Introducción

Los problemas de salud gastrointestinal en los pollos han sido un impedimento importante para el rápido progreso de la cría de aves de corral, con gastritis glandular y muscular cada vez más prevalente en la avicultura (1). Esta enfermedad puede provocar el agrandamiento de los estómagos glandulares y musculares, así como otros cambios patológicos asociados a la gastritis. En la autopsia, los pollos afectados por esta afección presentan un notable agrandamiento de los estómagos glandulares y musculares, ablandamiento y desaparición de las papilas gástricas y ulceración de la mucosa gástrica. En casos graves, también puede presentarse con síntomas como hemorragia de la mucosa gástrica (2). Cuando los estómagos musculares y glandulares de los pollos sufren daños patológicos, puede provocar alteraciones en el sistema digestivo y la consiguiente disfunción en todo el cuerpo. Los principales síntomas de los pollos enfermos son un crecimiento lento, demacración evidente, disminución de la eficiencia de utilización del alimento, heces acuosas amarillas y algunas heces que contienen alimento no digerido (3).

No existe una estacionalidad y regionalidad obvias en la ocurrencia de gastritis glandular y muscular, y afecta a los pollos en todo el país durante todo el año. La etiología de esta enfermedad es compleja y no existe un diagnóstico ni tratamiento preciso en la actualidad. Varios agentes han sido implicados como posibles causas. Las causas no infecciosas incluyen micotoxinas (4), aminas biógenas (5) y alto nivel de cobre en la dieta (6). Los agentes infecciosos que han sido implicados incluyen la infección por clostridium (7), la infección por el virus de la necrosis proventricular del pollo (8) y la infección por el virus de la bursitis infecciosa (9). El diagnóstico de esta enfermedad se basa únicamente en las manifestaciones clínicas y el examen postmortem para observar los cambios patológicos en el estómago glandular y el estómago muscular. Por lo tanto, es urgente establecer un modelo de gastritis glandular y muscular replicable en pollo que sea compatible con las manifestaciones clínicas de este síntoma. Este modelo facilitaría enormemente la prevención y el tratamiento de esta enfermedad.

El ácido acético, el polietilenglicol y el cloruro de amonio son reactivos orgánicos comunes que pueden causar daño al tracto gastrointestinal. Las investigaciones científicas han corroborado que la ingestión de agua que contiene polietilenglicol y cloruro de amonio puede inducir lesiones en la mucosa y ulceración en el estómago glandular y el estómago muscular de los pollos (10). El ácido acético tiene un efecto corrosivo que puede dañar directamente la función de barrera de la mucosa gástrica e intestinal, lo que conduce a la formación de úlceras. Se usa comúnmente en el establecimiento de modelos animales para colitis ulcerosa y úlceras gástricas (11, 12). El polietilenglicol (PEG) es un compuesto de poliéter que no se puede digerir ni fermentar. Como posible laxante, la administración oral de PEG puede aumentar el volumen de líquido presente en el intestino (13, 14). El cloruro de amonio es irritante y corrosivo, causando daños a la mucosa gastrointestinal. El ruibarbo, una medicina tradicional china categorizada como amarga y fría, puede dañar la función de barrera de la mucosa gástrica con el uso a largo plazo. Se usa comúnmente para establecer modelos animales de diarrea crónica y síndrome de deficiencia de bazo (15). Anteriormente, realizamos un análisis comparativo sobre la eficacia de estos reactivos para modelar la gastritis glandular y muscular en pollos, lo que resultó en la adquisición exitosa de patentes (16).

Actualmente, no hay ningún informe publicado sobre el establecimiento de un modelo de pollo para este síntoma. Por lo tanto, nuestro objetivo es establecer un modelo de gastritis en pollo con FPS mediante la combinación de varias dosis de polietilenglicol, cloruro de amonio y ruibarbo. A través de la detección de métodos de modelado óptimos, nuestro objetivo es sentar las bases para una mayor investigación sobre el mecanismo de este síndrome y el desarrollo de mejores estrategias de tratamiento para este tipo de síndrome.

