1 Introducción

La promoción de la sincronización del celo y la tecnología de inseminación artificial en la industria ovina puede aumentar la producción de corderos, mejorar la eficiencia reproductiva y mejorar el manejo del rebaño y el mejoramiento genético (1). La cría sincronizada da como resultado un parto sincronizado, lo que simplifica la gestión centralizada y la venta de corderos (2). En la práctica de la producción, un programa de sincronización del celo comúnmente utilizado para las ovejas que se someten a inseminación artificial o que sirven como receptoras en el proceso de Ovulación Múltiple y Transferencia de Embriones (MOET) implica el uso de insertos vaginales o esponjas que contienen acetato de fluorogestona o acetato de medroxiprogesterona y eCG (3, 4). Numerosos estudios han demostrado la eficacia del uso de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) para sincronizar e inducir la ovulación en la reproducción de los animales de granja (5-7). Menchaca et al. (2) han demostrado que la administración de una dosis única de GnRH 24-36 h después de retirar el dispositivo intravaginal liberador de progesterona da lugar a un pico de hormona luteinizante aproximadamente 40 h después. Además, el 90% de las ovejas ovulan dentro de las 72 horas posteriores a la retirada del dispositivo.

Aunque la GnRH se ha utilizado ampliamente en proyectos de Inseminación Artificial a Tiempo Fijo (FTAI) para ovinos (8), lo que ha dado lugar a una cierta mejora del beneficio económico en la producción ganadera (9), su efecto sobre las tasas de preñez sigue siendo objeto de debate (2). Algunos estudios indicaron que la administración de una dosis única de GnRH después de la retirada del pesario aumenta las tasas de embarazo (10, 11), en contraste con los hallazgos de ningún efecto (6, 12, 13) o una disminución en las tasas de embarazo en otros estudios (14). De manera similar, en vacas que experimentan sincronización de celo, la administración de GnRH durante la inseminación conduce a la ovulación de folículos fisiológicamente inmaduros, lo que afecta la tasa de preñez de las vacas y la supervivencia fetal en gestación posterior (15). La exposición del folículo preovulatorio al aumento de gonadotropina desencadenado por la GnRH exógena puede reducir la calidad de los ovocitos, disminuyendo la tasa de embarazo (16). Además, se ha inferido que la GnRH podría dificultar la implantación embrionaria, afectando consecuentemente las tasas de embarazo en los protocolos FTAI (17).

La metabolómica es una tecnología importante para el estudio de las redes metabólicas de los sistemas biológicos. Implica el análisis cuantitativo de todos los metabolitos en los organismos y la exploración de las relaciones relativas entre los metabolitos y los cambios fisiopatológicos (18). Esta técnica se aplica ampliamente en la investigación de plantas (19), el desarrollo de fármacos (20) y el estudio de enfermedades (21). Varios estudios han utilizado la metabolómica para detectar la calidad de la carne ovina (22), la alimentación y la nutrición (23) y las enfermedades (24). Estudios relevantes también han utilizado la metabolómica para analizar la composición del moco cervical de la oveja y el impacto negativo de las respuestas inflamatorias en el transporte de semen en el cuello uterino (25). Sin embargo, la investigación sobre el entorno de implantación durante el período periimplantacional sigue siendo limitada.

En el estudio, las ovejas Huyang fueron tratadas con sincronización de celo, se inyectó un agonista de GnRH 48 h después de la retirada de las esponjas de progesterona y se comparó la diferencia en la tasa de preñez 40 días después de la inseminación. Se recolectaron muestras de sangre en el día 7 después del tratamiento con GnRH para el análisis metabolómico para identificar las vías metabólicas y los metabolitos que afectan las tasas de preñez en las ovejas Huyang causadas por GnRH. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del tratamiento con GnRH sobre las tasas de preñez y los metabolitos preimplantacionales en ovejas Huyang.

