Introducción

Los exámenes ginecológicos pertenecen a los procedimientos estándar en medicina veterinaria. Los hallazgos son importantes en el contexto del manejo de la cría (1). Encontrar el día de la ovulación durante el celo es esencial para un momento adecuado de apareamiento o inseminación y, por lo tanto, una alta fertilidad (2). Síntomas como la aceptación de un macho para el apareamiento (3), la secreción vulvar sanguínea (3) y el edema de la vulva (4) son signos de proestro y celo. Los síntomas que se pueden observar a través de la vaginoscopia son el color, la intensidad del edema y la humedad de la mucosa vaginal (4, 5). Dado que algunas perras no muestran signos de comportamiento manifiestos (6), puede ser útil determinar otras etapas del ciclo estral, es decir, proestro o diestro. También se pueden diagnosticar patrones anormales del ciclo del celo, como la ovulación temprana o tardía, los celos silenciosos o los celos divididos (7). Los síntomas externos del proestro son la hinchazón turgente de la vulva y la secreción sanguínea de la vulva (8). La secreción contiene un gran número de eritrocitos debido a la diapedesis a través de los capilares uterinos debido al efecto de los estrógenos (9). Los eritrocitos también se pueden encontrar en el frotis vaginal (10). El diestro se caracteriza por una ligera secreción mucoide que a menudo contiene un gran número de neutrófilos en una etapa temprana. La perra ya no permitirá montar o criar perros machos (8). Además, la citología vaginal forma parte de las exploraciones ginecológicas estándar porque permite conocer las posibles influencias de los estrógenos y el estado de salud de la vagina (11). La toma de muestras de células, la preparación y la tinción de un frotis para citología vaginal requieren pocas habilidades (12) y se pueden realizar de forma rápida y económica en la práctica diaria (13, 14). Sin embargo, el análisis y la interpretación de los frotis pueden verse afectados por varios factores. Los diferentes procedimientos de muestreo y tinción pueden sesgar los resultados de la evaluación (15). Además, las habilidades del observador, la transición entre los diferentes estadios celulares, así como las características individuales de la perra, como la aparición masiva de eritrocitos, pueden impedir la evaluación de los frotis vaginales (5).

Hasta donde sabemos, aún no se ha publicado una definición estandarizada uniforme de los tipos de células vaginales caninas. Una mirada más atenta a la literatura revela que los autores sugieren diferentes parámetros y definiciones del tipo de células, por ejemplo, en relación con el diámetro de los diferentes tipos celulares (Tabla 1).

Además del diámetro, la presencia y la extensión de la cornificación son aspectos importantes para la determinación de las células vaginales. La cornificación se refiere al proceso degenerativo de las células en las capas superiores de los epitelios escamosos estratificados (16). Diferentes autores dan diferentes definiciones de tipos de células en función de la extensión de la cornificación (Tabla 2). La mayoría de los autores están de acuerdo en que las células basales, parabasales e intermedias no están cornificadas en absoluto (16, 20).

Las células basales, parabasales e intermedias tienen un núcleo redondo inalterado (11, 19, 21). Según Johnston et al. (16) el área del núcleo de una célula intermedia es de >90^μm2. Otros autores especifican que el diámetro del núcleo de una célula intermedia es de 7-11 μm (22), lo que corresponde a un área entre aproximadamente 38,5 μm² y 95,0 μm². La mayoría de los autores coinciden en que el núcleo es grande y claramente discernible (19), prominente y parece normal (16). Las células superficiales se describen unánimemente como células que tienen un núcleo picnótico (12, 22, 23), que eventualmente se vuelve cariorretica (18) o cariolítica (17).

Para la mayoría de los autores, la forma de las células vaginales es un aspecto importante (22, 24, 25). Sin embargo, otros autores afirman que las células intermedias y superficiales pueden confundirse si se definen solo por su forma (5, 16). La definición de células escamosas tampoco está explícitamente clara. Mientras que algunos autores afirman que el núcleo no es visible (19, 20, 24), otros observaron que estas células están anucleadas, pero a menudo los restos del núcleo desintegrado siguen siendo visibles (18). A partir de estas definiciones heterogéneas, es probable que diferentes evaluadores lleguen a conclusiones diferentes a la hora de interpretar los frotis vaginales (1). Esto también ha sido demostrado por Arlt (15).

