Introducción

La tuberculosis animal (TB) es una enfermedad infecciosa crónica causada por miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC), cuyos huéspedes naturales son mamíferos silvestres y domésticos (1). Mycobacterium bovis es la principal causa de tuberculosis en el ganado bovino (tuberculosis bovina, tuberculosis bovina) y es capaz de infectar a una amplia gama de otras especies animales, así como a los seres humanos (2). Por lo tanto, este patógeno zoonótico representa un alto riesgo para la salud animal y humana y para el comercio internacional de animales domésticos y productos de origen animal, lo que pone de manifiesto la necesidad de vigilancia.

El primer caso reportado de infección por M. bovis en una granja de alpacas en Bélgica ocurrió en 2015 (comunicación personal de M. Mori, Sciensano, Bélgica), lo que aumentó el interés en el diagnóstico ante-mortem en camélidos del Nuevo Mundo (NWC), como llamas y alpacas. Se ha informado de que las pruebas diagnósticas para la detección de la tuberculosis animal basadas en la inmunidad mediada por células (CMI), como la prueba de tuberculina intradérmica o el ensayo de IFNɤ, tienen poca precisión en las NWC (3, 4). Los ensayos de diagnóstico serológico pueden ser una alternativa prometedora, como lo demuestra (5). Durante la última década, se han desarrollado varios ensayos serológicos para detectar la tuberculosis animal en camélidos, como la prueba multiespecie ELISA INgezim Tuberculosis DR (Ingenasa, España) y la prueba multiplexada Enferplex Camelids TB (Enfer Scientific, Irlanda) (6, 7).

En 2020, se sospechó que las alpacas de dos granjas belgas diferentes, una de las cuales estuvo involucrada en el brote de tuberculosis animal de 2015, estaban infectadas con M. bovis sobre la base de resultados positivos en el diagnóstico serológico (INgezim Tuberculosis DR multiespecie y Enferplex Camelids TB). La necropsia de estos animales reveló lesiones típicas de la tuberculosis y la PCR en tiempo real (qPCR), realizada en los órganos y utilizando la secuencia de inserción IS6110 para la identificación de los miembros del MTBC, fue positiva. Sin embargo, la prueba de qPCR para diferenciar los miembros del MTBC, basada en polimorfismos del gen gyrB y realizada a partir de cultivo bacteriano (8), identificó M. microti (datos del Laboratorio Nacional de Referencia para la Tuberculosis Bovina, Sciensano, Bélgica).

Identificado por primera vez en ratones de campo, M. microti es otro miembro menos virulento de MTBC que puede infectar una amplia gama de especies animales y causar lesiones tuberculosas (9-11). Además, el impacto de la situación epidemiológica de M. microti en algunas áreas no parece ser irrelevante (11-13). Sin embargo, la Ley Europea de Sanidad Animal (UE 2016/429) no incluye a M. microti como agente etiológico de la tuberculosis animal, que según la legislación solo incluye a M. bovis, M. caprae y M. tuberculosis. En consecuencia, las infecciones por M. microti no son de declaración obligatoria y no dan lugar a las mismas medidas sanitarias (por ejemplo, retirada de animales, granjas bloqueadas) que las declaraciones de brotes de M. bovis o M. caprae. Por lo tanto, M. microti representa un riesgo de interferencia en el diagnóstico de la tuberculosis animal.

La investigación de biomarcadores para distinguir con precisión la infección por M. bovis de M. microti en el examen ante-mortem en animales ha recibido poca atención. Si bien las pruebas serológicas utilizadas para diagnosticar la tuberculosis animal en las NWC y otras especies, como el ganado, son efectivas para detectar animales infectados, no son lo suficientemente específicas como para distinguir entre la infección por M. bovis y M. microti (14-16). Por lo tanto, es importante identificar proteínas antigénicas específicas que puedan provocar una respuesta de anticuerpos y que puedan utilizarse en pruebas serológicas. Los epítopos de las células B son segmentos de proteínas antigénicas que pueden ser reconocidos por los anticuerpos (17), y se clasifican en epítopos lineales (es decir, secuencias continuas de aminoácidos) y conformacionales (es decir, estructuras tridimensionales plegadas). De particular interés es la identificación de epítopos específicos de células B que podrían usarse para construir péptidos sintéticos como biomarcadores.

