cabeza leves de tipo tensional. Sin embargo, aunque las especies de Mentha se consideran seguras, se debe prestar especial atención al contenido de pulegona y mentofurano en la formulación debido a su hepatotoxicidad reportada (62, 63). Así, según la Declaración pública sobre el uso de medicamentos a base de plantas que contienen pulegona y mentofurano (64), la ingesta de su combinación en 37,5 mg/persona/día en seres humanos se considera aceptable para los medicamentos a base de plantas, que se establece como límite para una exposición a lo largo de toda la vida. Dichos estudios deben facilitarse para los animales, incluidas las ovejas.

Los resultados del examen de coprocultivo mostraron la presencia de cuatro géneros de GIN antes del tratamiento en las granjas analizadas: Trichostrongylus (44%), Teladorsagia (41,33%), Haemonchus (10,5%) y Chabertia (4,17%). Dado que su representación porcentual no cambió significativamente (p > 0,05) después del tratamiento, se puede concluir que el tratamiento con M. piperita EO no es específico para un solo género. Sin embargo, los resultados de algunos otros estudios mostraron una mayor actividad de AE contra H. contortus en comparación con Trichostrongylus spp. después de la administración oral de las formulaciones (65-67), lo que sugiere que puede haber diferencias en la sensibilidad de los OE dentro de los géneros GIN (por ejemplo, debido a su posición en el tracto gastrointestinal). De todos modos, el mecanismo de actividad nematicida de los compuestos de M. piperita EO aún no está completamente dilucidado. En un estudio de Choudhary et al. (68), se demostró que el mentol potencia las respuestas de acetilcolina y levamisol en el receptor sensible al levamisol pero no a la nicotina. El mismo estudio también mostró que el mentol puede potenciar significativamente la contracción de las tiras de músculo somático Ascaris suum en cada concentración de acetilcolina. Un estudio de Khan et al. (69) mostró que el metanol y el extracto de M. arvensis causan un alto efecto apoptótico en los músculos, las gónadas y el útero (huevos) del nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans, que se utilizó como organismo modelo. Los resultados también mostraron que los genes de estrés (gst-4 y hsp-16.2) estaban altamente expresados en los nematodos afectados en comparación con C. elegans normales.

Aunque el aceite aplicado redujo significativamente el número de EPG después del tratamiento, siendo la eficacia in vivo alcanzada una de las más altas obtenidas para EO contra GIN (32, 33), sigue siendo insuficiente para su uso independiente. Sin embargo, los estudios realizados hasta ahora mostraron que ninguno de los posibles métodos de control antes mencionados parece ser sostenible cuando se aplica solo (6). Por lo tanto, como se discutió anteriormente, generalmente se acepta que una combinación de diferentes estrategias en forma de manejo integrado de parásitos es la única solución sostenible para el control de parásitos a largo plazo (6, 16-19, 70). Un ejemplo son los resultados obtenidos en un estudio mencionado por Choudhary et al. (68), donde se probaron las propiedades moduladoras alostéricas positivas del mentol, que podrían usarse en terapia combinada con antihelmínticos colinérgicos.

De todo lo anterior, los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren que M. piperita EO puede desempeñar un papel valioso en un enfoque integrado para el control de parásitos. En general, el uso de antihelmínticos botánicos ofrece muchas ventajas, como su rica composición química con una gran cantidad de compuestos pertenecientes a diferentes grupos químicos (menor susceptibilidad al desarrollo de resistencia), su origen natural (menor cantidad de residuos en los productos animales y el medio ambiente), precio adecuado, etc. (13, 14, 48, 50). Además, la eficacia in vivo de M. piperita EO podría mejorarse aún más con el uso de una técnica de encapsulación que pueda proteger sus ingredientes activos de la degradación y, por lo tanto, permitir su mayor biodisponibilidad (71, 72). Por otro lado, también se pueden lograr mejores resultados aumentando la dosis o utilizando múltiples aplicaciones durante varios días consecutivos en lugar de una sola administración, aunque el uso de una dosis más alta o administración múltiple también debe evaluarse desde el punto de vista tóxico. La eficacia también puede mejorarse, así como controlar la liberación habilitada por otras formas de aplicación, como los bloques de lamido que contienen compuestos de origen vegetal, y pueden proporcionar un uso a largo plazo (73).

5. Conclusión

El desarrollo y la propagación de la resistencia a los antihelmínticos en los nematodos requieren una búsqueda urgente de alternativas. Los resultados del presente estudio sugieren que M. piperita EO es adecuado para su uso contra GIN en ovejas en base a las pruebas de eficacia y toxicidad preliminares realizadas. Por lo tanto, en combinación con otras estrategias (uso racional de antihelmínticos u otras alternativas), la formulación probada podría desempeñar un papel valioso en un control integrado y respetuoso con el medio ambiente de estos parásitos. Se deben realizar estudios adicionales para confirmar la seguridad después del uso a largo plazo del aceite de menta en la práctica para lograr una eficacia aún mayor en los ensayos de campo, así como para probar su eficacia contra GIN resistentes a los medicamentos comerciales.

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo / Material complementario, las consultas adicionales pueden dirigirse a los autores correspondientes.

Declaración ética

El estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Nápoles (PG/2021/0130480, 16 de diciembre de 2021). Los estudios se realizaron de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones del autor

FŠ: conceptualización, metodología, análisis formal, investigación, curación de datos y redacción de borradores originales. SK: conceptualización, recursos y revisión y edición de la escritura. DS: conceptualización, validación y supervisión. RR: conceptualización, metodología y recursos. NS: investigación, recursos y revisión y edición de escritos. DO: investigación y recursos. LR: metodología, validación, revisión y edición de redacción, y supervisión. CE: metodología e investigación. MM: metodología y validación. GC: validación y supervisión. AB: conceptualización, metodología, investigación, curación de datos y revisión y edición de escritos. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión presentada.

Financiación

Esta investigación fue cofundada por el Ministerio de Educación, Ciencia y Desarrollo Tecnológico de la República de Serbia, rescripto No. 451-03-1183/2021-14.

Reconocimientos

Agradecemos profundamente a Mario Parrilla de CREMOPAR, Eboli (SA), Italia, por el apoyo técnico en el laboratorio, así como a Katarina Hočevar del Instituto de Investigación Biológica, Siniša Stanković, Universidad de Belgrado, Serbia, por el apoyo técnico durante la producción del manuscrito.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2023.1232570/full#supplementary-material

Referencias