Un método utilizado a menudo para la determinación de la etapa del ciclo es la determinación de porcentajes específicos de tipos celulares. Algunos autores afirman que un frotis vaginal típico en celo tiene un 100 % de células superficiales y un >80 % de células con núcleos picnóticos o ausentes (11, 26). Otra definición de celo es la presencia de más del 90% de células epiteliales queratinizadas superficiales (13). Otros definen el celo citológico por 100 % de cornificación con más de 50 % de escamas anucleares (20). Para la determinación del diestro en base a porcentajes específicos de células vaginales exfoliadas, las definiciones de diferentes autores muestran una alta concordancia. La aparición del diestro se produce cuando el número de células superficiales y escamosas ha disminuido en al menos un 20% (10, 11, 13) y cuando hay un mayor número de granulocitos neutrófilos (23, 25). Las definiciones heterogéneas de los tipos celulares y los porcentajes de células característicos de etapas específicas del ciclo por parte de diferentes autores pueden perjudicar los diagnósticos de las etapas del ciclo y conducir a un acuerdo subóptimo entre diferentes evaluadores. El objetivo de este estudio fue aprender más sobre cómo los expertos en reproducción de pequeños animales definen las células vaginales. En un segundo paso, queríamos desarrollar definiciones más sólidas de las células vaginales y evaluar un tutorial de determinación celular.

Materiales y métodos

Preparación y digitalización de portaobjetos de células vaginales

En total, se tomaron 52 frotis vaginales de 39 perras para las que se confirmó la salud del tracto genital. Todas las perras fueron sometidas a un examen ginecológico en el contexto del momento de la ovulación o de un control de salud ginecológico rutinario. Las perras tenían edades comprendidas entre 1 y 14 años (mediana 5 años, rango intercuartílico 3 y 6 años) y pertenecían a las razas Husky Siberiano, Bulldog Continental, Gran Danés, Rottweiler, Golden Retriever, Sabueso Afgano, Dobermann (n = 2), Schnauzer Miniatura (n = 3), Pomsky, Manchester Terrier (=2), Bulldog Francés (n = 2), Perro Salchicha, Collie Liso, Cruce (=5), Boyero Suizo, Bullterrier miniatura, Pug (n = 2), Labrador (n = 3), Cairn Terrier, Perro Pastor Kangal, Boyero de Berna, Border Collie, Shiba Inu, Pastor Alemán, Leonberger, Monkey Terrier y Berger Picard. El peso de los perros osciló entre 5 y 56 kg (mediana 20 kg, rango intercuartílico 10 y 30,25 años). Todos los frotis utilizados para este proyecto eran restos de exámenes clínicos.

Todos los especímenes se tomaron a través de un espéculo estéril insertado (Proctovision, Karl Storz SE & CO. KG, Tuttlingen, Alemania) como se describe en (11). Las muestras se recogieron mediante un hisopo de algodón estéril humedecido con solución salina (12). El hisopo de algodón (Medical applicator, Heinz Herenz Medizinbedarf GmbH, Hamburgo, Alemania) se introdujo a través del espéculo (5) para recoger células de la superficie caudodorsal de la vagina (23). Después de frotar suavemente la pared vaginal dorsal, se retiró el hisopo y se hizo rodar sobre un portaobjetos de vidrio (Objektträger ELKA, Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG, Sondheim, Alemania) (14). Se realizó una tinción rápida de rutina (Haema-Schnellfärbung, LT- Sys Eberhard Lehmann GmbH, Berlín, Alemania) después del secado al aire (14). Se fijó de forma permanente un cubreobjetos (Deckgläser 32^*22 mm, Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG, Sondheim, Alemania) (Roti Histokitt II, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemania) a la muestra (16). Se eligieron perras en diferentes etapas del ciclo estral, de manera que todos los tipos de células vaginales estuvieran representadas.

Para la digitalización, los portaobjetos teñidos se escanearon con Aperio CS2 (Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH Mikroskopie und Histologie, Wetzlar, Alemania). Los datos se convirtieron en archivos Aperio Scan Scope Virtual Slide (svs) y se analizaron utilizando el programa de software QuPath^®. QuPath^® es una plataforma de software de código abierto para el análisis de imágenes de diapositivas completas (27). El programa es capaz de mostrar las diapositivas con más de 400 × de aumento y permite medir el área y el diámetro de núcleos o células enteras. También se puede utilizar para etiquetar células específicas.

Estructura de la encuesta

Para llegar a los veterinarios especializados en reproducción de pequeños animales, se utilizó la lista de correo electrónico internacional «Café Reprod» con alrededor de 150 miembros (información personal del administrador de la lista, primavera de 2021) en todo el mundo para la distribución de la encuesta. No se envió ningún recordatorio. La encuesta estuvo abierta durante 3 semanas.