Los miembros del MTBC tienen más del 99,9% de identidad de secuencia de ADN entre sí, pero difieren en fenotipo, virulencia y especie huésped. Las diferencias entre especies se limitan principalmente a deleciones de regiones de diferencia (RD), polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en genes codificadores de proteínas y regiones hipervariables. La tipificación molecular de los miembros de MTBC a menudo se realiza utilizando la poligotipia, un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa que examina la deleción de secuencias espaciadoras en la región de repetición directa (DR) (18). Los perfiles de espoligotipos resultantes se pueden utilizar para comprender la diversidad genética y la relación de las cepas de MTBC. Se reportaron diversos espolagotipos para las cepas de M. microti (11), entre ellos, los más dominantes son los espoligotipos «tipo llama» y «tipo topillo», llamados así por los animales huéspedes en los que se observaron por primera vez (19). Los estudios han demostrado que las cepas de M. microti se caracterizan por regiones de deleción específicas de M. microti (MiD) junto con la deleción de parte de la región RD1 (^{RD1 mic}), que incluye marcos de lectura abiertos (ORF) de genes de virulencia conocidos (20). Estas variaciones genómicas pueden ser útiles para la vigilancia epidemiológica y el diagnóstico de la tuberculosis animal (21-23). La organización genómica de los miembros del MTBC, principalmente M. bovis y M. tuberculosis, se ha explorado más a fondo utilizando la secuenciación del genoma completo (WGS), lo que permite una mejor comprensión de la patología y la identificación de biomarcadores para el diagnóstico y el tratamiento de la TB (24-27). Sin embargo, hasta la fecha, ha habido muy poca investigación sobre M. microti, y muy pocos conjuntos de datos de WGS están actualmente disponibles en bases de datos públicas.

Este estudio se inició con el objetivo de identificar posibles biomarcadores para distinguir M. microti de M. bovis mediante WGS. La información genómica se utilizó para detectar variaciones que afectaban a las proteínas y que podrían constituir la base de los métodos de diagnóstico serológico. Se utilizó un enfoque in silico para extraer epítopos de células B de las proteínas antigénicas putativas identificadas. Además, este estudio describe la diversidad genómica de M. microti basándose en datos disponibles públicamente, incluidas las cepas recientemente recolectadas de Bélgica.

Materiales y métodos

Cepas bacterianas y extracción de ADN

Se aislaron tres cepas de M. microti de los órganos de alpacas de granjas belgas. Dos de ellos fueron aislados en la misma granja a partir de animales con resultado positivo en las pruebas serológicas para tuberculosis animal (es decir, los aislados MI20-1 y MI20-2). Ambas alpacas presentaban lesiones tuberculosas en la necropsia. El tercer aislado se colectó de una alpaca que se encontró muerta (con lesiones tuberculosas) y originaria de otra granja (es decir, el aislado VAR696). No había un vínculo geográfico o epidemiológico aparente entre las dos granjas. Todas las muestras se recogieron en 2020.

Las cepas de M. microti MI20-1 y MI20-2 se cultivaron en un medio sólido de piedra o utilizando un sistema líquido automatizado BACTEC™ MGIT™ (Becton Dickinson, Sparks, MD, EE. UU.) en el Laboratorio Europeo de Referencia para la tuberculosis bovina en el Centro de Salud VISAVET (Madrid, España) y se incubaron a 37 °C durante varias semanas. M. microti VAR696 se procesó de manera similar en el Laboratorio Belga de Referencia para la tuberculosis bovina del Instituto Belga de Salud (Sciensano, Bruselas, Bélgica) y el ADN genómico se extrajo utilizando el kit QIAGEN DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para bacterias Gram-positivas con un paso de molienda mecánica previo para cumplir con los requisitos específicos para la extracción de ADN en el caso de micobacterias Spp. El ADN genómico de las cepas MI20-1 y MI20-2 se extrajo de un cultivo puro cultivado en medio Middlebrook 7H9 suplementado con albúmina oleica dextrosa catalasa (OADC) utilizando fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (PCI) y luego se purificó utilizando etanol, como se describió previamente en (28). El pellet de ADN resultante se secó a temperatura ambiente y se volvió a suspender en 50-200 μL de agua destilada ultrapura (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.).

La calidad y la concentración del ADN se midieron mediante espectrofotometría utilizando el Nanodrop^® 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) y la pureza del ADN se evaluó utilizando las proporciones A260/A280 y A260/A230.

La detección de los miembros del MTBC se realizó mediante una qPCR basada en el elemento IS6110 (29). La caracterización molecular de las micobacterias MTBC se realizó mediante qPCR basada en el polimorfismo del gen gyrB (8) y/o poligotipado de repetición variable directa (DVR) (30).