Materiales y métodos

Establecimiento del modelo y agrupamiento de pollos

Se obtuvieron veinticuatro pollos SPF de 40 días del centro de animales del Laboratorio Shandong Haotai. Los pollos se sometieron a un período de aclimatación de 1 semana antes del inicio del experimento. El ruibarbo utilizado en este estudio fue comprado a Jianlian Traditional Chinese Medicine Co., Ltd en Jinan, Shandong, China, y fue autentificado por el Prof. Zhongli Huang de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong. El ruibarbo se remojaba en agua destilada en una proporción de 10 veces su peso durante 1 h, seguido de una decocción durante 1,5 h. Se recogieron todos los filtrados y el residuo se sometió a decocción dos veces. Todos los filtrados se mezclaron y condensaron a una concentración de 1,00 g/mL (fármaco crudo). Se prepararon soluciones de polietilenglicol, cloruro de amonio, ácido acético y ruibarbo añadiéndolas al agua en concentraciones apropiadas antes de construir el modelo. Después de un período de adaptación de 7 días, 24 pollos se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: seis pollos del grupo M1 fueron alimentados con polietilenglicol (1,0%) y cloruro de amonio (0,5%), seis pollos del grupo M2 fueron alimentados con ácido acético (2,0%) y ruibarbo (750 mg/kg de peso corporal), seis pollos del grupo M3 fueron alimentados con polietilenglicol (1,0%) y ruibarbo (750 mg/kg de peso corporal), y seis pollos sirvieron como grupo de control y fueron alimentados con agua esterilizada. Todo el proceso de moldeo duró 14 días. Al final del experimento, los pollos fueron inyectados por vía intravenosa con una solución de pentobarbital sódico a una dosis de 50 mg/kg de peso corporal y luego sacrificados por exanguinación. Cada grupo se repitió tres veces. El procedimiento de experimentación con animales fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Avícola de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong (SAAS; Número de homologación: JQS-2023-07).

Medición de indicadores clínicos

Los signos clínicos como el estado mental, la morfología de las heces y el color se registraron en detalle durante el experimento. Los pollos fueron evaluados mediante una puntuación semicuantitativa basada en sus síntomas clínicos (Tabla 1). El establecimiento exitoso del modelo de gastritis glandular y muscular se juzgó en base a criterios específicos. Por ejemplo, un pollo enfermo muestra un mal estado mental y tiene heces blandas con un tono amarillo mezclado con residuos de alimento no digeridos. El examen histológico revela estómagos glandulares hipertróficos, paredes engrosadas del estómago glandular, mucosa gástrica glandular edematosa y papilas gástricas glandulares agrandadas y prominentes. En casos graves, el estómago glandular puede mostrar papilas borrosas o presentar sangrado ulcerativo. El color del estrato córneo muscular del estómago se aclara a un tono amarillo pálido, con una superficie áspera y sin brillo. Además, se pueden observar focos de úlceras dispersos de diferentes tamaños y formas irregulares en su superficie, con ulceraciones más grandes que aparecen debajo del estrato córneo. No se detectan alteraciones patológicas perceptibles en otros órganos (16). La construcción exitosa de pollos con gastritis glandular y muscular se puede inferir si se observan las características antes mencionadas en el grupo modelo. La puntuación alta o baja refleja la gravedad de la enfermedad. El peso corporal se midió al inicio del modelado (día 1), a la mitad del modelado (día 7) y al final del modelado (día 14) para calcular el efecto del moldeo en la tasa de aumento de peso. La temperatura corporal de cada grupo se midió al inicio y al final del modelado. Al final del moldeado, se extrajeron los estómagos glandulares y musculares y el duodeno para un examen macroscópico para evaluar el sangrado y la ulceración. Los órganos principales, como el bazo, la bolsa de Fabricio y el timo, se pesan para calcular el peso relativo del órgano.

Tabla 1. Evaluación semicuantitativa de las manifestaciones clínicas del pollo con FPS.

Ensayos histopatológicos

Los estómagos glandulares y musculares, así como el duodeno, se recolectaron inmediatamente después de que los pollos fueron sacrificados. Los órganos se cortaron en trozos pequeños con un bisturí y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 2 días para desnaturalizar y solidificar las proteínas en el tejido. El tejido fijado se recortó, deshidrató, se transparentó, se incrustó y se cortó, y luego las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) utilizando los protocolos estándar. Se examinaron tres secciones aleatorias teñidas con HE por espécimen bajo un microscopio (BX43F; Olimpo, Tokio, Japón).

Detección de citocinas séricas

Se recogieron muestras de sangre del corazón en tubos de vacío sin anticoagulante para la recogida de suero para experimentos posteriores. Los niveles de IL-2, IL-4 y α-amilasa en el suero de pollos con FPS se detectaron utilizando un kit ELISA (Jiyinmei Science and Technology Co Ltd. Wuhan, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió la densidad óptica (DO) a 450 nm para obtener los valores de la muestra.

