Introducción

La peste de los pequeños rumiantes (PPR) es una de las enfermedades víricas transfronterizas de declaración obligatoria de pequeños rumiantes domésticos y silvestres de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA). Cabe destacar que, en caprino y ovino, se asocia a una elevada morbimortalidad (1). La mortalidad puede llegar al 100%, y se estima que las pérdidas económicas causadas por la peste de pequeños rumiantes fueron de aproximadamente USD $2,9 millones por año durante el período 2012-2017 (2, 3). Clínicamente, la enfermedad se caracteriza por pirexia, estomatitis erosiva, neumonía y diarrea (4, 5). Es importante destacar que la peste de pequeños rumiantes a menudo causa momificación fetal, abortos al final del embarazo o el nacimiento de corderos muertos o débiles que mueren a los pocos días (6-8). Desde el primer informe de PPR realizado por Gargadennec y Lalanne en Côte d’Ivoire en 1942, la enfermedad se ha propagado de manera tan alarmante que su distribución geográfica se ha expandido a través de más de 70 países de África, Oriente Medio y Próximo, Asia meridional y China (9-11). Se han notificado brotes de peste de pequeños rumiantes en Georgia (2016) y Bulgaria (2018), lo que supone una grave amenaza para Europa (12). En la actualidad, alrededor del 80% de las poblaciones mundiales de ovinos y caprinos están amenazadas por la peste de pequeños rumiantes (11, 13). Como una de las enfermedades infecciosas más extendidas y devastadoras, el enorme impacto de la peste de pequeños rumiantes en la producción de pequeños rumiantes ha llevado a la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y a la OMSA a proponer e iniciar la Estrategia Mundial de Control y Erradicación de la Peste de Pequeños rumiantes (PMR GCES), con el propósito de erradicar la enfermedad para 2030 (14).

El virus de la peste de los pequeños rumiantes (PPRV) es un ácido ribonucleico (ARN) envoltado con un genoma no segmentado de sentido negativo dentro del género Morbillivirus de la familia Paramyxoviridae (15). Está en el mismo grupo que el virus del sarampión (MeV), el virus de la peste bovina (RPV), el virus del moquillo canino (CDV), el virus del moquillo focino (PDV) y el morbillivirus del delfín (DMV) (15, 16). El genoma del PPRV tiene una longitud de 15.948 nucleótidos (16) y codifica seis proteínas estructurales en orden secuencial: la proteína de la nucleocápside (N), la proteína fosfofosfa (P), la proteína de la matriz (M), la proteína de fusión (F), la proteína de hemaglutinina (H) y la proteína grande (L). Al igual que con otros morbillivirus, el gen P del PPRV produce dos proteínas no estructurales, C y V (17). Basándose en las secuencias de genes N o F, el virus se ha dividido en cuatro linajes, aunque tiene un serotipo de señal (15, 16, 18). Tras la infección, el PPRV se localiza y se replica en las amígdalas y los ganglios linfáticos, causando linfocitolisis grave en los tejidos linfoides y una subsiguiente inmunodeficiencia hasta la depleción linfoide (19-21). La patogenia de la infección por el virus de la peste de pequeños rumiantes se caracteriza por la inducción de una inmunosupresión fuerte pero transitoria de las respuestas protectoras del huésped, lo que conduce a una mayor susceptibilidad a las infecciones oportunistas que afectan el resultado de la infección (19, 21–23). Por lo tanto, es particularmente importante prevenir la infección y la replicación del virus de la peste de pequeños rumiantes para un control exitoso de la enfermedad.

En la actualidad, no se ha aprobado ningún medicamento antiviral para su aplicación terapéutica en el control de la infección por el virus de la peste de pequeños rumiantes. La vacunación es el principal método disponible para la prevención y el control eficaces de la peste de pequeños rumiantes. La PPRV Nigeria75/1 (linaje II) y la PPRV Sungri 96 (linaje IV) son actualmente las vacunas vivas atenuadas más utilizadas, y su eficacia ha sido ampliamente probada y validada (13, 24–27). Sin embargo, estas vacunas vivas atenuadas son sensibles al calor en climas subtropicales y tienen altos costos de producción (13). Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar agentes antivirales seguros y eficaces contra el virus de la peste de pequeños rumiantes.

El carboplatino (cis-diammina-1,1-ciclobutano descarboxilato de platino [II]) es un agente quimioterapéutico a base de platino de segunda generación que se ha utilizado ampliamente en la clínica para tratar una variedad de neoplasias malignas en humanos (28-31) y se ha informado que es el derivado del platino más seguro para usar en el embarazo (31, 32). Después de la absorción celular, el carboplatino se une covalentemente a las nucleobases de ADN y se entrecruza con el ADN para formar una variedad de aductos de ADN e induce la apoptosis a través de la inhibición de la apoptosis de las células tumorales y otros mecanismos, lo que resulta en una respuesta inmune proinflamatoria y antitumoral (33, 34). Los estudios han demostrado la eficacia clínica del carboplatino en el tratamiento del osteosarcoma apendicular canino y los carcinomas de células escamosas orales y cutáneos felinos, validando que el carboplatino es un agente anticancerígeno útil para perros y gatos con tumores sólidos (28, 35, 36). Se ha sugerido que el compuesto carboplatino, que contiene platino, desempeña un papel en la estimulación de las respuestas inmunitarias contra los tumores (36, 37). Además, en el estudio de Chen et al., encontraron que el agente quimioterapéutico a base de platino puede modular la replicación viral en pacientes que reciben quimioterapia (38). Por lo tanto, es razonable explorar la influencia potencial del carboplatino en la infección de diversas enfermedades virales en humanos y animales.