2 Materiales y métodos

2.1 Animales y ubicación

El estudio se llevó a cabo en enero de 2023 en Hulunbeir, Mongolia Interior. Se encuentra a 120°28′E de longitud y 47°5′N de latitud. Esta región experimenta un clima continental templado y recibe precipitaciones anuales que oscilan entre 300 y 500 mm. Los inviernos son fríos y áridos, mientras que los veranos son calurosos y lluviosos, lo que provoca fluctuaciones significativas en las temperaturas anuales y diarias. El experimento seleccionó 23 ovejas Huyang sanas y multíparas (de 1,5 a 4 años, con un peso de 40 a 45 kg, BSC ≥ 3, que van desde la demacración hasta la obesidad). Todas las ovejas que participan en el experimento poseen tractos reproductivos sanos y capacidades de lactancia, con un período promedio de destete superior a 3 meses, lo que las califica para el tratamiento de sincronización de celo. Durante el período experimental, las ovejas se mantuvieron alejadas de los carneros para evitar el apareamiento voluntario. Las ovejas se mantuvieron en el interior por la noche y se les permitió pastar en los pastos naturales de la granja durante todo el día. Cuando las ovejas se mantenían en el interior, todas las ovejas recibían TMR, incluyendo heno de alfalfa, cebada y concentrado mixto de acuerdo con la recomendación de la NRC, y tenían libre acceso al agua y al bloque mineral. Este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Hebei, Baoding, China (Número: 2021011). Se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento de los animales. Los autores declaran que todos los procedimientos del experimento se llevaron a cabo de manera consistente con los preceptos del bienestar animal, y que el personal involucrado en el cuidado y manejo de los animales eran veterinarios autorizados.

2.2 Sincronización del celo y tratamiento hormonal

Todas las ovejas experimentales fueron ovejas Huyang autóparas y multíparas, que se sincronizaron mediante un protocolo de combinación progestágeno-eCG. Cada oveja recibió una esponja intravaginal de poliuretano impregnada con 45 mg de acetato de flurogestona (Muqimuye Sci-Tech Co., Ltd., Shanghai, China) durante 12 días, seguida de un tratamiento con 330 UI de eCG i.m. (Sansheng Biological Technology Co., Ltd., Ningbo, China) en el momento de la extracción de la esponja. El grupo experimental (B, n = 69) fue sometido a 48 h (Día 0) después de la retirada de la esponja a la administración intramuscular de 17 μg del agonista de la GnRH triptorelina (Sansheng Biological Technology Co., Ltd., Ningbo, China), y el grupo control (Y, n = 41) con 1 mL de suero fisiológico estéril. Todas las ovejas se sometieron a una única inseminación vaginal 58 h después de la retirada de las esponjas de progesterona.

2.3 Inseminación artificial a tiempo fijo

Se recolectaron espermatozoides frescos de seis carneros Huyang sanos, y se evaluó la motilidad y densidad de los espermatozoides utilizando un hemocitómetro y un microscopio óptico. Los espermatozoides (motilidad progresiva superior al 50% y densidad superior a 1 × 10⁹ espermatozoides/ml) se diluyeron utilizando 5-7 veces el volumen de leche desnatada (leche desnatada Yili, Mongolia Interior Yili Industrial Group Limited by Share Ltd), asegurando que la motilidad de los espermatozoides después de la dilución se mantuviera por encima de 0,5, y la densidad se ajustó a 4 × 10⁸ espermatozoides/mL. A continuación, los espermatozoides diluidos se almacenaron en una tetera al baño de agua a 30 °C. Las ovejas experimentales fueron inmovilizadas boca abajo y su moco vaginal se limpió con solución salina normal tibia para garantizar la higiene del entorno vaginal, reduciendo así el impacto en la viabilidad de los espermatozoides. Se insertó un espéculo vaginal para abrir la vagina y se observó y localizó el orificio cervical. Se utilizó un inseminador específico para ovejas (producido por Baoding Zhengmu Biotechnology Co., Ltd.) para aspirar 0,3 ml de semen e inyectarlo en el orificio cervical.

2.4 Toma de muestras de sangre

Las ovejas fueron seleccionadas aleatoriamente del grupo experimental (n = 13) y del grupo control (n = 10). En el grupo experimental (n = 13) y en el grupo control (n = 10), se recolectaron 5 mL de sangre venosa yugular utilizando tubos de extracción de sangre al vacío que contenían heparina sódica en el día 7 después del tratamiento con el agonista de la GnRH. Posteriormente, las muestras de sangre se sometieron a centrifugación a 3.000 × g durante 15 min a 4°C. El plasma sobrenadante resultante se separó cuidadosamente y se transfirió a tubos EP de 1,5 ml libres de enzimas utilizando una pipeta de precisión. Las muestras de plasma se almacenaron inmediatamente a -80 °C para preservar su integridad para su posterior análisis metabolómico.