Secuenciación de amplicones de ARNr 16S y procesamiento de secuencias

Después del experimento, se recogieron muestras de contenido cecal de pollos e inmediatamente se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido antes de almacenarse a -80 °C para su posterior aislamiento del ADN bacteriano. El ADN total de cada muestra se extrajo mediante el método CTAB, como se describió anteriormente (17). La cantidad y la calidad del ADN extraído se analizaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop Lite (Thermo Scientific, EE. UU.). A continuación, utilizando el ADN extraído como plantilla de PCR, la región V3-V4 del gen 16S rRNA se amplificó mediante PCR con cebadores universales forward 338 F y reverse 806 R. El volumen de reacción de la PCR fue de 25 μL, conteniendo 12,5 μL de tampón mixto de PCR, 1 μL de cada cebador (338 F hacia adelante y 806 R hacia atrás), 20 μg de ADN y dd H (2)O hasta 25 μL. Las condiciones de PCR fueron de 98 °C durante 10 s, seguidas de 30 ciclos de 98 °C durante 5 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, con una extensión final de 72 °C durante 10 min. Los productos de PCR se purificaron con un kit de extracción de gel Qiagen. La biblioteca de secuenciación se preparó utilizando el kit de preparación de muestras sin PCR de ADN Illumina TruSeq. La secuenciación se realizó en la plataforma Illumina NovaSeq para una secuenciación de extremos pareados de 2 × 250 pb.^®

Los datos brutos de la secuencia se procesaron utilizando QIIME2 (18). Brevemente, la secuencia de cebadores en las lecturas fue eliminada por la canalización de Cutadapt. La variante de secuencia de amplicones (ASV) y la tabla ASV fueron generadas por la canalización DADA2 con los parámetros predeterminados (19). La clasificación taxonómica de cada ASV se anotó alineando la secuencia del ASV con la base de datos SILVA (versión 132). Los ASV clasificados en mitocondrias y cloroplastos se eliminaron manualmente. La predicción de la función del metagenoma se realizó mediante PICRUSt2 basado en la tabla ASV (20).

Análisis estadístico

Llevamos a cabo un análisis de rarefacción de los números de ASV capturados por lecturas crecientes dentro de cada muestra. Los índices de Shannon y Chao1 se calcularon utilizando la función alfa de diversidad QIIME de QIIME2. Las diferencias en los índices entre los dos grupos se analizaron mediante la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon. El análisis de coordenadas principales (PCoA) y el análisis de escalamiento multidimensional no métrico (NMDS) se realizaron utilizando el paquete Vegan en R. Para la red de co-ocurrencia ASV-a-AVS, los coeficientes de correlación se calcularon utilizando el algoritmo SparCC (https://github.com/scwatts/fastspar). La significación estadística de las correlaciones se calculó a partir de 1.000 iteraciones de bootstrap. La red se editó y visualizó utilizando Cytoscape v3.6.0 en base a coeficientes de correlación. Las propiedades y la clasificación de los módulos de la red se analizaron utilizando el paquete igraph en R. La prueba de Mantel se realizó utilizando el paquete linkET en R. El marcador ASV o función de cada grupo se detectó mediante análisis de tamaño del efecto de análisis discriminante lineal (LefSe).

Resultados

Construcción de glándula y modelo de gastritis muscular en pollo con FPS

Cambios en los síntomas clínicos en los pollos con FPS

En el primer día del experimento, todos los pollos estaban sanos, con un buen estado mental, plumas limpias y lustrosas, y temperatura corporal normal. Para el día 14, los pollos del grupo de control permanecían sanos, mientras que los de otros grupos experimentales mostraban un mal estado mental y heces sueltas con alimento sin digerir. En cada grupo modelo se encontraron lesiones glandulares y musculares de estómago, así como duodenales, caracterizadas por un agrandamiento del estómago glandular, úlcera en el estómago muscular, inflamación catarral y sangrado de la mucosa gástrica (Figura 1). Los síntomas clínicos específicos de los pollos de cada grupo se presentan en la Tabla 2. De acuerdo con esta puntuación de síntomas clínicos, se observó que la tasa de éxito del modelado fue del 100% en los grupos M2 y M3, con síntomas más graves en comparación con el grupo M1, que tuvo una tasa de éxito del modelado del 86,33% y síntomas relativamente leves en general. Como se muestra en la Figura 2, la temperatura corporal de los pollos en el grupo de control se mantuvo dentro del rango normal. Por el contrario, la temperatura corporal de los pollos de los otros grupos fue ligeramente inferior el día 14. El aumento de peso de los pollos en cada grupo fue gradual, pero la tasa de aumento de peso de los pollos en todos los grupos modelo fue significativamente menor que la del grupo de control. Los pollos con FPS en el grupo M3 tuvieron la tasa de ganancia de peso más baja (Figura 2A). En comparación con el grupo de control, la relación entre el timo y las bolsas de peso de Fabricius y el peso corporal en cada grupo modelo aumentó significativamente, mientras que la relación entre el peso del bazo y el peso corporal disminuyó. La relación entre el estómago glandular y muscular y el peso corporal en los grupos M2 y M3 fue ligeramente inferior a la del grupo control, mientras que fue ligeramente superior en el grupo M1 que en el grupo control (Figura 3). El índice de bazo del grupo de intervención fue menor que el del grupo control, mientras que el índice de timo fue mayor que el del grupo control (Figura 3). Estos resultados indicaron que los tres métodos establecieron con éxito un modelo de pollo con gastritis glandular y muscular, y el método de polietilenglicol combinado con ruibarbo tuvo el mejor efecto.