La autofagia es una vía evolutivamente conservada para la degradación de orgánulos intracelulares innecesarios o disfuncionales, proteínas desplegadas o mal plegadas y microorganismos patógenos para mantener la homeostasis celular en respuesta a una variedad de tensiones (39, 40). Un gran número de evidencias han demostrado que la replicación del virus y la autofagia están interconectadas mecánicamente y que la autofagia desempeña un doble papel durante las infecciones virales (41). Cada vez más estudios han sugerido que existen interconexiones complicadas entre el proceso de replicación viral y la autofagia (42) y muchos virus han desarrollado una serie de estrategias para explotar la autofagia para su replicación (39, 41). Recientemente se ha demostrado que el agente quimioterapéutico a base de platino puede promover la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) mediante la inducción de la autofagia (38). Un número creciente de estudios ha demostrado que la PPRV puede secuestrar la autofagia para facilitar su replicación (8, 43-46). Sin embargo, aún no se han investigado los efectos del carboplatino en la replicación de morbillivirus y la asociación entre el carboplatino y la autofagia.

El objetivo de este estudio fue determinar el efecto del carboplatino sobre la replicación del VPPR in vitro e investigar sistemáticamente su mecanismo de acción. Nuestros datos aclararán los posibles mecanismos moleculares del carboplatino en la infección viral y podrían proporcionar más información sobre el desarrollo de nuevas estrategias prometedoras para el control de la infección aguda por el virus de la peste de pequeños rumiantes, así como para una posible aplicación a otros patógenos estrechamente relacionados genéticamente, como el MeV.

Materiales y métodos

Cultivo celular y propagación de virus

Las células de riñón de mono verde africano (Vero) (ATCC: CCL-81) se cultivaron en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco) suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (FBS, Gibco) y solución de penicilina-estreptomicina (100 U/mL y 100 μg/mL, respectivamente; Gibco) como monocapas en matraces o placas de cultivo celular a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% CO₂ en el aire.

La cepa vacunal atenuada del virus de la peste de pequeños rumiantes Nigeria 75/1 se obtuvo de la colección de cultivos de nuestro laboratorio. Se generó un stock viral infectando monocapas de células Vero. El PPRV se inoculó en células Vero a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y se cultivó en DMEM suplementado con FBS al 2% a 37 °C con CO al 5%₂ durante 6 días hasta que se observó un efecto citopático pronunciado (EPC) en aproximadamente el 80% de las células. Se recogieron los medios que contenían virus y las células se lisaron mediante dos ciclos de congelación y descongelación. El sobrenadante y el lisado celular se combinaron, se centrifugaron a 4500 g durante 10 min para eliminar los restos celulares, se filtraron (0,45 μm), se alícuotas y se almacenaron a -80 °C.

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad de los compuestos se evaluó mediante el ensayo CCK-8. Las monocapas de células Vero se sembraron en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Luego, el medio se reemplazó con 100 μL de medio de cultivo suplementado con diferentes concentraciones de carboplatino (0, 20, 40, 60, 80 o 100 μM; Selleck, S1215) e incubado durante 24 h a 37°C con 5% de CO₂. A continuación, se añadieron 10 μL de solución madre de CCK-8 a cada pocillo y se incubaron a 37 °C durante 2 h. Finalmente, se determinó la densidad óptica (DO) de los pocillos cuadruplicados a 450 nm utilizando un lector de microplacas ELISA (PerkinElmer, VICTOR Nivo^™, Estados Unidos).

Ensayo previo a la infección con carboplatino

Las monocapas de células Vero se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con carboplatino durante 24 h. El día de la infección, las células se infectaron con el virus de la peste de pequeños rumiantes (1 MOI) durante 1 h a 37 °C. Después de eso, las células se lavaron dos veces con PBS antes de ser tratadas con carboplatino disuelto en DMEM suplementado con FBS al 2%. Se establecieron seis concentraciones diferentes de carboplatino (0, 20, 40, 60, 80 o 100 μM) para determinar la dosis con el efecto más significativo sobre la replicación del virus de la peste de pequeños rumiantes. A las 48 h post-infección (hpi), se recolectó el sobrenadante de cultivos celulares infectados y se determinó el título viral mediante el ensayo TCID50, y se recolectaron células y se determinaron los niveles de ARNm viral en lisados celulares mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

Titulación viral in vitro

Para determinar los títulos de virus, las suspensiones de virus se prepararon mediante una dilución en serie de 10 veces de la reserva de virus, recolectada de células infectadas por PPRV e 100 μM de carboplatino pretratadas infectadas por PPRV, en DMEM sin suplementos. Las monocapas de células Vero se sembraron en una placa de 96 pocillos el día anterior a la valoración. Las células Vero se inocularon el día de la infección con 100 μL del sobrenadante durante 1 h a 37 °C. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS, antes de recubrirse con DMEM que contenía un 2% de FBS y se incubaron a 37 °C durante 6-7 días. Los títulos virales se evaluaron mediante el método de Reed y Muench (47) y se expresaron como una dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50% (TCID₅₀) /ml.