2.5 Detección por cromatografía líquida sérica-espectrometría de masas en tándem

Mezcle 100 μL de la muestra con 400 μL de metanol preenfriado, asegurando una mezcla completa por vórtice. Incubar la mezcla en hielo durante 5 minutos, centrifugarla a 15.000 × g y a 4 °C durante 20 minutos. Diluya una porción del sobrenadante resultante con agua de grado LC-MS para lograr una concentración final de metanol del 53%. A continuación, transfiera la muestra diluida a un nuevo tubo de centrífuga utilizando un filtro de 0,22 μm y vuelva a centrifugarla a 15.000 × g y 4 °C durante 20 min. Finalmente, la muestra filtrada se inyecta en el sistema LC-MS/MS para su análisis.

El análisis LC-MS/MS se llevó a cabo utilizando el sistema UHPLC Vanquish (ThermoFisher, Alemania) junto con un espectrómetro de masas Orbitrap Q ExactiveTMHF-X (ThermoFisher, Alemania). Las muestras se inyectaron en una columna cromatográfica Hypersil Gold (100 mm × 2,1 mm, 1,9 μm) a un caudal de 0,2 ml/min utilizando un gradiente lineal de 17 min. Para el modo de polaridad positiva, las fases móviles consistieron en el eluyente A (0,1% de ácido fórmico en agua) y el eluyente B (metanol). Para el modo de polaridad negativa, las fases móviles fueron el eluyente A (acetato de amonio de 5 mM, pH 9,0) y el eluyente B (metanol). El gradiente de disolvente se estableció de la siguiente manera: 2%B, 1,5 min; 2–85%B, 3 min; 85–100%B, 10 min; 100–2%B, 10,1 min; 2%B, 12 min. El espectrómetro de masas Q ExactiveTMHF-X funcionó tanto en modo positivo como negativo con una tensión de pulverización de 3,5 kV, una temperatura capilar de 320 °C, un caudal de gas de vaina de 35 psi y un caudal de gas auxiliar de 10 L/min, un nivel de RF de lente S de 60, una temperatura del calentador de gas auxiliar de 350 °C.

2.6 Prueba de embarazo

Cuarenta días después de la inseminación, un técnico fijo utilizó un probador de ultrasonido B (DP-30Vet, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.) para realizar una prueba de embarazo en las ovejas inseminadas a través del abdomen. La ecografía B mostró un saco gestacional claro, que se identificó como embarazo. Las tasas de preñez se calcularon como el porcentaje de ovejas preñadas entre las ovejas inseminadas.

2.7 Análisis de datos

El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 8.0. Las tasas de embarazo en los grupos experimental y control se analizaron mediante una prueba de Chi-cuadrado. Se aceptó como significativo si el valor de p calculado <0,05. Utilice las bases de datos de la Base de Datos del Metaboloma Humano (HMDB, http://www.hmdb.ca/), la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG, http://www.genome.jp/kegg/) y los mapas de lípidos (Programa de Investigación de la Vía del Metabolismo de los Lípidos, https://lipidmaps.org/) para anotar los metabolitos. Utilice metaX para el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) y emplee el análisis univariante (prueba T) para calcular la significación estadística (valor p). Se realizó PLS-DA para calcular las puntuaciones de Importancia de la Variable en la Proyección (VIP). Los metabolitos que cumplen con los criterios de Importancia Variable en Proyección (VIP) > 1, valor de p <0.05 y Cambio de Pliegue (FC) > 1.2 o FC < 0.833 se consideran metabolitos diferenciales. Las funciones de estos metabolitos y las vías metabólicas se estudiaron utilizando la base de datos KEGG. Se realizó el enriquecimiento de metabolitos diferenciales por vías metabólicas y se consideró enriquecimiento por vías metabólicas. Cuando el valor de p de la vía metabólica <0,05, las vías metabólicas se consideraron enriquecimiento estadísticamente significativo.

3 Resultados

3.1 Efecto de la GnRH sobre las tasas de embarazo a los 40 días después de la inseminación

El embarazo se detectó mediante ecografía a los 40 días de la inseminación, siendo el resultado el que se muestra en la Tabla 1. La tasa de embarazo del grupo experimental fue significativamente menor que la del grupo control (72,2 vs. 82,9%, p < 0,05). Los resultados mostraron que el tratamiento con GnRH durante la inseminación artificial disminuyó las tasas de preñez en las ovejas Huyang.