La encuesta constó de tres partes: En la primera parte, se ilustraron ocho imágenes de diferentes células vaginales. Se pidió a los participantes que definieran las células como células basales, células parabasales, células intermedias, células superficiales y células escamosas marcando una casilla (véase la figura 1).

En la segunda parte, se pidió a los participantes que respondieran a las siguientes preguntas escribiendo un breve texto libre: ¿Cómo se diferencia una célula parabasal de una célula intermedia? ¿Cómo se diferencia una célula intermedia de una célula superficial? ¿Cómo se diferencia una célula superficial de una escamas?

Por último, se realizaron preguntas sobre el trabajo práctico con citología vaginal y sobre algunos datos personales.

Desarrollo y validación de un tutorial para la determinación de células vaginales

Se analizó la información de los resultados de la encuesta y de la literatura científica. Sobre la base de esta información y de los frotis digitalizados, se revisaron y evaluaron definiciones que incluían parámetros específicos como el tamaño y la forma de las células, así como el tamaño y la forma del núcleo para todos los tipos de células epiteliales vaginales.

El tutorial fue diseñado como un diagrama de flujo que tiene como objetivo apoyar la determinación de las células vaginales caninas. Para una primera validación, se utilizaron cinco frotis vaginales. Los portaobjetos fueron elegidos por los autores con el fin de garantizar la presencia de todos los tipos de células epiteliales.

En cada diapositiva, el primer autor asignó los números del uno al 100 al 100 celdas mediante QuPath^®. Los criterios de inclusión para la selección de las células fueron una estructura clara y bien visible de la célula. Se excluyeron las células que se superponían con otras células o estructuras. Con la ayuda de un generador de números aleatorios (https://www.zufallsgenerator.net) se seleccionaron 20 celdas por diapositiva para la validación. Esto dio como resultado 100 células en total.

Las 100 células fueron evaluadas de forma independiente por cinco personas utilizando la misma computadora y el mismo material de apoyo. No se dio más información, por ejemplo, sobre el perro o la etapa del ciclo sexual. Los encuestados fueron seleccionados con el fin de representar evaluadores con diferentes niveles de experiencia. Por lo tanto, los evaluadores fueron dos estudiantes de medicina veterinaria en su 5º año, dos veterinarios que trabajaban en el campo de la reproducción de pequeños animales durante 12 y 24 meses, respectivamente, y un diplomado (ECAR) para la reproducción de pequeños animales. El primer autor supervisó el proceso, no participó en la evaluación y no influyó en la misma. Todos los evaluadores recibieron una lista con los números de las celdas a determinar, una versión Din A4 coloreada del tutorial (Figura 1) y un formulario con una tabla en la que se les pedía que documentaran el tipo de celda según el número de diapositiva y el número de celda.

Análisis estadístico

Se utilizó el Kappa de Fleiss, que mide la confiabilidad entre evaluadores entre más de dos evaluadores. Para el cálculo del Kappa de Fleiss en este proyecto se utilizó el lenguaje de programación R (https://www.r-project.org/).

Si n_ij es el número de evaluadores que asignaron el i-ésimo sujeto (i = 1, …, N) a la j-ésima categoría (j = 1, …, k), entonces el kappa de Fleiss se define como

Resultados

Los resultados de la encuesta

En total, 16 encuestados completaron y devolvieron la encuesta. La definición de las ocho celdas presentadas por los encuestados se presenta en la Figura 2.

La célula número uno fue definida como célula intermedia por nueve encuestados o como célula parabasal (n = 6) o basal (n = 1). Las celdas número dos, tres y cuatro fueron identificadas por la mayoría de los encuestados como células superficiales. La celda número cinco tuvo la mayor concordancia: todos los encuestados, excepto uno, la definieron como una celda escamosa. La definición de la célula número seis arrojó un resultado más ambiguo: nueve encuestados la definieron como célula intermedia, pero siete opinaron que se trata de una célula parabasal o basal. Ambas, las celdas número siete y ocho, fueron definidas como células intermedias por alrededor de la mitad de los participantes y como células superficiales por la otra mitad. El Kappa de Fleiss calculado para la concordancia de los 16 evaluadores fue κ= 0,412.

En la segunda parte, se preguntó a los encuestados cómo discriminaban entre los tipos de células. Para cada uno de los tres escenarios, los participantes nombraron al menos dos parámetros.