Microscopía electrónica de transmisión

Las células Vero tratadas o no tratadas con 100 μM de carboplatino se infectaron con PPRV Nigeria 75/1 (MOI 1) durante 48 h. Después de la infección durante 48 h, las células se rasparon y cosecharon por centrifugación a 10.000 rpm durante 5 min. Las células se fijaron en glutaraldehído al 2,5% durante la noche a 4 °C, se lavaron tres veces con PBS y luego se fijaron con tetróxido de osmio al 1% durante 3 h a 4 °C con agitación. Después de tres lavados con PBS, las muestras se deshidrataron en una serie de soluciones de etanol graduadas y se incrustaron en la resina plástica de Spurr. Las células se polimerizaron durante la noche a 70 °C en un horno de secado. Las secciones ultrafinas (70 nm) se prepararon utilizando un ultramicrótomo (Ultracut R, Leica, Alemania).

Western blot y anticuerpos

Las células tratadas o no tratadas con 100 μM de carboplatino se recolectaron y lavaron con PBS frío a las 48 h después de la infección por PPRV, luego se lisaron en tampón de lisis RIPA que contenía proteasa y tampón de lisis RIPA que contenía inhibidores de fosfatasa (50 mM Tris [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS; Número de catálogo Beyotime P0013B) suplementado con 1% 100 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo. Los extractos de células enteras se clarificaron por centrifugación a 16.000 rpm durante 10 min a 4°C. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (23,225; Thermo Scientific). Las muestras de proteínas se desnaturalizaron en un tampón de muestra equivalente a 2 × SDS-PAGE (S3401; Sigma-Aldrich) calentando durante 5 min a 95°C. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% y luego se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, ISEQ00010) a 200 mA durante 2 h. Las membranas se bloquearon con leche descremada en polvo al 5% en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST) durante 2 h a temperatura ambiente (RT) y luego se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Después de lavar tres veces con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa durante 1 h en RT. Los anticuerpos unidos se visualizaron utilizando el sustrato Clarity Western ECL (Bio-Rad). Se utilizó un anticuerpo monoclonal acoplado a peroxidasa de rábano picante de ratón específico para β-tubulina (Proteintech, 66,240-1-Ig) como control de carga. Las bandas se detectaron utilizando un GE Healthcare Amersham Imager 600 en el modo de exposición automática para garantizar que las bandas no estuvieran saturadas.

Los anticuerpos policlonales de conejo anti-STING (D1V5L; número de catálogo 50494S) y anti-LC3B (número de catálogo 2775 s) se adquirieron en Cell Signaling Technology. De Proteintech se obtuvieron anticuerpos monoclonales de ratón anti-β-tubulina (número de catálogo 66240-1-Ig), anticuerpos policlonales de conejo anti-XBP1 (número de catálogo 24864-1-AP), anti-EIF2S1 (número de catálogo 11170-1-AP) y anti-PERK (número de catálogo 24390-1-AP). Anticuerpos policlonales de conejo anti-ATF6 (número de catálogo ab37149), antifosfo-EIF2S1 (E90; Ser51; número de catálogo ab32157) eran de Abcam. El anticuerpo policlonal anti-fosfo-PERK de conejo (Thr981; número de catálogo sc-32577) procedía de Santa Cruz Biotechnology. El anticuerpo policlonal de conejo anti-ATG5 (número de catálogo NB110-53818) se obtuvo de Novus Biologicals. Los anticuerpos monoclonales de ratón contra la proteína N del virus de la peste peste peste se obtuvieron del Instituto de Investigación Veterinaria de Lanzhou de la Academia China de Ciencias Agrícolas.

PCR cuantitativa en tiempo real

Las células tratadas o no tratadas con 100 μM de carboplatino se recolectaron a las 48 h después de la infección por PPRV, y el ARN total se extrajo utilizando el RNeasy Plus Universal Mini Kit (número de catálogo Qiagen 73404) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADNc de primera cadena se sintetizó utilizando la mezcla maestra de síntesis de ADNc Maxima H Minus con dsDNasa (Thermo Scientific, M1682). Se utilizó PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 1.801.040) para realizar la PCR cuantitativa en tiempo real, y las condiciones de ciclo térmico se establecieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La vacuna viva atenuada PPRV Nigeria75/1 se utilizó como control positivo para la PCR en tiempo real. Los cebadores utilizados para la qPCR fueron los siguientes: PPRV forward, 5′-AGAGTTCAATATGTTRTTAGCCTCCAT-3′; PPRV inverso, 5′-TTCCCCARTCA CTCTYCTT TGT-3′; GAPDH delantero, 5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′; GAPDH reverso, 5′-TGAC GATCTTGAGGCTGTTG-3′.

Interferencia de ARN

Para construir vectores lentivirales de shRNA, se diseñaron shRNAs utilizando BLOCK-iTRNAi Designer (Invitrogen). Los shRNAs utilizados en este estudio fueron sintetizados por Sangon Biotech (Shanghai, China) y clonados en un vector de clonación pLKO.1-TRC, siguiendo un protocolo estándar. Las células Vero cultivadas en placas de cultivo celular de 6 pocillos se transfectaron con oligonucleótidos de interferencia de ARN utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias diana fueron las siguientes: STING, 5′- GCATTACAACCTGCTACG-3′ y ATG5, 5′-GCTTCGAGATGTGTGTGTGTGG-3′.

Empaquetamiento e infección de lentivirus

Para el lentivirus de empaquetamiento, se cotransfectaron 1,5 μg de plásmido de empaquetamiento psPAX2 (Addgene, 12.260), 1 μg de plásmido de envoltura pMD2.G (Addgene, 12.259) y 2 μg de plásmido pLKO.1 en 4 × 10⁶ Células T Lenti-X 293 utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 3.000 (Thermo, L3000015). El sobrenadante se recolectó a 36 hpi, se filtró y se almacenó a -80 °C. Las células Vero se incubaron con las partículas virales en presencia de 8 μg/mL de polibreno (Solarbio, H8761) durante 24 h y se trataron con 5 μg/mL de puromicina (Invitrogen, A1113803) durante 3 días. Los niveles de expresión de proteínas se determinaron mediante análisis de Western blot.