Secuenciación del genoma completo

Los extractos de ADN de los aislados MI20-1 y MI20-2 se enviaron al Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios en Ames, Iowa (EE. UU.) para su preparación en la biblioteca y secuenciación del genoma completo, mientras que el aislado VAR696 se secuenció en Sciensano (Bélgica). La preparación de la biblioteca se logró utilizando el kit de preparación de bibliotecas Nextera XT (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuenciación se llevó a cabo en ambos casos en un sistema MiSeq con la química V3, obteniendo lecturas de 250 pb en los extremos pareados, con el objetivo de una cobertura teórica de 60X basada en el tamaño del genoma esperado de ~ 4.4 Mbp de M. microti.

Preprocesamiento y montaje de novo

El preprocesamiento y el ensamblaje de novo se realizaron como se describió anteriormente (31). Brevemente, las lecturas sin procesar se recortaron usando Trimmomatic 0.38 (32) con las siguientes opciones: «LEADING» establecido en 10, «TRAILING» establecido en 10, «SLIDINGWINDOW» establecido en «4:20», «MINLEN» establecido en 40 e «ILLUMINACLIP» establecido en «NexteraPE-PE.fa:2:30:10». A continuación, las lecturas procesadas se ensamblaron de novo utilizando SPAdes 3.13.0 (33) con la opción «—cuidado» habilitada y «–cov-cutoff» establecido en 10. Los contigs menores de 1.000 pb se eliminaron utilizando la función «seq» de Seqtk 1.3 (disponible en https://github.com/lh3/seqtk). La calidad de los ensamblajes se evaluó utilizando QUAST 4.4 (34), con los ensambles filtrados como entrada. También se evaluaron varios controles de calidad adicionales incluidos en el flujo de trabajo: (1) detección de contaminantes utilizando Kraken 2 v2.0.7 (35); (2) evaluación de la mediana de la profundidad de secuenciación y la tasa de mapeo utilizando Bowtie 2 v2.4.1 (36) y SAMtools v1.9 (37); y (3) varios controles de calidad en las lecturas de entrada con FastQC v0.11.7 (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). La Figura 1 ilustra el flujo del análisis bioinformático completo.

Figura 1. Visión general del procesamiento bioinformático. Visión general del diseño del estudio. Los datos de M. bovis y M. microti se muestran en recuadros azules y amarillos, respectivamente. Se indica el número de cepas. Las partes del análisis se muestran en cuadros verdes. Las flechas indican el flujo de los datos, con el formato indicado por la etiqueta. La flecha verde muestra los archivos FASTQ de entrada para el análisis filogenómico. La flecha naranja indica los datos de los genomas de referencia seleccionados: (1) los archivos FASTQ se utilizan para el análisis RD/MiD, (2) los archivos FASTA del genoma se utilizan como entrada para el análisis pangenómico. La flecha roja indica la entrada FASTQ de las cepas belgas y seleccionadas de M. microti para el análisis RD/MiD. La flecha gris indica el flujo de datos entre los subanálisis.

Análisis filogenómico

Se recuperaron todos los conjuntos de datos de M. microti disponibles en el Archivo de Lectura de Secuencias (SRA) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) que fueron generados por la secuenciación de Illumina (consultados el 24 de enero de 2022), para los cuales se proporciona una descripción general en la Tabla 1. Se disponía de tres conjuntos de datos para el aislado 8753/00, de los cuales se seleccionó ERR551113 por tener la mayor cobertura. El conjunto de datos ERR553377 también se excluyó del análisis, ya que se agrupó de manera idéntica en el análisis SNP con ERR553376, que se recopiló en el mismo estudio. Del mismo modo, el conjunto de datos ERR2659165 se excluyó del análisis, ya que es una réplica del conjunto de datos ERR2659166. Los conjuntos de datos con una cobertura estimada >100x, calculada sobre la base del número de bases en los archivos FASTQ y el tamaño del genoma del genoma de M. microti OV254 (acceso RefSeq GCF_904810325.1), se redujeron a ~100x utilizando la función «muestra» de seqtk 1.3. A continuación, la filogenia de los SNP se realizó utilizando PACU 0.0.5 (44), que utiliza BCFtools 1.17 (45) para la llamada de variantes y Gubbins 3.3.1 (46) para eliminar los SNP en regiones recombinantes. En primer lugar, las lecturas procesadas se asignaron al genoma OV254 de M. microti (acceso RefSeq GCF_904810325.1), utilizando la función PACU_map con el parámetro «–read-type» establecido en «illumine» y otras opciones dejadas en sus valores predeterminados. Los archivos BAM resultantes se utilizaron como entrada para el flujo de trabajo SNP de PACU. Se utilizó la herramienta en línea PHASTER (47) para generar un archivo BED con regiones de fagos (pro-) en el genoma de referencia y se proporcionó a la PACU con la opción «–ref-bed». La opción –use-mega’ se habilitó para realizar la selección automática de modelos y la construcción de árboles con MEGA X (48). Se seleccionó el modelo de mejor ajuste como modelo de sustitución con el menor valor de criterio de información bayesiano (BIC), seleccionando el modelo de 3 parámetros de Tamura. Los espoligotipos se determinaron in silico utilizando SpoTyping 2.1 (49) y se añadieron como anotaciones a la filogenia. Los valores de los parámetros «—min» y «—rmin» se establecieron en 1 para los conjuntos de datos con una cobertura estimada de < 30x, estimada en función de la asignación al genoma de referencia. Para otros conjuntos de datos, se utilizaron los valores de parámetro predeterminados.