La primera pregunta fue cómo diferenciar una célula parabasal de una célula intermedia. Los parámetros más nombrados fueron el tamaño (n = 10) y la forma (n = 10) de las celdas. Nueve encuestados mencionaron la relación entre el núcleo y el citoplasma. La apariencia del núcleo (tamaño y forma) fue nombrada por siete y la cornificación por uno de los encuestados.

La segunda cuestión era cómo diferenciar una célula intermedia de una célula superficial. La forma (n = 11) y la apariencia del núcleo (n = 11) fueron los principales parámetros para la diferenciación de las células, seguidos por el tamaño de la célula (n = 7). Los parámetros de menor importancia parecen ser la relación citoplasma:núcleo (n = 5), la cornificación (n = 3) y el color de la célula (n = 2).

Finalmente, se preguntó a los participantes cómo diferencian una célula superficial de una célula escamosa. Los parámetros más nombrados fueron la presencia y apariencia del núcleo (n = 11). La forma (n = 3), el grado de cornificación (n = 2) y el tamaño (n = 1) tuvieron una influencia menor en la diferenciación de las células superficiales y escamosas. Algunos de los participantes afirmaron que no había diferencia entre los dos tipos de células (n = 3).

La tercera parte de la encuesta se refería al trabajo práctico y a la experiencia de los participantes. El número de perras que los participantes declararon ver en el contexto del momento de la ovulación por año es una mediana de 125 (rango intercuartílico 50-300).

La mayoría de las encuestadas indicaron que realizan citología vaginal en el contexto del momento de la ovulación (n = 13). Sin embargo, varias de las encuestadas afirmaron que la citología vaginal es «nada fiable» (n = 5) o «no fiable» (n = 6) en el contexto del momento de la ovulación. La minoría eligió la respuesta «Moderado» (n = 3) o la respuesta «Confiable» (n = 2). Todas las participantes estuvieron de acuerdo en que la medición de la progesterona para el momento de la ovulación es «Muy confiable» (n = 8) o «Confiable» (n = 8). Los encuestados utilizan inmunoensayos para la medición de la progesterona: Immulite^® (n = 8), Minividas^® (n = 3), TOSOH^® (n = 1), Hormonost^® ELISA kit (n = 3). En un caso no se dio respuesta.

Por último, se preguntó a los encuestados sobre su experiencia y persona. Los participantes han trabajado como veterinarios durante 24,1 (±10,2) años en promedio. Una de las encuestadas no especificó los años de práctica, pero escribió que había practicado «demasiado tiempo». Preguntados por el grado más alto que han alcanzado, los participantes eligieron «Veterinario» (n = 7), «Diplomado» (n = 6), «PhD» (n = 2) o «Especialista en reproducción» (n = 1). Trabajan en Estados Unidos (n = 7), Suecia (n = 2), Alemania (n = 1), Hungría (n = 1), Tailandia (n = 1), Bélgica (n = 1), Portugal (n = 1) y Australia (n = 1). Un participante declaró que trabajaba «en todo el mundo».

La estructura del tutorial

El tutorial (Figura 1) se desarrolló como un diagrama de flujo que permite seguir las líneas de flujo y evaluar los aspectos de la célula paso a paso. El objetivo era guiar al usuario a través de la evaluación de los parámetros relevantes de la celda. Para apoyar el proceso de decisión, se incluyeron imágenes de muestra. Estas imágenes se derivaron de las diapositivas digitalizadas. El tutorial para la evaluación de una célula vaginal comienza con la determinación del diámetro de la célula. Según varios autores, el diámetro máximo de una célula parabasal es de 20 μm. Para validar esta definición, se utilizaron frotis vaginales de 10 perras en anestro o proestro temprano. En cada espécimen se midieron 20 células con un diámetro menor de 20 μm y se analizaron con QuPath^®. Esto dio como resultado 200 células en total. Ninguna célula mostró cornificación o cambios en la apariencia del núcleo. Por lo tanto, la definición dada es adecuada y, por lo tanto, se incluyó en el tutorial.

Si el diámetro de la célula supera los 20,0 μm, el usuario sigue la línea de flujo hasta el cuadro de decisión «Paso 2: Grado de cornificación». En el paso 2, el usuario puede decidir entre las líneas de flujo «ninguna o ligeramente» y «moderada a significativa». Estas líneas de flujo conducen a la casilla de decisión «Paso 2.a.: Tamaño del área nuclear» o a la casilla de decisión «Paso 3.a.: Visibilidad del núcleo», respectivamente. Para estandarizar esta decisión sobre el grado de cornificación, todas las celdas sin o con una sola línea de cornificación deben determinarse como celdas sin cornificación o con poca cornificación (Figura 3).