Análisis estadístico

Los datos se expresan como medias ± desviación estándar (DE). La significancia de la variabilidad entre los diferentes grupos de tratamiento se calculó mediante análisis de varianza de dos vías (ANOVA) utilizando el software GraphPad Prism (versión 6.0). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p < 0,05.

Resultados

El carboplatino inhibe la replicación del virus de la peste peste de pequeños rumiantes

Para examinar el efecto del carboplatino en la infección por el virus de la peste de pequeños rumiantes, las células Vero se trataron previamente con diferentes concentraciones de carboplatino durante 24 horas y posteriormente se infectaron con el virus de la peste de pequeños rumiantes. 48 h después de la infección, se determinaron los niveles de ARNm viral en lisados celulares mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los resultados mostraron que el pretratamiento con carboplatino dio lugar a una reducción dependiente de la dosis en la replicación del virus de la peste de pequeños rumiantes. Se observó una reducción significativa de los niveles de ARNm en las células infectadas por el virus de la peste de pequeños rumiantes y tratadas con carboplatino a una concentración de 40 μM. En particular, 100 μM de carboplatino condujeron a una reducción de aproximadamente el 70% en los niveles de ARNm viral en comparación con el control de vehículos DMEM de 0 μM (Figura 1A), lo que indica que se requiere una alta concentración de carboplatino para su efecto antiviral. La viabilidad celular no se vio afectada por el tratamiento con carboplatino solo (Figura 1B), lo que sugiere que la reducción de los niveles de ARNm viral no se debió a la citotoxicidad. El efecto inhibidor del carboplatino a 100 μM también se observó en el rendimiento del virus, ya que se observó una reducción evidente en el título viral en las células pretratadas en comparación con la de las células de control no tratadas a 48 hpi (Figura 1C). Además, de acuerdo con el TCID₅₀ resultados, los resultados de la transferencia de Western revelaron que la expresión de la proteína N viral fue significativamente menor en las células tratadas con carboplatino que en las células infectadas por el virus de la peste de pequeños rumiantes no tratadas (control solo del virus; Figura 1D). En conjunto, estos datos sugieren que el carboplatino es muy potente para suprimir la replicación del virus de la peste de pequeños rumiantes en las células Vero.

Figura 1. El carboplatino (100 μM) inhibe significativamente la replicación del PPRV en las células Vero. (A) Se midieron los niveles de ARNm de PPRV en varias concentraciones de células Vero tratadas con carboplatino e infectadas con PPRV (MOI = 1, 48 hpi) mediante qPCR. Los datos muestran las medias ± DE; n = 3; *p < 0,005; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. (B) Citotoxicidad de diferentes concentraciones de carboplatino. La viabilidad se normalizó a control no tratado. Los datos muestran las medias ± DE; n = 3; ns, no hay importancia. (C) Las células de control y (100 μM) pretratadas con carboplatino se infectaron con el virus de la peste de pequeños rumiantes (MOI = 1), y los títulos de virus se midieron mediante TCID₅₀ (48 hpi). Los datos muestran la media ± DE; n = 3; **p < 0,01. (D) Análisis de Western blot de la proteína N del virus del PPRV en células de tipo salvaje infectadas con PPRV y tratadas con carboplatino (MOI = 1,48 hpi). Se utilizó β-tubulina como control de carga.

El carboplatino inhibe la respuesta de la proteína desplegada mediada por PPRV

Debido a la limitada capacidad de codificación del genoma viral, los virus cooptan las proteínas nucleares del huésped para su replicación (48). Como factor de síntesis de proteínas, el orgánulo multifuncional del retículo endoplásmico (RE) se asocia con varias vías implicadas en la homeostasis celular y la supervivencia (49). Por lo tanto, examinamos el efecto del carboplatino sobre la homeostasis del RE. Los resultados del ensayo de microscopía electrónica de transmisión mostraron que la hinchazón morfológica y la dilatación del RE en las células Vero infectadas por el virus PPRV tratadas con carboplatino era más grave que la observada en las células infectadas por el virus del PPRV no tratadas (Figura 2A), lo que indica que el carboplatino podría mejorar eficazmente la alteración de la homeostasis del RE mediada por el virus del PPRV. El RE es la red de membranas celulares más grande y contiene la maquinaria de control de calidad para el plegamiento y la maduración de proteínas. Cuando se acumulan proteínas mal plegadas o mutantes, la perturbación de la homeostasis del RE puede causar estrés del RE (50), que posteriormente activa las vías de señalización de la respuesta de la proteína desplegada (UPR) conservadas evolutivamente para aliviar el estrés y que la célula pueda sobrevivir. Tres proteínas sensoras de estrés transmembrana del RE, la quinasa del RE similar a PKR (PERK), que activa el factor de transcripción 6 (ATF6) y la enzima 1 que requiere inositol (IRE1), controlan tres brazos de la vía de señalización UPR para resolver el estrés y mantener la homeostasis del RE (proteostasis) (51). Un estudio previo demostró que la infección por PPRV puede activar selectivamente la rama ATF6 de la UPR en células Vero (45). Para comprender los posibles mecanismos moleculares implicados en la actividad antiviral del carboplatino, analizamos el nivel de expresión de ATF6 activado, que está implicado en la transducción de señales celulares de la vía de señalización UPR. Los resultados de la Western blot revelaron que el nivel de ATF6 escindido en las células infectadas por el virus de la peste peste de pequeños rumiantes tratadas con carboplatino estaba significativamente regulado a la baja en comparación con el observado en las células no tratadas infectadas por el virus de la peste pérsrica en pequeños rumiantes (Figura 2B), lo que puede explicar parcialmente la gravedad de los cambios morfológicos del RE en las células infectadas por el virus de la peste pérsrica tratados con carboplatino.