Caracterización genómica de las regiones RDs y MiDs

La presencia de RD y MiD se evaluó utilizando un enfoque basado en el mapeo de lecturas. La nomenclatura de RD y MiD utilizada en este estudio se basa en la de (20, 21, 50-52) y difiere de la propuesta por (53). En la Tabla 2 se ofrece una visión general de los RD y MiD evaluados. Se utilizó Bowtie2 2.4.1 con el preajuste «–very-sensitive-local» habilitado para mapear las lecturas procesadas a las secuencias de las regiones RD, obtenidas del genoma de referencia de M. tuberculosis H37Rv (acceso RefSeq NC_000962.3). El análisis incluyó los conjuntos de datos de Illumina FASTQ para los genomas de referencia M. bovis BCG Danish 1311 (SRR7983756), M. bovis AF2122/97 (ERR1744454), M. bovis MB3601 (ERR3825346) y M. microti OV254 (ERR027295) y todas las cepas de M. microti incluidas en el análisis filogenómico. Se consideró que las regiones que estaban cubiertas por al menos el 75% y con una profundidad media >5x estaban presentes.

Análisis del pangenoma

Para el análisis pangenómico se utilizó Roary. Se utilizaron tres cepas de referencia de M. bovis (es decir, la cepa de la vacuna BCG de M. bovis y las dos cepas virulentas de M. bovis AF2122/97 y MB3601) y una cepa de referencia de M. microti (OV254), para las cuales los genomas circulares se descargaron de NCBI RefSeq. Además, también se utilizaron los genomas ensamblados de las cepas de M. microti utilizadas en el análisis filogenómico, incluidos los de las tres cepas belgas. Se utilizó Prokka 1.14.6 (54) con opciones predeterminadas para la predicción de genes y la anotación funcional. Las proteínas de los genomas de referencia M. tuberculosis H37Rv, M. microti OV254, M. bovis AF2122/97 y M. bovis BCG Danish 1311 se proporcionaron con las opciones «-proteínas» como base para la anotación de genes. A continuación, se utilizó Roary 3.12.0 (55) para el análisis del pangenoma con la opción «—mafft» habilitada, la identidad mínima establecida en el 90% y los parálogos no divididos («-s»). Los gráficos UpSet se generaron utilizando el paquete de python UpSetPlot v0.8.0 (disponible en https://github.com/jnothman/UpSetPlot) para mostrar la superposición de genes entre especies y cepas. Los resultados del análisis del genoma pan se utilizaron para identificar genes codificantes de proteínas que podrían usarse como biomarcadores potenciales para la diferenciación de M. microti de M. bovis virulento (es decir, excluyendo la cepa de la vacuna danesa 1311 BCG de M. bovis).

Selección de posibles biomarcadores

Las proteínas, procedentes de los análisis RD/MiDs y pangenoma, presentes en las cepas virulentas de M. bovis (es decir, no en la cepa de la vacuna BCG de M. bovis) y ausentes en todas las cepas de M. microti, y viceversa, se seleccionaron como posibles biomarcadores. A continuación, se evaluaron de acuerdo con los siguientes tres criterios: localización subcelular, homología de secuencia y antigenicidad, como se detalla a continuación.