La casilla de decisión 2.a. se refiere al tamaño del núcleo. Según los autores antes mencionados, el área del núcleo de una célula intermedia es grande, redonda e inalterada. El núcleo de las células superficiales se hace más pequeño. Nuestro objetivo fue definir un área que permitiera una adecuada diferenciación de las células intermedias de las superficiales en al menos el 95% de los casos. Para definir un umbral preciso, se seleccionaron frotis vaginales de 10 perras en proestro tardío o celo. En cada espécimen, se midieron y analizaron los núcleos de 20 células con al menos dos líneas de cornificación y un núcleo definible y demarcado = definido como células superficiales (ver Figura 2). Esto dio como resultado 200 núcleos en total. Las mediciones revelaron un valor medio de 57,7 μm² (±13,8 μm²) para el área de los núcleos medidos. Los resultados de las mediciones del área del núcleo se muestran en la Figura 4. La mayoría (95 %) de los núcleos de las células vaginales cornificadas son menores de 79,5 μm². Por lo tanto, se seleccionó el valor de 79,4^μm2 como umbral para el área máxima del núcleo de una célula superficial. Por lo tanto, si el área del núcleo es de 79,5 μm² o más, la célula se clasifica como célula intermedia. Si el núcleo tiene un área de 79,4^μm2 o menos, el usuario debe seguir la línea de flujo hasta la casilla de decisión 3.a. y la célula queda excluida de ser una célula intermedia.

La casilla de decisión 3.a. se refiere a la visibilidad del núcleo. Si la célula no tiene núcleo visible, la célula se clasifica como célula escamosa. Si el núcleo sigue siendo identificable, la línea de flujo conduce a la casilla de decisión 3.b. En este caso, hay que determinar el grado de degeneración del núcleo. Si «el núcleo es definible, delimitado y hay una diferencia de color entre el núcleo y el citoplasma» la célula se clasifica como una célula superficial. De lo contrario, si «el núcleo está erosionado y apenas es visible», la célula se clasifica como una célula escamosa.

La evaluación independiente de 100 células vaginales seleccionadas al azar por cinco personas que utilizaron el tutorial condujo a un Kappa de Fleiss de κ = 0,858.

Discusión

La citología vaginal en perros y su utilidad y limitaciones han sido objeto de controversia recientemente (15). Por un lado, este método diagnóstico ha sido descrito como una herramienta clínica valiosa en el contexto de los exámenes ginecológicos (12) pero, por otro lado, la usabilidad de este método puede ser baja para la detección del momento ideal para el apareamiento o la inseminación (5, 16). Otros autores afirman que la citología vaginal permite el momento de la ovulación solo retrospectivamente (13, 26). Con respecto a estas diferentes opiniones, parece que vale la pena evaluar críticamente este supuesto método probado y comprobado, como sugiere Fontbonne para muchos procedimientos bien probados (28).

Varios factores pueden impedir la fiabilidad de la citología vaginal, que incluyen características celulares individuales de la perra, como un porcentaje variable de células anucleares en el momento de la ovulación (29) o una afluencia de otras células como neutrófilos (1) o eritrocitos (5).

Además, los diferentes métodos de toma y tinción de los frotis, así como la ausencia de métodos de evaluación estandarizados, pueden dar lugar a variabilidad en la interpretación (15, 26). Algunos autores recomiendan tomar muestras del vestíbulo vaginal. Las ventajas de este procedimiento pueden incluir la reducción del riesgo de contaminación de la vagina o traumatismo, así como menos reacciones de defensa de las perras sensatas si los hisopos no se insertan en las partes más craneales de la vagina (19). Otros autores no recomiendan tomar la muestra del vestíbulo vaginal porque sus células no reaccionan tan rápidamente a un aumento de la concentración de estrógenos en sangre como la mucosa vaginal (11) y, por lo tanto, no son tan indicativas de la etapa del ciclo estral (7). Todavía no se ha aclarado si el uso de un espéculo mejora la fiabilidad de la citología vaginal y qué método de tinción conduce a los resultados de evaluación más sólidos (15). También se debe discutir la tinción de las células con diferentes tinciones. Diff Quick es una tinción de Wright-Giemsa rápida y modificada que es fácil de usar en un entorno clínico (16) y ampliamente utilizada para frotis vaginales (15). Por lo tanto, este tinte se utilizó para este proyecto. Otras tinciones como la de Papanicolaou o la de Shorr (Papanicolaou modificada) son capaces de detectar células eosinofílicas tiñéndolas de color rojo anaranjado (4). Esto simplifica la identificación de las células superficiales (4). Sin embargo, estos tintes no se utilizan ampliamente en la práctica debido a los altos costos y los requisitos de tiempo (15). Si los resultados de nuestro proyecto hubieran sido diferentes con otras tinciones abiertas permanecer.