Figura 1. Daño patológico de los órganos principales. (A-D) Resultados anatomopatológicos del estómago glandular y del estómago muscular en pollos de cada grupo. (E-H) Resultados patológicos del duodeno en pollos de cada grupo. La flecha roja indica las úlceras en el músculo estomacal y las hemorragias de la mucosa gástrica. Las flechas azules indican la distensión intestinal.

Tabla 2. Estadísticas de puntuación clínica de pollos con FPS.

Figura 2. Cambios en la temperatura corporal y la tasa de aumento de peso de los pollos en todos los grupos durante el experimento. (A) Temperatura corporal. La temperatura se mantuvo dentro del rango normal en el grupo de control durante todo el transcurso del experimento. Los otros grupos mostraron una ligera disminución de la temperatura corporal el día 14. (B) Tasa de aumento de peso. Los pesos aumentaron gradualmente en cada grupo durante todo el transcurso del experimento. La tasa de ganancia de peso de cada grupo experimental fue menor que la del grupo control.

Figura 3. El índice de órganos principales de los pollos en los grupos de control e intervención. (A) Índice de timo. (B) Índice del bazo. (C) Índice glandular y muscular del estómago.

Cambios de citoquinas inflamatorias en el suero de los pollos con FPS

Los resultados del ELISA indicaron que la expresión de IL-4 y α-amilasa disminuyó, mientras que la IL-2 aumentó en los grupos modelo (Figura 4). Además, el efecto de intervención de los grupos M2 y M3 fue mejor que el del grupo M1. Como se muestra en la Figura 4B, el contenido de IL-4 en los grupos M2 y M3 fue significativamente menor que en el grupo control, pero no hubo diferencias obvias entre los dos grupos. El contenido de α-amilasa en los grupos M2 fue significativamente menor que en el grupo control, mientras que el cambio de α-amilasa en el grupo M1 y en el grupo M3 no fue significativo (Figura 4C). Estos resultados sugirieron que el modelo de pollo de gastritis glandular y muscular exhibe un aumento de la inflamación.

Figura 4. El contenido de citoquinas inflamatorias en suero. (A) Interleucina (IL)-2, (B) IL-4, (C) α-amilasa.

Cambios histopatológicos de los órganos principales en los pollos con FPS

El examen histopatológico reveló que no se observaron anomalías evidentes en los órganos de los pollos del grupo control. Aun así, se observaron daños en el estómago glandular y muscular, así como en el duodeno, en los grupos modelo (Figura 5).

Figura 5. Cambios histopatológicos de los órganos principales. (A-D) Resultados histológicos del estómago glandular en pollos de cada grupo. (E-H) Resultados histológicos del estómago muscular en pollos de cada grupo. (I–L) Resultados histológicos del duodeno en pollos de cada grupo. El aumento original para A-H era de 100× y el aumento original para I-L era de 40×.

El examen histopatológico no reveló anomalías evidentes en el estómago glandular y muscular y en el duodeno de los pollos del grupo control. Sin embargo, se observaron diversos grados de lesiones en los órganos de los grupos modelo (Figura 5). Se observó desprendimiento de vellosidades en el estómago glandular de todos los grupos modelo, con hemorragia mucosa específicamente detectada en el grupo M3 (Figuras 5A-C). El grupo M1 presentó edema y ulceración debajo del estrato córneo del estómago muscular. Se observó hemorragia leve e infiltración de células inflamatorias debajo del estrato córneo del estómago muscular en el grupo M2. Por el contrario, se encontró un desprendimiento extenso del estrato córneo en el estómago muscular del grupo M3 (Figuras 5E-G). El desprendimiento de vellosidades fue evidente en las muestras de duodeno de los grupos M1 y M3, mientras que el edema serosano se produjo específicamente en las muestras de duodeno del grupo M2 (Figuras 5I, G, K).

Diversidad de la microbiota intestinal del pollo en los grupos de control e intervención

Realizamos un análisis de secuenciación de amplicones para evaluar el impacto de diversas intervenciones en la microbiota intestinal de pollos. De todas las muestras se obtuvieron un total de 865.076 lecturas. Después del control de calidad, se utilizaron 725.226 lecturas limpias para generar 1.655 ASV. El análisis de rarefacción reveló que todas las curvas de rarefacción alcanzaron una meseta (Figura 6A), lo que indica que las lecturas secuenciadas fueron suficientes para representar el número de ASV en diferentes muestras.