3.2 Clasificación de los metabolitos en ovejas

Para investigar los factores que contribuyen a la reducción de las tasas de preñez después del tratamiento con GnRH en ovejas Huyang, se recolectaron muestras de plasma de los grupos experimental y control 7 días después de la inseminación artificial para metabolómica. Las 23 muestras identificaron 464 metabolitos en modo de iones positivos (POS) y 376 en modo de iones negativos (NEG). El análisis del modo iónico positivo reveló una variedad de metabolitos como lípidos y moléculas similares a los lípidos (57,38%), ácidos orgánicos y derivados (14,48%), compuestos organoheterocíclicos (10,86%), bencenoides, (5,01%), fenilpropanoides y policétidos (3,90%), compuestos orgánicos de nitrógeno (3,34%), nucleósidos, nucleótidos y análogos (2,79%), compuestos orgánicos de oxígeno (1,95%) y alcaloides y derivados (0,28%) (Figura 1A). El análisis en modo iónico negativo indicó la existencia de lípidos y moléculas similares a los lípidos (63,93%), ácidos orgánicos y derivados (13,44%), bencenoides, (6,89%), compuestos orgánicos de oxígeno (4,26%), compuestos organoheterocíclicos (3,93%), fenilpropanoides y policétidos (3,93%), nucleósidos, nucleótidos y análogos (2,95%), ninguno (0,33%) y compuestos orgánicos nitrogenados (0,33%) (Figura 1B).

Además, se utilizó la base de datos KEGG para la anotación funcional de los metabolitos identificados con el fin de comprender sus rasgos funcionales y clasificaciones (Figuras 1C, D). En los modos positivo y negativo, los metabolitos identificados participan en procesos de vía relacionados con procesos celulares, procesamiento de información ambiental, procesamiento de información genética, metabolismo y sistemas orgánicos. Específicamente, bajo el modo de iones positivos, los metabolitos participan principalmente en procesos biológicos como el crecimiento y la muerte celular, el transporte de membrana, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo energético y el metabolismo de los aminoácidos. En el modo de iones negativos, los metabolitos involucran principalmente procesos biológicos, incluido el crecimiento y la muerte celular, las moléculas de señalización y la interacción, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo de los aminoácidos y el sistema inmunológico.

3.3 Cribado y análisis de metabolitos diferenciales

El Análisis Discriminante de Mínimos Cuadrados Parciales estableció un modelo de relación entre la expresión de metabolitos y la categoría de la muestra, facilitando la predicción de la categoría de la muestra. Para discriminar los metabolitos diferenciales entre los dos grupos, se realizó PLS-DA supervisado para encontrar metabolitos diferentes. Como se muestra en la Figura 2, los parámetros de predicción del modelo de evaluación PLS-DA exhiben valores R2Y de 0,84 y 0,78 en los modos de iones positivos y negativos (Figuras 2A, B), con los valores Q2Y de 0,09 y − 0,03, respectivamente. Los valores más altos de R2Y en comparación con Q2Y en ambos modos indican la fiabilidad del modelo utilizado en este estudio.