Además, parece que una razón importante para la baja fiabilidad es la ambigüedad de las definiciones de diferentes autores para las células vaginales. Arlt (15) ha mostrado resultados muy variables en la evaluación del frotis vaginal, probablemente causados por una evaluación subjetiva.

Para la preparación de nuevas definiciones celulares, se analizó la literatura científica y las opiniones de expertos que revelaron información interesante sobre los peligros y las trampas de la citología vaginal. Para la distribución de la encuesta se eligió la lista de correo electrónico de Café Reprod para llegar a los participantes con un alto nivel de experiencia en reproducción de pequeños animales. De hecho, 16 encuestados no pueden considerarse representativos. Sin embargo, según sus declaraciones, la mayoría eran veterinarios bastante experimentados en el campo de la reproducción de pequeños animales. Se puede suponer que es necesario tener en cuenta un sesgo de selección, es decir, que las personas más interesadas en la citología vaginal probablemente tenían más probabilidades de participar en la encuesta. En ese sentido, los resultados de la encuesta son aún más sorprendentes. La concordancia de los evaluadores en cuanto a la definición de las células vaginales fue de alrededor de κ = 0,4. Esto significa un acuerdo deficiente. Un valor de 0,0 indica una concordancia no mejor que la probabilidad, valores inferiores a 0,40 indican una concordancia pobre, una concordancia superior a 0,75 buena y una concordancia perfecta de 1,0 (30).

Las participantes afirmaron que la determinación celular tiene un bajo nivel y la medición de progesterona tiene una alta fiabilidad en el contexto del momento de la ovulación. Sin embargo, todavía 13 de cada 16 realizan citología vaginal de forma rutinaria. Arlt (15) encontró resultados similares en una encuesta similar. Al utilizar ambos métodos, los veterinarios pueden confiar más en la medición de la progesterona que en la citología vaginal porque es más fácil y rápida de interpretar. El esfuerzo en la evaluación e interpretación de los frotis vaginales y, por lo tanto, la experiencia y la rutina para hacerlo pueden haber disminuido entre los profesionales. Esto, a su vez, puede ser una razón por la que la determinación de las células vaginales exfoliadas se considera poco fiable. Se planteó la cuestión de si los evaluadores más experimentados pueden tener una variación más baja. Por lo tanto, solo los evaluadores que declararon examinar más de 100 perras por año se incluyeron en una evaluación de subgrupos. Esto llevó a un Kappa de Fleiss de κ = 0,533, lo que significa un acuerdo moderado. Este análisis sugiere que las variaciones entre los evaluadores pueden disminuir con el aumento de la experiencia.

Sin embargo, cabe mencionar que los evaluadores no evaluaron la etapa del ciclo estral con base en un frotis completo en este proyecto. Se les pidió que nombraran células vaginales individuales.

Parece que algunos tipos de células son más fáciles de determinar que otras. Las células angulares, cornificadas con un núcleo definible o sin núcleo visible son mejor asignables para los evaluadores, casi independientemente del nivel de experiencia. Sin embargo, las células con una forma ovalada a poligonal, un núcleo vesicular y grande y sin o poca cornificación parecen ser difíciles de definir, incluso para los expertos. Una posible explicación para este resultado podría ser que la evaluación basada en la cornificación y un núcleo que desaparece o picnótico es más fácil de reconocer que la evaluación basada en el tamaño de una célula y un núcleo, ya que existe una escala necesaria. Además, la determinación de células como células basales por parte de varios encuestados, independientemente de su nivel de experiencia, parece destacable por su dudosa ocurrencia en un frotis vaginal. La caracterización de las células basales parece obsoleta según varios autores, ya que estas células construyen la capa más baja de la membrana mucosa (5, 10, 16) y, por lo general, no se pueden recolectar con un hisopo sin dañar el epitelio vaginal. Por lo tanto, este tipo de célula no está incluida en este proyecto.