Figura 2. El carboplatino altera la homeostasis del RE e inhibe la activación de ATF6 inducida por PPRV. (A) Detección por microscopía electrónica de transmisión de cambios morfológicos del RE. Las células Vero pretratadas con carboplatino a 100 μM o no tratadas se infectaron con PPRV a 1 MOI durante 48 h y se siguieron con tratamiento con TEM para observar la morfología del RE. (B) Detección por Western blot de los niveles de ATF6 escindido en células infectadas por PPRV (MOI = 1), tratadas con carboplatino (100 μM) y no tratadas a 48 hpi. Se utilizó β-tubulina como control de carga.

La regulación negativa de STING contribuye al efecto antiviral del carboplatino

La autofagia es un proceso de degradación intracelular conservado evolutivamente esencial para el mantenimiento de la homeostasis celular a través de la lisis catabólica de componentes citosólicos que de otro modo serían perjudiciales (43, 49, 52). La UPR y la autofagia son dos programas celulares diferentes que funcionan de forma independiente o se coordinan para mantener la homeostasis celular en respuesta a una amplia gama de tensiones. Un número creciente de estudios ha demostrado que el estrés en el RE puede iniciar la autofagia (53-55). La autofagia se asocia con la UPR al restringir la producción de proteínas o eliminar las proteínas mal plegadas (49). Teniendo en cuenta que la activación de ATF6 fue inhibida por el carboplatino durante la infección por el virus de la peste de pequeños rumiantes, razonamos que el carboplatino está implicado en la autofagia inducida por el virus de la peste de pequeños rumiantes. Para probar esta hipótesis, las células Vero se trataron con 100 μM de carboplatino durante 24 h antes de la infección por PPRV, y se realizó Western blot para determinar la conversión de LC3-I a LC3-II, que actualmente se considera un indicador preciso de la actividad autofágica (56). Como se muestra en la Figura 3A, en comparación con las células infectadas no tratadas, la intensidad de la banda de LC3-II en las células Vero tratadas con carboplatino e infectadas por el virus PPRV disminuyó drásticamente a los 48 hpi, lo que indica que el carboplatino podría inhibir la inducción de la autofagia mediada por el virus de la peste pérsica en las células Vero. Nuestros estudios previos demostraron que el PPRV induce la autofagia para facilitar la replicación viral mediante la regulación positiva de STING (45). Para dilucidar aún más los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos antivirales del carboplatino, se evaluaron los niveles de expresión de STING mediante Western blot. Los resultados mostraron que la cantidad de proteína STING se redujo significativamente en las células infectadas por el virus de la peste peste de pequeños rumiantes y tratadas con carboplatino que en las células infectadas por el virus de la peste de pequeños rumiantes no tratadas (Figura 3A), lo que implica que el carboplatino podría inducir una respuesta antiviral mediante la supresión de la expresión de STING. Para confirmar el papel de STING en la actividad antiviral inducida por carboplatino, generamos células Vero knockdown estables de STING (Figura 3B) y analizamos los niveles de replicación viral. Los resultados de la Western blot mostraron que la disminución de la proteína N estructural del virus de la peste de pequeños rumiantes aumentó significativamente con el tratamiento de las células knockdown de STING con carboplatino a una concentración de 100 μM (Figura 3C). Además, el tratamiento con carboplatino redujo notablemente los niveles de ARNm del virus de la peste peste en las células knockdown de STING, según lo determinado por qRT-PCR (Figura 3D). Mientras tanto, el tratamiento con carboplatino de las células knockdown de STING infectadas dio lugar a la mayor reducción de los títulos virales en la IDCT₅₀ análisis comparado con las células knockdown STING tratadas con carboplatino, Vero infectadas con PPRV e infectadas con PPRV (Figura 3E). En conjunto, estos datos indican que la actividad antiviral del carboplatino se debe a la inhibición de la regulación positiva de STING inducida por la infección por el virus de la peste de pequeños rumiantes.

Figura 3. La regulación negativa de STING contribuye al efecto antiviral del carboplatino. (A) Análisis de Western blot de STING y LC3 en células infectadas por el virus de la peste de pequeños rumiantes (MOI = 1), tratadas con carboplatino (100 μM) y no tratadas a 48 hpi. Se utilizó β-tubulina como control de carga. (B) La eficiencia del silenciamiento de STING se verificó mediante pernos occidentales. Se utilizó β-tubulina como control de carga. (C) Análisis de Western blot de la proteína N del virus de la peste de pequeños rumiantes en células infectadas por el virus de la peste peste pérrimo, tratadas con carboplatino (100 μM) y células KD de tipo salvaje y STING no tratadas (MOI = 1,48 hpi). (D) Se midieron los niveles de ARNm de PPRV en células infectadas por PPRV, tratadas con carboplatino (100 μM) y células KD de tipo salvaje y STING no tratadas (MOI = 1, 48 hpi) mediante qPCR. Los datos muestran la media ± DE; n = 3; p < 0,001; p < 0,0001. (E) Las células KD de tipo natural y STING tratadas/no tratadas con carboplatino (100 μM) se infectaron con PPRV (MOI = 1), y los títulos del virus se midieron mediante TCID₅₀ (48 hpi). Los datos muestran la media ± DE; n = 3; *p < 0,005; p < 0,001; p < 0,0001.