Los datos metabolómicos se analizaron mediante FC, valor de p y VIP en análisis univariado. Posteriormente, se identificaron metabolitos diferenciales basados en VIP > 1,0, FC > 1,2 o FC < 0,833, y p < 0,05. Se identificaron un total de 53 metabolitos que presentaban diferencias significativas: 37 en modo iónico positivo, que comprenden 31 metabolitos regulados al alza y seis regulados a la baja, y 16 en modo de iones negativos, con 13 regulados al alza y tres regulados a la baja (Tabla 2; Figuras 2C y D). Como se muestra en las Figuras 3A, B, el mapa de calor mostró todos los metabolitos diferenciales en los modos de iones positivos y negativos. Los 10 principales metabolitos diferenciales en modo de iones positivos son N,N′-di[4-(2,6-dimetilmorfolino)fenil]tiourea, fosfatidilcolina (20:3e/19:2), ácido 4-metoxicinámico, fosfatidilcolina (18:1e/22:6), éter de 2-araquidonil glicerol, fosfatidilcolina (14:0e/3:0), tetranor-PGDM, cinchofeno, fosfatidilcolina (15:0/16:1) y monoacilglicerol (18:2). Los 10 principales metabolitos diferenciales en modo de iones negativos son el ácido retinoico, la metiltestosterona, la corticosterona, el ácido (±) 18-hidroxieicosa-5,8,11,14,16-pentaenoico (18-HEPE), la prostaglandina D2, la prostaglandina K1, la lisofosfatidilcolina (LPC) 22:6, la LPC 22:4, la LPC 19:0 y la DL-3,4-dihidroxifenilglicol. Entre ellos, los niveles metabólicos de cortisona e hidroxiprolina disminuyeron significativamente, y el nivel de ácido pantoténico aumentó significativamente en el grupo experimental en modo iónico positivo. En el modo de iones negativos, los niveles metabólicos de corticosterona y prostaglandina D2 del grupo experimental aumentaron significativamente (Figura 3B). El análisis de correlación de metabolitos diferenciales se realizó mediante análisis de correlación de Pearson (Figuras 3C, D). En el modo iónico positivo, los niveles metabólicos de hidroxiprolina tuvieron una correlación positiva significativa con la cortisona y el 5-nitrotiofeno-3-carbaldehído 3-(2-piridilo) hidrazona (Figura 3C, p < 0,05). Los niveles metabólicos de corticosterona y prostaglandina D2 se correlacionaron significativamente positivamente en modo iónico negativo (Figura 3D, p < 0,05).

3.4 El impacto de la GnRH en las vías metabólicas

Para explorar las funciones fisiológicas de los metabolitos afectados por el tratamiento con GnRH, se realizó un análisis de enriquecimiento de la vía KEGG en 53 metabolitos diferenciales en modos iónicos positivos y negativos. El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG reveló 22 vías significativamente enriquecidas en los modos de iones positivos y 19 en los negativos. Estas vías pertenecían a cinco módulos: metabolismo, procesamiento de información genética, procesos celulares, procesamiento de información ambiental y sistemas de organismos. Las vías enriquecidas de metabolitos diferenciales en modo de iones positivos incluyeron principalmente la biosíntesis de pantotenato y CoA, la vía de señalización Foxo, la vía de señalización mTOR, la vía de señalización PI3K-Akt, la vía de señalización cGMP-PKG, la reabsorción de sodio regulada por aldosterona y la vía de señalización de AMPc (Figura 4A). La hidroxiprolina regulada significativamente a la baja se enriqueció en la vía del metabolismo de la arginina y la prolina (Figura 4B).

Por el contrario, en el modo de iones negativos, los metabolitos diferenciales se enriquecieron principalmente en la síntesis y secreción de aldosterona, el metabolismo del ácido araquidónico, la interacción ligando-receptor neuroactivo, la biosíntesis de hormonas esteroides y la diferenciación celular Th17, entre otras vías metabólicas (Figura 4C). La corticosterona significativamente regulada al alza se enriqueció principalmente en la vía de síntesis y secreción de aldosterona y en la vía de biosíntesis de hormonas esteroideas (Figura 4D). Además, hay un aumento significativo en el contenido metabólico de prostaglandina D2 en la vía del metabolismo del ácido araquidónico y la interacción de los ligandos neuroactivos con los receptores (Figura 4D). Además, se construyó una red reguladora KEGG utilizando los metabolitos diferenciales (Figuras 5A, B). La figura representa visualmente los cambios en metabolitos como la hidroxiprolina, la corticosterona y la prostaglandina D2. También muestra las intersecciones y los procesos biológicos relacionados con estos metabolitos y sus correspondientes vías.

4 Discusión

Las técnicas de sincronización e inseminación artificial se han utilizado ampliamente en la reproducción ovina, y el tratamiento con GnRH durante la inseminación se ha convertido en una práctica relativamente común en la industria ovina (26). Sin embargo, el impacto de la GnRH en el desarrollo embrionario y la implantación sigue siendo objeto de debate entre varios estudios. Nuestro estudio comparó las tasas de preñez a los 40 días entre las ovejas tratadas con GnRH y las de control. Los resultados indicaron que la tasa de embarazo en el grupo experimental (72,5%, n = 69) fue significativamente menor que la del grupo control (82,9%, n = 41) (p < 0,05).