Figura 6. Diversidad microbiana intestinal en grupos control e intervención. (A) Se utilizó el análisis de la curva de rarefacción para mostrar la cantidad secuencial de cada grupo. (B) Índice de Shannon mediante la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon de diversidad alfa. (C) Índice Chao1 mediante la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon de diversidad alfa. (D) PCoA de la diversidad beta de los niveles del filo. (E) PCoA de la diversidad beta de los niveles de género.

Se utilizaron los índices de Shannon (Figura 6B) y Chao1 (Figura 6C) para caracterizar la diversidad microbiana en diferentes grupos. La prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon mostró una diferencia significativa en la diversidad entre los tres grupos del modelo (p < 0,05). Los índices de Shannon y Chao1 fueron más altos en el grupo M1, seguido por los grupos M3 y M2. En comparación con el grupo de control, los índices de Shannon y Chao1 en los tres grupos de intervención fueron significativamente más bajos. Estos resultados indicaron que las intervenciones redujeron la diversidad de la microbiota intestinal de los pollos, y que los efectos de las diferentes intervenciones fueron divergentes.

Realizamos análisis de reducción de dimensiones a nivel de filo y género para determinar la variación en la composición de la comunidad microbiana de la microbiota intestinal del pollo. Como se muestra en las Figuras 6D, E, se observó una separación de comunidades microbianas basada en grupos entre los grupos de control y de intervención tanto a nivel de filo como de género, lo que sugiere diferentes composiciones de comunidades microbianas entre los grupos de control y de intervención.

El taxón microbiano dominante en los grupos de control e intervención

Se identificaron un total de 16 filos, 24 clases, 51 órdenes, 91 familias, 188 géneros y 1.655 ASV en los grupos control e intervención. Se investigaron los taxones microbianos dominantes a nivel de filo y género. Como se muestra en las Figuras 7A y B, los 10 principales filos y géneros dominantes tanto en el grupo de control como en el de intervención fueron consistentes. Los filos dominantes (abundancia relativa promedio > 1%) fueron Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria y Actinobacteria. Los géneros dominantes (abundancia relativa promedio > 1%) incluyeron Bacteroides, Rikenellaceae del grupo intestinal RC9, Faecalibacterium, Megamonas, Lactobacillus, [Ruminococcus] torques, Ruminococcaceae UCG-014 y Phascolarctobacterium.

Figura 7. Los taxones microbianos dominantes en los grupos de control e intervención a nivel de filo (A) y género (B).

Con base en la distancia de Bray-Curtis, tres grupos de intervención y un grupo de control se agruparon en diferentes grupos (Figura 7). Las intervenciones condujeron a un aumento en la abundancia de Bacteroidetes y una disminución en la abundancia de Firmicutes, Proteobacterias y Actinobacterias. A nivel de género, cuatro géneros dominantes mostraron una mayor abundancia en todos los grupos de intervención, incluyendo Bacteroides, Faecalibacterium, Ruminococcaceae UCG-014 y Phascolarctobacterium. La abundancia de Megamonas y Lactobacillus disminuyó después de cualquier intervención. También observamos el aumento específico de los géneros. Por ejemplo, la abundancia del grupo intestinal Rikenellaceae RC9 y del grupo Ruminococcus torques aumentó en los grupos M1 y M2, pero disminuyó en el grupo M3. Estos resultados indican que las intervenciones alteraron la composición de los taxones microbianos dominados.

Patrón de co-ocurrencia en la microbiota intestinal del pollo

Para determinar los efectos generales de la intervención sobre las asociaciones de la microbiota intestinal de los pollos, se construyeron cuatro redes para un grupo de control y tres grupos de intervención, respectivamente (Figura 8). Con base en el porcentaje de ganglios en estas redes, se consideraron como microbiota central Bacteroidetes (37,09%, M1; 31,66%, M2; 32,22%, M3; y 28,17%, Control), Firmicutes (53,97%, M1; 49,22%, M2; 53,19%, M3; y 56,35%, Control) y Proteobacteria (3,97%, M1; 8,46%, M2; 6,99%, M3; y 7,87%, Control). En comparación con el grupo control, el coeficiente de agrupamiento de las redes de los tres grupos de intervención disminuyó en un 3,5% (M1), un 4,1% (M2) y un 3,3% (M3), lo que indica que las intervenciones redujeron la asociación de la microbiota intestinal del pollo (Figura 8B). Por ejemplo, ASV_373 en el filo Epsilonbacteraeota poseía la mayor cantidad de conexiones en la red del grupo de control (30 bordes), pero no estaba vinculada a ningún taxón en las redes del grupo de intervención.