El carboplatino inhibe la autofagia mediada por el virus de la peste peste plegaria mediante la regulación negativa de la picadura

Formalmente, dado que la PPRV secuestra la autofagia celular para la replicación viral (8, 43-46), los niveles más bajos de cargas virales podrían deberse a la inhibición del flujo de autofagia celular o a moléculas clave relacionadas con la autofagia. Dado que el carboplatino inhibe la regulación positiva de la picadura mediada por el virus de la gripe porvina, y la evidencia acumulada ha confirmado el papel indispensable de la picadura en la inducción de la autofagia desencadenada por diferentes señales (45, 57-59), especulamos que el carboplatino puede ejercer actividad antiviral al bloquear la autofagia inducida por el virus de la peste de pequeños cogisueños mediante la inhibición de la regulación positiva de la picadura. Para comprender mejor el mecanismo molecular implicado en la inhibición de la autofagia mediada por el virus de la peste de pequeños rumiantes por el carboplatino, establecimos células knockdown de STING utilizando shRNA y examinamos si STING también estaba implicado en la inhibición de la autofagia por el carboplatino. Como se esperaba, el análisis de Western blot mostró que la eliminación de STING suprimió la autofagia en las células Vero infectadas por el virus de la peste peste de pequeños rumiantes y mejoró el efecto inhibidor del carboplatino sobre la autofagia. La infección por PPRV no pudo inducir la autofagia en las células knockdown de STING tratadas con carboplatino en comparación con las células control de tipo salvaje tratadas con carboplatino (Figura 4A), lo que indica que el carboplatino inhibe la autofagia inducida por PPRV mediante la regulación negativa de STING. Además, la inhibición de la autofagia inducida por el virus de la peste de pequeños rumiantes con bafilomicicina A1 (Baf-A1), un inhibidor de la autofagia, dio lugar a una mayor reducción de la cantidad de proteína N en comparación con las células Vero tratadas con carboplatino solo (Figura 4B). En conjunto, estos hallazgos sugieren que la actividad antiviral del carboplatino se debe a la potente inhibición de la regulación positiva de STING y su capacidad para inducir la autofagia durante la infección por el virus de la peste de pequeños rumiantes.

Figura 4. La picadura es esencial para la inducción de la autofagia. (A) Análisis de Western blot de LC3 en células KD de tipo salvaje y STING tratadas/no tratadas con carboplatino (100 μM) e infectadas con PPRV (MOI = 1,48 hpi). Se utilizó β-tubulina como control de carga. (B) Detección de Western blot de N, STING y LC3 en células Vero infectadas con PPRV (48 hpi). Las células Vero fueron pretratadas con o sin Baf-A1 durante 24 h antes de ser tratadas con o sin carboplatino e infectadas con PPRV (MOI = 1). Se utilizó β-tubulina como control de carga.

La inhibición de la autofagia es responsable de la actividad antiviral del carboplatino

A nivel molecular, la autofagia es un proceso finamente orquestado que involucra numerosas proteínas, incluidas las codificadas por genes relacionados con la autofagia (ATG) (60). Tras la activación de la autofagia, los ATG son reclutados en subdominios cercanos al RE para desempeñar funciones esenciales (61). La proteína ATG5 de la maquinaria central de la autofagia es fundamental para la formación de autofagosomas y es responsable de la elongación de los fagóforos. El derribo ATG5 bloquea la autofagia (62). Para confirmar aún más el papel de la autofagia en la actividad antiviral del carboplatino, se logró la inhibición de la autofagia mediante la transducción de shRNA dirigido a ATG5 en células Vero, y el nivel de proteína de ATG5 se evaluó mediante Western blot (Figura 5A). Como se muestra en la Figura 5B, el knockdown de ATG5 suprimió la autofagia y la expresión de la proteína N del PPRV en las células Vero. Además, la ausencia de ATG5 promovió el efecto inhibidor del carboplatino y condujo a la mayor reducción en los niveles de proteína N en comparación con las células Vero tratadas con carboplatino, infectadas con PPRV y las células knockdown ATG5 infectadas con PPRV. De acuerdo con esto, el tratamiento de las células knockdown ATG5 con carboplatino dio como resultado el nivel más bajo del marcador de autofagia LC3-II. Sin embargo, la inhibición de la regulación positiva de la picadura inducida por PPRV por carboplatino no se vio afectada en las células deficientes en ATG5 (Figura 5B). Además, en comparación con los de los controles que solo recibieron virus, los niveles de ARNm de PPRV disminuyeron significativamente en las células infectadas por PPRV tratadas con carboplatino según lo determinado por qRT-PCR, y la disminución más fuerte se observó en las células knockdown ATG5 tratadas con carboplatino e infectadas con PPRV (Figura 5C). De manera similar, el tratamiento de las células knockdown ATG5 con carboplatino dio lugar a la mayor reducción de los títulos virales en la IDTC₅₀ (Figura 5D). En resumen, estos hallazgos implican que la actividad anti-PPRV del carboplatino es atribuible a su capacidad para inhibir la autofagia inducida por PPRV.