Los resultados de embarazo obtenidos en nuestro grupo control son aceptables, lo que coincide con los resultados del tratamiento convencional de sincronización progesterona + eCG y la inseminación artificial (27). Estudios previos han demostrado que el tratamiento con GnRH 24-48 h después de la retirada de la progesterona en ovejas no mejora la tasa de preñez (11, 14). Las ovejas de Corriedale fueron tratadas con dos prostaglandinas para inducir la sincronización y FTAI con GnRH 24 h después de que la segunda prostaglandina utilizada disminuyera la tasa de preñez después de la inseminación artificial. Sin embargo, el tratamiento con GnRH 36 h después no tuvo un efecto significativo sobre la tasa de embarazo (14). Además, la administración de GnRH simultáneamente con la inseminación a tiempo único puede disminuir potencialmente la tasa de embarazo (28). Del mismo modo, el tratamiento con GnRH 36 h después de la retirada de la progesterona y la realización de la inseminación 48 h después no condujo a una mejora significativa en la tasa de preñez en cabras (6). En el proceso MOET, los receptores tratados con el análogo de GnRH Folligon también lograron una baja tasa de embarazo del 43,2% (29). Los resultados de estos estudios anteriores son consistentes con los resultados de este estudio.

Además, se realizó un análisis metabolómico para investigar las posibles razones detrás de la menor tasa de preñez observada en las ovejas tratadas con GnRH. La metabolómica emplea un análisis exhaustivo a través de los modos de iones positivos y negativos, con el objetivo de capturar los diversos metabolitos dentro del organismo. El modo de iones positivos tiende a detectar metabolitos alcalinos, mientras que el modo de iones negativos se centra en sustancias ácidas (30). En este estudio se llevó a cabo el cribado y la discusión de metabolitos por separado en dos modos. Significativamente, se analizaron metabolitos diferenciales, incluida la hidroxiprolina en modo iónico positivo y la corticosterona y la prostaglandina D2 en modo iónico negativo. La hidroxiprolina, un aminoácido distintivo que se encuentra en el colágeno, es un marcador de la degradación del colágeno (31, 32). Comprende aproximadamente el 13% del contenido total de aminoácidos del colágeno, por lo que es crucial para mantener la estructura y función del colágeno. Durante el embarazo, el contenido de colágeno uterino aumenta progresivamente, lo que conduce a un aumento correspondiente en los niveles de hidroxiprolina (33). En la actualidad, la matriz extracelular del útero y del tracto genital contiene abundante colágeno, esencial para soportar la creciente carga fetal y mantener la gestación (34). Los resultados de Metabonomics revelaron que el metabolito de la hidroxiprolina estaba significativamente regulado a la baja en la vía del metabolismo de la arginina y la prolina (p < 0,05) en ovejas Huyang tratadas con GnRH durante el período periimplantacional. Esta regulación a la baja puede disminuir la síntesis de colágeno, afectando la estabilidad y la resistencia mecánica del tejido endometrial y potencialmente causando daño o disfunción en el tejido uterino. Tales condiciones son desfavorables para establecer un ambiente adecuado para la implantación embrionaria. Además, los estudios han demostrado que el colágeno se degrada rápidamente después de que las vacas dan a luz, disminuyendo el tamaño y el peso uterino como parte del proceso de involución uterina (35). En conclusión, una reducción significativa en el nivel de hidroxiprolina durante el período periimplantacional es perjudicial para la implantación del embrión en el útero, lo que en última instancia disminuye la tasa de preñez en las ovejas Huyang.

Los resultados de este estudio indican que el metabolismo de la corticosterona en la vía de síntesis y secreción de aldosterona aumentó significativamente (p = 0,01) en ovejas Huyang tratadas con GnRH. La corticosterona, producida principalmente por la corteza suprarrenal, desempeña un papel crucial en la respuesta al estrés (36). Los estudios han demostrado que los niveles de corticosterona regulados al alza pueden inhibir el desarrollo embrionario y disminuir el número de células de masa celular interna, comprometiendo la calidad del embrión y afectando las tasas de embarazo (37). Zheng et al. utilizan continuamente corticosterona exógena en ratones durante los días 1 a 4 de gestación. En comparación con el grupo control, el uso de corticosterona resultó en una fuerte disminución de Stat3 fosforilado, afectando la receptividad endometrial y reduciendo significativamente el número de sitios de implantación en el día 5 (38). Del mismo modo, los estudios en un modelo de ratón de exceso de corticosterona han demostrado que los niveles elevados de corticosterona afectan a la fertilidad femenina al influir en el útero en lugar de en los ovocitos (39). Estos hallazgos son consistentes con nuestros resultados. Por lo tanto, pensamos que el tratamiento con GnRH durante la inseminación aumenta significativamente los niveles de corticosterona en las ovejas Huyang antes de la implantación, lo que afecta el entorno uterino antes de la implantación, interrumpe la receptividad endometrial y, en última instancia, disminuye la tasa de embarazo.