Para mejorar la fiabilidad de la citología vaginal, pueden ser útiles los procedimientos quirúrgicos estándar para la interpretación de los frotis vaginales (15). En 1967, Schutte publicó una clasificación de las células vaginales. Asignó las celdas a los grupos A a D (19). Las limitaciones de esta clasificación incluyen los umbrales generalizados para el diámetro nuclear. Por ejemplo, Schutte afirmó que el diámetro de una célula intermedia grande oscila entre 7 y 11 μm y que el diámetro de una célula superficial es inferior a 6 μm. No se dio una definición de células con un diámetro nuclear entre 6,0 μm y 6,9 μm. Además, algunas definiciones como «la célula intermedia pequeña tiene un núcleo relativamente grande» no eran precisas. Cabe destacar, sin embargo, que la clasificación de Schutte se publicó hace 55 años y no tenía las mismas posibilidades técnicas para escanear y medir las células vaginales que tenemos hoy. En este proyecto se combinaron opiniones y experiencias de diferentes autores y expertos, así como mediciones realizadas con el programa QuPath^®. El tutorial tiene como objetivo apoyar a los evaluadores que analizan y definen las células vaginales. La evaluación de la tutoría con evaluadores experimentados y no experimentados condujo a una alta concordancia entre observadores. El κ de Fleiss-Kappa = 0,858 puede interpretarse como una buena concordancia. Una limitación de este proyecto es que solo cinco evaluadores probaron el tutorial hasta ahora. Dado que dos estudiantes utilizaron el tutorial con buenos resultados, se puede postular que el tutorial es fácil de usar y admite la determinación de las celdas también para los no expertos. Un punto discutible es que las celdas de la evaluación no fueron determinadas por los evaluadores de antemano sin el tutorial. Sin embargo, se puede suponer que un cierto efecto de entrenamiento habría sesgado un examen de control, especialmente si el tutorial se hubiera ofrecido antes de una evaluación no tutorial. Otra limitación de este proyecto es la aplicabilidad y practicidad de la tutoría en la práctica diaria, que debe ser probada en futuros estudios. El esfuerzo de las mediciones de las células bajo el microscopio se ha descrito como lento e inadecuado (22). Esto también se aplica al proceso de digitalización. La medición del tamaño de las células o núcleos puede ser difícil y llevar mucho tiempo. Sin embargo, el uso regular de la tutoría puede conducir a un cierto efecto de entrenamiento, que también se observó durante las evaluaciones durante este proyecto.

Si el tutorial es útil en el contexto del momento de la ovulación, debe evaluarse más a fondo en estudios futuros. En el contexto de este proyecto, la atención se centró en la definición de células. No se evaluaron los patrones celulares en relación con la ovulación o en el contexto de trastornos ginecológicos específicos. Para limitar el sesgo relacionado con la raza, los autores se esforzaron por una diversidad preferiblemente amplia de razas (n = 27).

Hasta la fecha, el proceso de escaneo de una diapositiva para este proyecto duraba unos 20 minutos. El tamaño del archivo de los datos de una mancha escaneada era de dos a tres gigabytes. La calidad de la exploración depende en gran medida de la calidad del frotis. Especialmente los especímenes de perras en anestro o proestro temprano a menudo incluyen solo unas pocas células pequeñas en comparación con los especímenes de perras en celo y diestro temprano. En consecuencia, el escáner tiene menos áreas en las que enfocarse y el resultado pueden ser escaneos digitales menos nítidos. Otras variables, como la tinción inconsistente y el bajo contraste de color, las células plegadas, las burbujas de aire y las partículas, también pueden dar lugar a exploraciones de baja calidad. Si bien los evaluadores humanos pueden compensar estas limitaciones hasta cierto punto «leyéndolas» (31), una evaluación automatizada de diapositivas podría no conducir a resultados apropiados. Por lo tanto, la recolección precisa de las células y la preparación de los portaobjetos, incluida la aplicación adecuada del material de las células, la fijación correcta de los cubreobjetos, la limpieza de los portaobjetos antes de escanear, son requisitos importantes para un resultado exitoso del proceso de escaneo (32). Por lo tanto, hasta la fecha, los procedimientos de escaneo y medición presentados no se pueden utilizar en la práctica diaria. En la práctica, las escalas en el ocular de los microscopios pueden omitir la necesidad de digitalizar los frotis. Los parámetros del tutorial se pueden seguir utilizando. Si una evaluación aproximada de diámetros y tamaños conduce a buenos acuerdos, debe probarse en estudios futuros.