Predicción de la localización subcelular

SignalP 6.0 se utilizó para predecir la presencia de péptidos señal dependientes de sec y tat en proteínas (56). Estas secuencias cortas de aminoácidos N-terminales son reconocidas por la maquinaria clásica de translocación sec o tat y, por lo tanto, controlan la secreción y translocación de proteínas en las bacterias. SecretomeP 2.0 se utilizó para la predicción de proteínas secretadas no clásicas (57). Ambos programas están disponibles gratuitamente en el sitio web del Centro de Análisis de Secuencias Biológicas de la Universidad Técnica de Dinamarca (http://www.cbs.dtu.dk/services). Además, Psortb v3.0.3 [(58); https://www.psort.org/psortb/], Gpos-mPLoc [(59); http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Gpos-multi/] y CELLO2.5 [(60); http://cello.life.nctu.edu.tw/] se utilizaron para las predicciones de la localización subcelular de las proteínas candidatas. CELLO2.5 es un sistema de clasificación de máquinas de vectores de soporte (SVM) multiclase que utiliza cuatro tipos de esquemas de codificación de secuencia. Psortb3.0.3 utiliza una combinación de módulos, cada uno de los cuales se sabe que influye en la ubicación subcelular de las proteínas (por ejemplo, el número de hélices transmembrana, péptidos señalizadores, motivos de la membrana externa, …). Gpos-mPLoc identifica la localización subcelular de proteínas bacterianas Gram positivas mediante la fusión de la información de la ontología génica, así como la información del dominio funcional y la información de evolución secuencial. Las secuencias de aminoácidos se recuperaron de la base de datos de proteínas del NCBI y se utilizaron como entrada para todas las herramientas. También se consultó la base de datos UniProt (http://www.uniprot.org/) para obtener la localización subcelular de las proteínas.

Análisis de homología de secuencia

Biomarcadores putativos con alta similitud de secuencia con proteínas de miembros del complejo Mycobacterium avium-intracellulare (MAC; M. avium subespecie paratuberculosis, «M. avium subespecie hominissuis«, M. avium subespecie avium y M. intracellulare). Estas micobacterias ambientales se aíslan comúnmente del ganado y comparten proteínas con miembros de MTBC que pueden reaccionar de forma cruzada en el diagnóstico (61-63). Las similitudes de secuencia de todas las proteínas se evaluaron utilizando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de la herramienta NCBI BLASTp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Se descartaron las proteínas putativas con un porcentaje de identidad ≥55% y una cobertura de consulta ≥40% a las de la base de datos del NCBI.

Predicción de la antigenicidad

La antigenicidad de todas las proteínas se estimó utilizando ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) y VaxiJen v2.0 (https://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html). Las predicciones de ANTIGENpro se basan en un enfoque de dos pasos, que combina múltiples representaciones de la secuencia primaria y algoritmos de aprendizaje automático. Un clasificador final de la máquina de vectores de soporte (SVM) resume las predicciones resultantes y proporciona una probabilidad de si es probable que la proteína sea antigénica (64). VaxiJen 2.0 es un enfoque sin alineación para la predicción de antígenos, que se basa en la transformación automática de covarianzas cruzadas de secuencias de proteínas en vectores uniformes de propiedades de aminoácidos clave (65). Se utilizó un umbral de predicción de 0,5 para ambos programas, tal y como se recomienda en la literatura (64, 65). Las proteínas predichas como antigénicas por al menos una de estas dos herramientas se consideraron probablemente antigénicas.

Predicción de epítopos lineales y conformacionales de células B

La predicción de epítopos lineales y conformacionales de células B se realizó para todas las proteínas predichas como extracelulares, poco conservadas en micobacterias ambientales y antigénicas.

Para la predicción de epítopos lineales de células B, las secuencias de proteínas en formato FASTA se sometieron a cinco herramientas diferentes disponibles en la Base de Datos y Análisis de Epítopos (IEDB; https://www.iedb.org/), en base a las siguientes escalas: giro beta (66), accesibilidad superficial (67), flexibilidad (68), hidrofilicidad (69) y antigenicidad (70). Para cada herramienta, el tamaño de la ventana se estableció en siete aminoácidos y se utilizó el umbral predeterminado. BepiPred-2.0, disponible en el servidor IEDB, también se utilizó para predecir epítopos lineales de células B a partir de secuencias de aminoácidos en formato FASTA. La herramienta Bepipred 2.0 se basa en un algoritmo de bosque aleatorio entrenado con aminoácidos epítopos y no epítopos determinados a partir de estructuras cristalinas. Se utilizó el valor umbral predeterminado de 0,50 (71). Todos los resultados (es decir, todos los epítopos lineales de células B predichos) obtenidos con las herramientas IEDB se compararon para encontrar epítopos similares utilizando la herramienta Epitope Cluster Analysis v2.0 (http://tools.iedb.org/cluster/), con un umbral mínimo de identidad de secuencia del 70%. Los epítopos de consenso obtenidos con la herramienta Clúster de epítopos se seleccionaron como epítopos lineales finales de células B. La predicción de epítopos lineales de células B a través de múltiples herramientas y la agrupación de péptidos fue limitada para secuencias de proteínas con un alto número de aminoácidos (>1.500), PE_PGRS50 media (Rv3345c) y PPE55 (Rv3347c). En consecuencia, solo se utilizaron epítopos lineales antigénicos de células B predichos por el método de Kolaskar y Tongaonkar para estas proteínas.