Figura 5. La inhibición de la autofagia es responsable de la reducción de la producción de PPRV. (A) La eficiencia de silenciamiento de ATG5 se verificó mediante atornillado occidental. Se utilizó β-tubulina como control de carga. (B) Análisis de Western blot de la proteína N del virus PPRV, LC3 y STING en células KD de tipo salvaje y ATG5 infectadas por PPRV, tratadas con carboplatino (100 μM) y no tratadas (MOI = 1, 48 hpi). (C) Los niveles de ARNm de PPRV en células KD de tipo salvaje y ATG5 infectadas por PPRV, tratadas con carboplatino (100 μM) y no tratadas (MOI = 1, 48 hpi) se midieron mediante qPCR. Los datos muestran la media ± DE; n = 3; p < 0,001; p < 0,0001. (D) Las células KD de tipo salvaje y ATG5 tratadas/no tratadas con carboplatino (100 μM) se infectaron con PPRV (MOI = 1), y los títulos del virus se midieron mediante TCID₅₀ (48 hpi). Los datos muestran la media ± DE; n = 3; *p < 0,005; **p < 0,01; p < 0,0001.

Discusión

El virus de la peste de pequeños rumiantes, un virus altamente contagioso y mortal en ovejas y cabras, se considera una gran amenaza para los pequeños rumiantes en todo el mundo y ya ha causado enormes pérdidas económicas en regiones endémicas de todo el mundo (2, 9). En la actualidad, la única opción disponible para controlar la infección y la propagación del virus de la peste de pequeños rumiantes es la vacunación. Las vacunas vivas atenuadas ya se han utilizado ampliamente para controlar la peste de pequeños rumiantes y se reconocen como herramientas clave en el programa mundial de erradicación de la peste de pequeños rumiantes (63, 64). Sin embargo, al igual que todos los paramixovirus, el virus de la peste de pequeños rumiantes es sensible al calor y, por lo tanto, se necesita una cadena de frío eficaz para administrar la vacuna viva atenuada en zonas con un clima cálido, lo que se traduce en un aumento significativo de los costes de la vacuna (21). Estas observaciones ponen de relieve la necesidad urgente de desarrollar agentes antivirales que puedan prevenir eficazmente la infección por el virus de la peste de pequeños rumiantes. Sin embargo, no hay datos sobre los medicamentos antivirales dirigidos a la PPRV.

El carboplatino, un segundo análogo del platino clínicamente importante, se ha convertido en un uso clínico común y se ha convertido en el tratamiento principal para muchos tumores (29, 65). En particular, se ha demostrado que el carboplatino es el fármaco de platino más seguro para su uso durante el embarazo (31, 32). Aunque fue desarrollado para humanos, los estudios han demostrado que el carboplatino también es un agente anticancerígeno eficaz para perros y gatos, ya que la terapia con carboplatino para el osteosarcoma apendicular canino y los carcinomas de células escamosas orales y cutáneos felinos ha demostrado una eficacia clínica prometedora (28, 35, 36). Es bien sabido que la quimioterapia induce una respuesta inmune antitumoral (66). El carboplatino puede promover la respuesta inmunitaria antitumoral al reducir las células inmunoinhibidoras (37, 67-69). Además, los estudios han demostrado que el agente quimioterapéutico a base de platino puede modular la replicación viral en pacientes con hepatitis B crónica sometidos a quimioterapia (38). Sin embargo, el efecto del carboplatino sobre la replicación de morbillivirus inmunosupresores sigue siendo desconocido. En el presente estudio, analizamos la influencia del carboplatino en la infección por morbillivirus y encontramos por primera vez que el carboplatino inhibe la replicación del PPRV en células Vero.

El RE es un orgánulo dinámico responsable de la biosíntesis de proteínas en las células eucariotas (70). Diversos estreses celulares, incluyendo infecciones microbianas y defectos en el plegamiento de proteínas, pueden alterar la homeostasis del RE y, en última instancia, dar lugar al estrés del RE (71). Durante la infección productiva, los virus producen un gran número de proteínas virales que se acumulan en el lumen del RE y finalmente dan lugar al estrés del RE (72, 73). Para amortiguar el estrés del RE y orquestar la recuperación de la función del RE, la UPR se activa inhibiendo la traducción global (74). La UPR consta de tres vías: PERK, IRE1 y ATF6 (75, 76). Cada vez hay más pruebas de que varios virus regulan la UPR para promover su replicación (77-79), como el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) (55), el virus del dengue (DENV) (53), el virus de la encefalitis japonesa (JEV) (80) y el VHB (54). Otro miembro del Morbillivirus, el CDV, expresa dramáticamente las proteínas H y F y se acumula en el RE, desencadenando la UPR (81). Previamente demostramos que la infección por PPRV induce estrés en el RE y activa selectivamente la vía ATF6 de la UPR para promover la infección viral en las células Vero (43, 45). De manera similar, la vía ATF6 se activa durante la infección por enterovirus A71 (EV-A71), con escisión proteolítica de ATF6 (48, 82). Nuestros resultados mostraron que, como consecuencia funcional de la reducción de la replicación del virus de la peste de pequeños rumiantes, se observó una inhibición de la activación de ATF6 y cambios morfológicos más graves en el RE en las células Vero tratadas con carboplatino. Otro estudio mostró que era la vía PERK/eIF2α, pero no la vía ATF6 o IRE1, la que participaba en la activación de la autofagia mediada por estrés del RE para mejorar la replicación del virus de la peste de pequeños rumiantes en las CEE (43), lo que sugiere que la activación de la UPR mediada por el estrés del RE puede deberse a la especificidad del tipo celular durante la infección por el virus de la peste de pequeños rumiantes.