La prostaglandina D2 (PGD2) pertenece a la familia de las prostaglandinas y se sintetiza a partir del ácido araquidónico (AA) a través de la acción de la ciclooxigenasa (COX) (40). Los análisis metabolómicos indicaron un aumento significativo de la prostaglandina D2 dentro de la vía del metabolismo del ácido araquidónico (p = 0,017). Aunque el PGD2 promueve la regresión lútea, su efecto es menos pronunciado que el de la prostaglandina F2 alfa (PGF2α). No obstante, PGF2α y PGD2 exhiben efectos sinérgicos en la promoción de la regresión lútea mediante la expansión efectiva de los vasos sanguíneos y el aumento de la entrada al tejido lúteo, lo que facilita la afluencia de PGF2α adicional sintetizada en el endometrio y acelera el proceso de regresión lútea (41). Además, los PG sirven como mediadores clave en el estudio de la inflamación (42). Bajo condiciones inflamatorias u otros estímulos, la expresión de COX-2 se regula significativamente al alza, promoviendo aún más la síntesis de PG en un grado notable (43). La inducción de inflamación intrauterina puede tener un impacto negativo en la implantación y el desarrollo de embriones dentro del útero (44). Los estudios han revelado la presencia de PGD2 en los tejidos del endometrio humano y del músculo liso uterino, donde destaca como la sustancia más potente dentro de la familia de los PG para aumentar el flujo sanguíneo al endometrio y a los músculos uterinos (45). La elevación significativa de PGD2 puede desencadenar y acelerar la frecuencia de contracción del músculo liso uterino, disminuyendo en última instancia la tasa de supervivencia embrionaria (46). En consecuencia, el desequilibrio de los niveles de PGD2 en las ovejas afecta negativamente a la implantación embrionaria, lo que resulta en una disminución de la tasa de preñez en el grupo experimental.

5 Conclusión

En resumen, la administración de una dosis única del agonista de la GnRH triptorelina 48 h después de la retirada de la esponja reduce la tasa de preñez en ovejas Huyang después de la inseminación. El análisis metabolómico reveló una disminución significativa en los niveles de hidroxiprolina y un aumento significativo en los niveles de corticosterona y prostaglandina D2, que están relacionados con una disminución de la tasa de preñez en las ovejas Huyang.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos presentados en el estudio están depositados en el repositorio MetaboLights, número de acceso MTBLS10318.

Declaración ética

El estudio en animales fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Hebei. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales.

Contribuciones de los autores

JZ: Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Software, Validación, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. SS: Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Metodología, Recursos, Redacción – borrador original. XB: Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Metodología, Visualización, Redacción – borrador original. NY: Curación de datos, metodología, recursos, redacción, revisión y edición. YL: Curación de datos, metodología, recursos, redacción, revisión y edición. XW: Conceptualización, Análisis formal, Obtención de fondos, Metodología, Supervisión, Validación, Visualización, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. XL: Conceptualización, Curación de datos, Obtención de fondos, Metodología, Recursos, Supervisión, Validación, Visualización, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición.

Financiación

El/los autor/es declaran/n que se recibió apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Este estudio contó con el apoyo del Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Prefectura Autónoma de Ili Kazak (YZ2023A04) y el Fondo Especial de Talentos de la Universidad Agrícola de Hebei (YJ201952).

Reconocimientos

Los autores agradecen al personal de Hulunbeir Longxingchuan Animal Husbandry Technology Co., Ltd. por su ayuda durante este estudio. Los autores agradecen a Novogene (Novogene Co., Ltd., Pekín, China) por sus servicios de análisis metabolómico.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

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Referencias