Dado que la mayoría de los epítopos de las células B en las proteínas nativas son conformacionales (72), los epítopos conformacionales de las células B se predijeron utilizando el Discotope 3.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/DiscoTope-3.0/) y ElliPro http://tools.iedb.org/ellipro/; (73) servidores. Las estructuras de las proteínas se descargaron de la base de datos PDB (https://www.rcsb.org/) o de la base de datos de estructuras de proteínas AlphaFold [https://alphafold.ebi.ac.uk/; (74)]. Se utilizaron los parámetros por defecto. Se conservaron las secuencias de aminoácidos, que oscilaban entre 8 y 25 residuos, que eran comunes a los epítopos lineales y conformacionales de las células B predichos. La antigenicidad de los epítopos de células B predichas como lineales y conformacionales se analizó con Vaxijen2.0. Los epítopos con un valor >0,5 se consideraron como los mejores péptidos epítopos de células B.

Disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos que respaldan las conclusiones de este estudio se han depositado en el NCBI SRA bajo el número de acceso PRJNA1000766. En el Cuadro 1 se indican los números de accesión individuales.

Resultados

Preprocesamiento y calidad de los datos

En la Tabla Suplementaria 1 se proporcionan métricas de calidad de datos para el ensamblaje de novo y el análisis de mapeo de lectura de los conjuntos de datos generados internamente (es decir, los aislados belgas de M. microti). Los tres conjuntos de datos superaron los controles de calidad del flujo de trabajo (31), lo que indica que los datos eran adecuados para un análisis posterior.

Análisis filogenómico de los genomas disponibles de M. microti

De los 27 conjuntos de datos de M. microti recopilados del NCBI, 19 se incluyeron en el análisis filogenómico, y ocho se excluyeron debido a su baja calidad. Estos datos se complementaron con las tres cepas de M. microti secuenciadas en este estudio, resultando un total de 22 cepas de M. microti (Tabla 1). El resultado del análisis de máxima verosimilitud se muestra en la Figura 2 y las distancias de SNP por pares se muestran en la Tabla complementaria 2. Los aislados recogidos en este estudio muestran una similitud genómica muy alta, con solo ocho diferencias de SNP entre MI20-1 y MI20-2, y 18 SNPs entre estos dos aislados y VAR696. Sin embargo, parece poco probable que exista una relación epidemiológica directa entre estas cepas, dada la baja tasa de mutación de MTBC (75). La cepa más cercana recolectada de SRA fue M. microti-45, aislada de un cerdo en el Reino Unido, que difiere en 57 SNP de las tres cepas belgas en este estudio. La cepa M. microti-36, aislada de un gato doméstico en el Reino Unido, mostró 241-243 diferencias de SNP con las tres cepas belgas y 244 diferencias de SNP con M. microti-45. Si bien los valores de bootstrap para las ramas más largas fueron generalmente altos, los valores de bootstrap también indicaron una baja confianza en la posición relativa de estas ramas.

Figura 2. Filogenia de máxima verosimilitud de las cepas de M. microti colectadas en el NCBI y los aislados recolectados en este estudio. Las longitudes de las ramas y la barra de escala se expresan como sustituciones medias por sitio. El soporte de arranque se indica mediante los números en las ramas (proporciones basadas en 1.000 réplicas). M. microti OV254 se utilizó como genoma de referencia para la filogenia (resaltado en negrita). Los tres aislados recolectados como parte de este estudio se muestran en azul. Las anotaciones son (de izquierda a derecha): nombre de la cepa, especie huésped, país, espoligotipo determinado por SpoTyping en formato octal y número SIT. La filogenia estaba enraizada en el punto medio. Reino Unido, Reino Unido; N/A, no disponible; SIT, Spoligotype Tipo Internacional.

Las tres cepas belgas fueron asignadas al mismo espoligotipo que las cepas M. microti-45 y M. microti-36 en el mismo clado (el espoligotipo «tipo llama» SB0423). El mismo espoligotipo se observó en otros dos clados: (1) el clado portador de M. microti ATCC 19422 y ATCC35782, recolectado de ratones de campo, y (2) el clado portador de M. microti 416/01 y 8753/00, ambos aislados de humanos. La cepa M. microti-68 tenía un patrón espaciador similar, pero carecía de los espaciadores 37 y 38, lo que resultó en un espoligotipo diferente. Todos los demás aislados se asignaron a SB0118, conocido como el espoligotipo «tipo topillo», excepto el clado que contiene cinco aislados recolectados de jabalíes en Italia, que carecía de todos los espaciadores, asignándolos a SB2277.