Figura 8. El patrón de co-ocurrencia en la microbiota intestinal del pollo de un grupo control y tres grupos de intervención. (A) Grupo M1. (B) Grupo M2. (C) Grupo M3. D) Grupo de control. Los nodos representan las OTU. Las líneas entre los nodos representan la correlación de Spearman y la intensidad de color representa el coeficiente de correlación (rojo, positivo; azul, negativo). El color de los nudos se basó en diferentes tipos de bacterias, y el tamaño indica el número de líneas.

El número promedio de vecinos, el coeficiente de agrupamiento, la heterogeneidad de la red y el número de bordes se utilizaron para revelar las diferencias entre los grupos de control e intervención en la red. Los resultados se muestran en la Figura 1 complementaria. Todos los índices de red en los grupos de intervención disminuyeron en comparación con el grupo control. Por ejemplo, la heterogeneidad de la red en los grupos de intervención fue de 0,79 (M1), 0,85 (M2) y 0,86 (M3), que es inferior al 0,96 del grupo control (Figura complementaria 1C). El número de bordes en los grupos de intervención se redujo a 871 (M1), 929 (M2) y 1.009 (M3; Figura complementaria 1D).

Taxón específico en la microbiota intestinal del pollo de los grupos control e intervención

Realizamos un análisis LEfSe (Figura 9) para identificar el taxón específico en la microbiota intestinal del pollo de los grupos control e intervención. Se observaron un total de 18 taxones diferenciales con puntuaciones LDA > 2 (Figura 9A). Hubo nueve, dos y ocho taxones enriquecidos en los grupos M2, M3 y control, respectivamente. El árbol taxonómico generado por LEfSe puso de manifiesto el origen taxonómico de los taxones que se diferenciaron estadísticamente entre los diferentes grupos (Figura 9B). Detectamos que los taxones específicos enriquecidos en el grupo M2 eran principalmente de Campylobacterales, Campylobacteraeota y Epsilonbacteraeota. En el grupo M3, un taxón específico fue el de Planococcaceae y Corynebacteriales. En el grupo control, los taxones específicos fueron principalmente de Micrococcales.

Figura 9. Taxón específico en la microbiota intestinal del pollo de los grupos control e intervención (A) y su origen taxonómico (B). Las abundancias relativas y los coeficientes de detección de probióticos (C) y patógenos (D).

Además, los probióticos y patógenos en los datos agrupados se identificaron en base a estudios previos (21-24). Se encontraron quince probióticos en la microbiota intestinal del pollo (Figura 9C). Entre ellos, el grupo [Eubacterium] ruminantium, Brachybacterium, Rothia y Yaniella se identificaron como taxones específicos para el grupo de control en el análisis LEfSe. La abundancia relativa de probióticos en el grupo control fue mayor que en los grupos de intervención (3,29%, M1; 5,46%, M2; 4,41%, M3; y 8,29%, control). En particular, los probióticos Slackia, Yaniella y DNF00809 se detectaron solo en el grupo de control.

Se sabía que ocho taxones incluían patógenos potenciales de aves de corral, y sus abundancias relativas en el grupo control fueron inferiores a las de los grupos de intervención (29,15%, M1; 29,85%, M2; 34,30%, M3; y 24,37%, control; Figura 9D). Entre estos patógenos potenciales, Helicobacter y Dietzia fueron taxones específicos enriquecidos en M2 y M3. El patógeno Enterococcus solo estuvo presente en los grupos de intervención.

Las relaciones entre la microbiota intestinal del pollo y los índices del huésped

Además, se empleó la correlación de rangos de Spearman para analizar la correlación entre la microbiota intestinal y los índices del huésped (Figura 10). Entre todos los filos, dos filos mostraron una correlación significativa (p < 0.05) con los índices de hospederos (Figura 10A). Por ejemplo, Epsilonbacteraeota se relacionó con el índice de timo y Proteobacteria se relacionó con 0-14 WGR. A nivel de género, 16 géneros mostraron una correlación significativa con los índices de hospedadores, lo que sugiere que estos géneros se asociaron con la salud del hospedero (Figura 10B). Por ejemplo, la IL-4 del grupo de control fue mayor que la de los grupos de intervención, posiblemente como resultado de la disminución de la abundancia de Blautia, Lactobacillus, Paraprevotella y Parasutterella. Además, la α-amilasa se relacionó con Eubacterium.coprostanoligenes.group y GCA-900066575. El índice de peso Adenomyogastric se relacionó con Bacteroides y Odoribacter. El índice de bursa se relacionó con GCA-900066225. Los 7-14 WGR se relacionaron con Faecalibacterium, Phascolarctobacterium y Subdoligranulum.

Figura 10. La prueba de Mantel entre la microbiota intestinal del pollo y los índices del huésped. (A) Nivel de filo. (B) Nivel de género.