Las ventajas de la microscopía digital, como el acceso remoto y externo a los portaobjetos digitalizados, la facilidad de manejo, la ergonomía mejorada y las mediciones cuantitativas son evidentes (33). Ya se dispone de nuevos microscopios, que permiten una fácil digitalización y conexión a ordenadores o dispositivos móviles, y cabe esperar que experimenten un rápido desarrollo. Por lo tanto, es probable que en un futuro próximo sean posibles nuevos procedimientos de medición o incluso evaluaciones celulares automatizadas. El escaneo parcial de frotis con un número mínimo de celdas para disminuir la duración del proceso de escaneo y el tamaño del archivo podría aumentar la practicidad. Una determinación más estandarizada de los frotis vaginales y las tecnologías emergentes de digitalización pueden conducir a un uso más fiable de la citología vaginal. Otro escenario podría ser una evaluación automatizada de frotis vaginales mediante inteligencia artificial (IA). Existe un gran interés público y fuerzas del mercado que están impulsando el rápido desarrollo de estos procedimientos de diagnóstico (34). También en situaciones difíciles de dotación de personal en el sitio, como la pandemia de COVID 19, la microscopía digital puede ser una herramienta importante para mantener los flujos de trabajo de histología funcionando sin problemas (35). Algunos estudios han demostrado que la IA es incluso parcialmente superior a los expertos humanos en citología, concretamente en la determinación de células neoplásicas frente a células normales (36). Sobre la base de la IA, son posibles procedimientos de diagnóstico estandarizados que minimizan el sesgo de la experiencia de los evaluadores, el equipo de laboratorio y otros factores. Las posibles consecuencias positivas pueden incluir la reducción de los costes y un diagnóstico más precoz (37). En patología digital, ya se ha afirmado que el análisis computarizado de la muestra basado en IA tiene el potencial de reducir las tareas laboriosas, al tiempo que minimiza la variabilidad interobservador y maximiza la reproducibilidad (38). Hoy en día, la IA también se puede utilizar de forma rutinaria para el cribado fecal de infecciones parasitarias. Los escáneres capturan automáticamente imágenes de las muestras y las cargan en una nube donde las imágenes se procesan y analizan en busca de huevos de parásitos intestinales. Todo el proceso es comparable o incluso más rápido que el tiempo de preparación de las pruebas convencionales de flotación fecal y condujo a resultados agradables en comparación entre el sistema de escáner y los exámenes de los parasitólogos (39). Sobre la base de estos avances, parece realista que el análisis informático de los frotis vaginales junto con definiciones fiables de los tipos celulares sea posible en un futuro próximo. Potencialmente, la utilidad de la citología vaginal puede mejorarse y debe ser reevaluada en el contexto de la detección de trastornos ginecológicos y el momento de la ovulación. Se requiere más investigación para estudiar si la IA es útil para la evaluación de frotis vaginales. Además, es necesario probar si esto permitirá una determinación más precisa de la etapa del ciclo. Si la ovulación exacta es predecible mediante una evaluación objetiva basada en este tutorial debe evaluarse en estudios posteriores.

Conclusión

La citología vaginal es una herramienta útil para la estadificación del ciclo y el manejo de la reproducción de perras debido a sus rápidos resultados y fácil aplicación. Sin embargo, el evaluador debe seguir procedimientos de determinación estandarizados para obtener resultados objetivos y repetibles. A ese respecto, se elaboraron definiciones revisadas de las células y un tutorial. En pasos futuros, nuestro objetivo es desarrollar métodos para el análisis informático de frotis vaginales.

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo/material complementario, las consultas adicionales pueden dirigirse al autor correspondiente.

Declaración de Ética

El estudio en animales fue revisado y aprobado por la Dra. Mechthild Wiegard; Comisario de Ética de la Freie Universität Berlin. No se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para participar porque se renunció al consentimiento informado por escrito para este estudio, ya que todos los frotis vaginales se tomaron durante el examen ginecológico en el contexto del momento de la ovulación o el control de salud ginecológica de rutina por parte de expertos capacitados.

Contribuciones de los autores

FR y SA contribuyeron a la concepción y diseño del proyecto y escribieron el manuscrito. FR organizó la base de datos, la encuesta y el diagrama de flujo. RK tuvo un papel consultivo y digitalizó los frotis vaginales. VB realizó el análisis estadístico. Todos los autores contribuyeron a la revisión del manuscrito, leyeron y aprobaron la versión enviada.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Reconocimientos

Los autores quieren agradecer a todos los participantes de la encuesta y a los evaluadores que probaron el tutorial. Además, estamos muy agradecidos por la ayuda, los consejos y la paciencia de Lisa Riege y Johanna Leber.

Referencias