Caracterización genómica de las regiones RDs y MiDs

Veinte de las 40 regiones RDs/MiDs analizadas estaban presentes en las tres cepas belgas y en las cepas de M. microti de referencia OV254, junto con las tres cepas de referencia de M. bovis estudiadas, como se muestra en la Figura 3. Las regiones RD7, RD8, RD9 y RD10 estuvieron (en su mayoría) ausentes en todas las cepas, excepto en M. tuberculosis H37Rv. Las regiones RD4, RD6, RD11 (profago phiRv2), RD12^bov, RD13 y N-RD25^bov/cap estuvieron ausentes en todas las cepas de M. bovis (cepas virulentas y vacunales), pero presentes en las cuatro cepas de M. microti. Sin embargo, ~60% (por debajo del umbral de detección del 75%) de la región N-RD25^bov/cap estaba presente en las cepas de M. bovis, con el ORF PPE66 (Rv3738c) interrumpido y el locus PPE67 (Rv3739c) completamente ausente en estas cepas. No se encontraron ORFs intactos en las fracciones (< 25% de cobertura) de las regiones RD4, RD6, RD11 y RD13 que estaban presentes en las cepas de M. bovis. De manera similar, no se encontraron ORFs intactos para la fracción de la región RD12^bov (~36% de cobertura) en las cepas de M. bovis, excepto para el locus Rv3117. Curiosamente, la región^micra RD5 estuvo en gran medida ausente de los genomas de M. bovis y M. microti OV254, pero estaba casi completamente cubierta por las tres cepas belgas de M. microti. A diferencia de M. microti OV254, los loci plcC (Rv2349c), plcB (Rv2350c), plcA (Rv2351c) y PPE38 (Rv2352c) estaban completamente cubiertos en las tres cepas belgas. La región MiD3 estuvo presente en todas las cepas de M. bovis estudiadas, pero estuvo por debajo del umbral de detección en todas las cepas de M. microti. Sin embargo, las cepas de M. microti contenían una gran fracción de la región MiD3, pero no ORFs intactos para PE_PGRS50 (Rv3345c), una proteína transmembrana (Rv3346c), PPE55 (Rv3347c) y una transposasa (Rv3349c). Solo la transposasa Rv3348c tenía un ORF intacto. Las regiones RD1^mic, RD1^bcg, RD3 y RD149 estuvieron presentes en M. bovis AF2122/97 y M. bovis MB3601, pero estuvieron ausentes en todas las demás cepas (cepas M. bovis BCG y M. microti). El comienzo de la región^{RD1 bcg} (Rv3871-Rv3879c) estaba ausente en las cepas de M. microti, al igual que la mayor parte de la región^mic RD1 (Rv3864-Rv3876). Para la región RD3 (profago phiRv1; Rv1573-Rv1586c), que se superpone parcialmente con la región RD149 (Rv1585c-Rv1587c), solo el ORF Rv1587c estaba intacto en las cepas de M. bovis BCG y M. microti. La región RD2 estuvo presente en todas las cepas, excepto en M. bovis BCG Danish 1311. Por último, las regiones RD207 y MiD1 parcialmente superpuestas estaban presentes en todas las cepas de MTBC excepto en M. microti OV254, lo que resultó en la ausencia o interrupción de CRISPR-Cas loci cas2 (Rv2816c), cas1 (Rv2817c), csm6 (Rv2818c) y csm5 (Rv2819c). Del mismo modo, la región MiD2 (Rv3188-Rv3189) estuvo presente en todas las cepas de MTBC analizadas, excepto en M. microti OV254.

Figura 3. Presencia de regiones RDs y MiDs en los conjuntos de datos belgas de M. microti y los genomas de referencia seleccionados. Este gráfico muestra el porcentaje de cobertura de las regiones de diferencia (RD) y las regiones deleadas (MiD) específicas de M. microti. El eje Y indica el porcentaje de la región que fue cubierta por lecturas, el eje X indica las diferentes deposiciones. Las barras están coloreadas por especies como se indica en la leyenda. La línea discontinua indica el umbral del 75% que se utilizó para clasificar las regiones como presentes o ausentes. Se incluyeron las siguientes cepas de referencia y belgas: M. bovis BCG Danish 1311 (SRR7983756), M. bovis AF2122/97 (ERR1744454), M. bovis MB3601 (ERR3825346), M. microti OV254 (ERR027295), M. microti VAR696 (SRR25473322), M. microti MI20-1 (SRR25473321) y M. microti MI20-2 (SRR25473320).