El efecto de la intervención sobre las capacidades de función microbiana del intestino del pollo

Las vías más activas en todos los grupos se relacionaron con el metabolismo de los carbohidratos, el transporte de membrana, la replicación y reparación, la traducción y el metabolismo de los aminoácidos, representando el 48,76-48,96% (Figura 11A). Para ilustrar las alteraciones funcionales de la microbiota intestinal del pollo después de las intervenciones, se realizó un análisis de PCoA. Los resultados se muestran en la Figura 11C. Observamos las distintas capacidades de función microbiana asociadas a los grupos control e intervención. Con base en el análisis de LEfSe, se observaron tres capacidades de función activa diferenciales con puntuaciones LDA > 2 (Figura 11B). Específicamente, el grupo control mostró una degradación más activa de la caprolactama, se observó un metabolismo más activo de la vitamina B6 en M3 y un metabolismo más activo de la porfirina y la clorofila en M1.

Figura 11. Características de la función microbiana del intestino del pollo en los grupos control e intervención. (A) Las 10 principales capacidades de función microbiana en función de sus abundancias relativas. (B) Las funciones microbianas específicas en los grupos de control e intervención. (C) Análisis NMDS de las funciones microbianas. (D) La correlación entre las capacidades de la función y los índices de host.

Además, se analizó la correlación entre las capacidades de la función y los índices de hospederos (Figura 11D). Se encontraron trece ítems relacionados con los índices de hospederos (p < 0,05), entre los cuales tres vías mostraron una fuerte corrección (R >0,4). La motilidad celular y el sistema digestivo se asociaron con la IL-4, mientras que el sistema digestivo se relacionó con 0-14 WGR.

Discusión

La gastritis glandular y muscular es una enfermedad transmisible que afecta a los pollos comerciales. Se caracteriza por el agrandamiento y ulceración de los estómagos glandulares y musculares, mala conversión alimenticia, mala uniformidad, disminución del peso corporal y heces blandas con alimento no digerido (5). La etiología precisa de la gastritis glandular y muscular sigue siendo desconocida. Es urgente establecer un modelo de gastritis glandular y muscular replicable en pollos consistente con las manifestaciones clínicas de este síntoma para ayudar a prevenir y tratar esta enfermedad.

En este estudio, exploramos varios métodos para establecer modelos de pollo con SPF con gastritis glandular y muscular. Nuestros hallazgos revelan que los niveles de IL-4 y α-amilasa en los pollos modelo construidos con éxito se reducen, mientras que el contenido de citoquinas proinflamatorias séricas IL-2 aumenta, lo que indica que esta enfermedad puede mejorar la respuesta inflamatoria y reducir la conversión alimenticia en pollos enfermos. La gastritis, una gastropatía común que a menudo se acompaña de inflamación, se evalúa en cuanto a su gravedad a través de la expresión de marcadores inflamatorios. Se ha observado que la IL-4 desempeña un papel inhibidor en la expresión y liberación de citocinas inflamatorias. Estas respuestas inflamatorias también podrían promover la infiltración de células inflamatorias y causar lesiones en el estómago glandular y muscular. Además, el establecimiento del modelo redujo significativamente el rendimiento de crecimiento de los pollos, lo que puede estar relacionado con una reducción en la tasa de conversión alimenticia causada por lesiones en los estómagos glandulares y musculares en pollos enfermos. La amilasa es una enzima exocrina secretada por el páncreas y las glándulas salivales, que cataliza la conversión de almidón y glucosa en componentes más pequeños (25). La α-amilasa es un componente importante de la enzima digestiva en el cuerpo, que desempeña un papel vital en la transferencia de energía intracelular, la contracción muscular y la regeneración de ATP. Su actividad también tiene una influencia importante en la digestión, absorción y utilización del alimento (26). La disminución de la α-amilasa puede corresponder al lento crecimiento de los pollos enfermos. En el ámbito clínico, la amilasa sérica se ha utilizado como marcador bioquímico de pancreatitis aguda y crónica para proporcionar apoyo diagnóstico (27), pero su relación con la gastritis apenas se ha informado. Dada la naturaleza multifacética de la α-amilasa, debemos profundizar en su posible relación con la gastritis del pollo.