La autofagia se considera una respuesta celular fundamental para combatir la infección microbiana mediante la degradación de patógenos infecciosos secuestrados dentro de los autofagosomas y desempeña un papel clave en la inducción de la respuesta inmune innata y adaptativa (52, 83, 84). Numerosos virus han desarrollado estrategias para contrarrestar la vía autofágica y facilitar su propia replicación, como el MeV (43, 46, 85), el DENV (86), el virus de la fiebre aftosa (87), el circovirus porcino tipo 2 (PCV-2) (88), el coxsackievirus B3 (CVB3) (89), el virus de la hepatitis C (VHC) (90), el virus de la peste porcina clásica (PPC) (91), el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) ( 92), el reovirus aviar (ARV) (93) y el virus de la gripe A (IAV) (94). En el estudio de Chen et al., encontraron que el agente quimioterapéutico a base de platino Cisplatino promueve la replicación del VHB a través de la inducción de la autofagia en pacientes que reciben quimioterapia (38). Aquí, encontramos que el carboplatino suprime la replicación del PPRV al inhibir la vía de autofagia en las células Vero. Del mismo modo, Yang et al. informaron de que el tratamiento con inhibidores de la autofagia NH4Cl, cloroquina y wortmannina condujo a una disminución significativa de la proteína N estructural en las CEE infectadas por el virus de la peste de pequeños rumiantes (44). Zhang et al. encontraron que la inhibición de la autofagia con ARN interferente pequeño (siRNA) dirigido a ATG7 contribuyó a una reducción significativa en la expresión de la proteína N del virus PPRV, así como al rendimiento de viriones de progenie en las células Vero (46). Además, recientemente se ha demostrado que el tratamiento de las células Vero con cloroquina y wortmannina dio lugar a una disminución drástica de la proteína N y del título viral en las células infectadas por el CDV (95). En el trabajo de G. Ferrara, observaron una disminución del rendimiento viral y de las proteínas virales en células permisivas pretratadas con inhibidores de la autofagia (bafilomicina, cloroquina y 3-metiladenina) durante la infección por herpesvirus felino tipo 1 (FeHV-1) (96, 97). El virus de la pseudorrabia (PRV) activa la autofagia para elevar la replicación viral y la inhibición de la autofagia con la replicación restringida de PRV con 3-metiladenina (3-MA) en células neuro-2a de ratón (98).

STING, una proteína transmembrana conservada evolutivamente localizada en la membrana del RE de células inmunes y no inmunes (99), es mejor conocida por su importante función adaptadora de señalización en la activación de las respuestas de interferón tipo I a la infección con virus de ADN (100). Aparte del papel clásico en la mediación de la producción de interferón y citoquinas proinflamatorias, los estudios han revelado que la inducción de la autofagia es una función evolutivamente conservada de STING (58, 59, 101, 102). Moretti et al. encontraron que durante la infección por bacterias grampositivas L. innocua, se requiere STING para activar la respuesta al estrés del RE mediada por PERK y, en última instancia, conduce a la reticulofagia (101). En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que STING interactúa con PERK para activar la autofagia mediada por estrés del RE en respuesta a la infección por FMDV (102). A diferencia del virus de ssRNA de sentido positivo (FMDV), el PPRV (virus de ssRNA de sentido negativo) regula al alza el STING para activar la autofagia inducida por ATF6 (45). Nuestros resultados mostraron que el carboplatino bloquea la autofagia al inhibir la regulación positiva de STING inducida por PPRV y la posterior activación de ATF6, sin embargo, el mecanismo preciso por el cual el carboplatino inhibe la autofagia mediada por STING requiere más investigación.

En conclusión, demostramos por primera vez que el carboplatino inhibe eficazmente la replicación del virus de la peste de pequeños rumiantes in vitro. La evaluación del mecanismo de acción del carboplatino contra el virus de la peste de pequeños rumiantes reveló que la actividad antiviral se debe a la inhibición de la autofagia mediante la inhibición de la regulación positiva de la picadura inducida por la peste de pequeños rumiantes, destacando que la modulación de la picadura representa un enfoque atractivo para contrarrestar los virus de ADN y ARN. Dado que el carboplatino es un fármaco clínicamente aprobado para el tratamiento antitumoral, nuestros datos podrían proporcionar una nueva opción terapéutica para la cura y posiblemente también para la prevención de enfermedades virales en humanos.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres de los repositorios y los números de acceso se pueden encontrar en: https://www.jianguoyun.com/p/DdKdth4Qi4mvDBjom8IFIAA.

Contribuciones de los autores

RZ: Adquisición de fondos, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. ZH: Administración de proyectos, redacción, revisión y edición. DW: Administración de proyectos, redacción, revisión y edición. RL: Administración de proyectos, redacción, revisión y edición. YL: Curación de datos, redacción, revisión y edición. ZZ: Metodología, Redacción – revisión y edición.

Financiación

El/los autor/es declara(n) que se recibió apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32302870), los Fondos de Investigación de la Universidad del Suroeste de Minzu (RQD2023034) y los Fondos de Investigación Fundamental de la Universidad del Suroeste de Minzu (ZYN2023048). Programa de Capacitación en Innovación e Integración de Innovación Científica y Tecnológica de la Universidad del Suroeste de Minzu (D202310281701392972).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

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Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2024.1383927/full#supplementary-material

Referencias