En este estudio, las comunidades microbianas de los grupos modelo mostraron claras diferencias en comparación con las del grupo control. Los diferentes tratamientos tienen diferentes efectos sobre la diversidad microbiana de los intestinos de pollo, pero un punto en común es que la diversidad microbiana de los intestinos de pollo se reduce después de establecer el modelo. A través de la prueba t, identificamos diferencias significativas en la flora entre los grupos modelo y el control. En particular, se encontró que la mayoría de los géneros con diferencias significativas se redujeron significativamente en el grupo modelo, incluidos Acetatifactor, Tuzzerella, Prevotellaceae y [Eubacterium]_brachy_group. Acetatifactor es un género de bacterias grampositivas estrictamente anaeróbicas de la familia Lachnospiraceae, que está estrechamente relacionado con el metabolismo de los ácidos biliares (28) y el metabolismo de los ácidos grasos de cadena corta (29). También se ha reportado que el acetatifactor sufre cambios significativos en la colitis, y la regulación de los factores de acetilación juega un papel crucial en el alivio de la colitis (30). Prevotellaceae es un probiótico en el intestino que ayuda a descomponer las proteínas y los carbohidratos. Se ha informado que cierta microflora intestinal y sus metabolitos, incluidas las Prevotellaceae, desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la integridad de la barrera intestinal y la homeostasis intestinal (31). Eubacterium fue propuesto por primera vez por Prévot en 1938 para describir un grupo de bacterias beneficiosas aisladas de heces humanas, que tienen las funciones de antagonizar a los organismos nutricionales y mantener el equilibrio ecológico de los microorganismos intestinales. Las especies de Eubacterium son importantes para la salud intestinal y también han mostrado correlaciones negativas con marcadores inflamatorios como la IL-2 y la proteína C reactiva (32). En este estudio, los cambios en la flora intestinal en pollos modelo también corresponden a un aumento de la inflamación causada por la gastritis glandular y muscular. Además, la abundancia relativa de especies conocidas distintas de las 10 primeras en el ranking de abundancia media fue relativamente alta en el grupo de control (más del 30% a nivel de género), lo que sugiere que puede haber más especies desconocidas por descubrir.

En general, esta investigación se adhirió estrictamente a los estándares experimentales durante todo el procedimiento. Sin embargo, todavía hay margen de mejora en algunos aspectos. En primer lugar, el número de pollos con FPS utilizado en el experimento no fue grande, por lo que planeamos utilizar un mayor número de animales de experimentación para llevar a cabo experimentos con el fin de determinar aún más la repetibilidad y estabilidad de la construcción del modelo y la posibilidad de indicadores medidos como biomarcadores de gastritis glandular y muscular. Además, aplicaremos de manera integral proteómica, metabonómica y otras técnicas en el próximo experimento para explorar la patogénesis de esta enfermedad con mayor claridad.

Conclusiones

Todos los grupos modelo de pollos exhibieron síntomas típicos de gastritis glandular y muscular a través de los tres métodos de modelado descritos en el texto, lo que indica una reproducción exitosa del modelo de pollo. Después de establecer el modelo de gastritis glandular y muscular con SPF en pollos, éste provocó principalmente un aumento de peso lento, una disminución de los niveles séricos de IL-4 y α-amilasa, ulceración y hemorragias en el estómago glandular y muscular, así como alteraciones en la microbiota intestinal. A través de comparaciones exhaustivas de la construcción del modelo utilizando varios métodos, se determinó que el modelo de pollo SPF construido con poliglicol combinado con ruibarbo era más consistente con el síndrome de gastritis glandular y muscular. El establecimiento exitoso de este modelo puede ayudar a mejorar los estudios sobre la prevención y el tratamiento de la gastritis glandular y muscular.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres de los repositorios y los números de acceso se pueden encontrar en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1017104.

Declaración ética

El estudio en animales fue aprobado por la Comisión de Ética de Animales de Laboratorio del Instituto Avícola de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales.

Contribuciones de los autores

ZY: Escritura – borrador original. SY: Conceptualización, Metodología, Redacción – revisión y edición. SL: Administración de proyectos, redacción – revisión y edición. ZZ: Supervisión, Redacción – revisión y edición. YL: Análisis formal, Redacción – revisión y edición. POR: Metodología, Redacción – revisión y edición. YY: Conceptualización, Redacción – revisión y edición. SS: Investigación, Escritura – Revisión y Edición. RZ: Escritura – revisión y edición. ZH: Conceptualización, Escritura – borrador original.

Financiación

El/los autor/es declara(n) haber recibido apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Este trabajo contó con el apoyo financiero del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2023YFD1800805), el Fondo Asignado para el Proyecto de Mejora de la Capacidad de las Pequeñas y Medianas Empresas de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Shandong (2023TSGC0092) y el Proyecto del Plan de Innovación de Tecnología de Aplicación Agrícola de Jinan (CX202102).

Reconocimientos

Nuestro más sincero agradecimiento a otros colegas del laboratorio por su ayuda en los ensayos clínicos. También estamos agradecidos a Tianjin Zhiran Biotechnology Co., Ltd por ayudar en los análisis de MS y bioinformática.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

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Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2024.1343768/full#supplementary-material

Figura complementaria 1. Análisis comparativo de las propiedades de la red entre grupos.

Referencias