La presencia de los RD y MiD en todas las cepas de M. microti utilizadas en el análisis filogenómico (es decir, las 22 cepas de M. microti) se muestra en la Figura Suplementaria 1. Para la mayoría de las regiones analizadas, la cobertura fue muy similar entre todas las cepas de M. microti. Sin embargo, se observó cierta variabilidad entre las cepas para las regiones RD5^mic y RD6, que estaban casi completamente cubiertas en las cepas belgas, pero parcialmente ausentes o ausentes en algunas otras cepas. La región MiD2 estuvo presente en todas las cepas de M. microti, excepto en la referencia OV254. Del mismo modo, la región RD724 estuvo presente en todas las cepas de M. microti excepto en la cepa G25822. Se observaron diferencias para los loci CRISPR-Cas (es decir, las regiones MiD1/RD207) que estaban completamente presentes en las cepas ATCC 35782, ATCC 19422, 416/01, 8753/00, microti-45 y tres cepas belgas, pero (parcialmente) ausentes en otras cepas, incluidas las cepas 94-2272, Maus III, Maus IV, microti-36, microti-68 y G25821-G25828 (es decir, los genes cas2 y cas1 ausentes y el csm6 gen interrumpido) y la cepa de referencia OV254. Si bien este análisis revela la presencia de regiones genómicas, no proporciona información sobre la expresión de los ORFs localizados en estas regiones, ya que pueden estar afectados por SNPs e indels.

Análisis pangenómico e identificación de señales de polimorfismo

El análisis del pangenoma detectó un total de 4.668 genes, de los cuales 1.401 fueron anotados como proteínas hipotéticas. En la Figura complementaria 2 se muestra una representación esquemática de la superposición entre especies. Para obtener genes que pudieran ser potenciales biomarcadores para diferenciar M. microti de M. bovis, se extrajeron los genes presentes exclusivamente en las dos cepas virulentas de M. bovis o en todas las cepas de M. microti (n = 22) estudiadas (Figura suplementaria 2). Obsérvese que, a efectos de este estudio, los resultados de las cepas danesas 1311 de M. bovis BCG no se incluyeron en este análisis, ya que esta cepa vacunal difiere de las cepas virulentas tradicionales. La selección resultante se muestra en la Tabla 3 y se realizó a partir de 47 y 34 genes exclusivamente presentes en cepas virulentas de M. bovis y M. microti, respectivamente. De estos 81 genes, 30 fueron anotados como proteínas hipotéticas (es decir, 19 genes exclusivos de M. bovis y 11 de M. microti).

Entre los 47 genes exclusivamente presentes en el virulento M. bovis (incluidos los ORF localizados en las regiones^{RD1 mic}, MiD3 y RD3) había varios genes que codifican para las proteínas prolina-glutamato (PE) y prolina-prolina-glutamato (PPE), así como las proteínas EsxR (Rv3019c) y EsxS (Rv3020c). Esta deleción, correspondiente a la región MiD4 (Rv3018c-Rv3022c), se reportó previamente en la cepa OV254 de M. microti y otras cepas de M. microti aisladas de pacientes (40). Otros genes codificadores de proteínas, como el PE_PGRS21 (FCU26_1135), la hipotética proteína Rv0530A (locus_tag BQ2027_RS02780), una transposasa (BQ2027_RS17270) y la hipotética proteína (WP_015631092.1; locus_tag BQ2027_RS20600) también estuvieron ausentes en las 22 cepas de M. microti estudiadas y presentes en las cepas virulentas de M. bovis (Tabla 3, punto A).

Además de los genes asociados con las regiones RD4, RD11, RD12^bov y RD13 (en su mayoría ausentes en M. bovis), se identificaron otros tres genes adicionales entre 34 genes que estaban exclusivamente presentes en todos los M. microti. Estos genes codifican la proteína hipotética Rv1508A, una proteína hipotética (JN986_RS12585) y la proteína de membrana integral Rv3162c. Investigaciones posteriores revelaron que el gen Rv3162c estaba presente en los genomas de M. bovis, pero contenía una deleción de un solo nucleótido que daba lugar a un producto génico inactivo (Tabla 3, punto B). Cabe destacar que algunos loci registrados como eliminados en cepas de M. microti o M. bovis en el pangenoma son probablemente artefactos relacionados con el método de Roary utilizado en este trabajo, que se basa en genomas y anotaciones ensamblados (imperfectos). Otros genes estaban presentes en múltiples copias, con diferentes variantes, y su presencia o ausencia no pudo ser confirmada.

Además, investigamos las diferencias entre las cepas de M. microti estudiadas en este trabajo, centrándonos en las tres cepas belgas y la cepa de referencia OV254. Se encontró que tres ORFs (ORF2-ORF4) fueron eliminados o interrumpidos en las cepas belgas de M. microti. Estos se asociaron con la región RvD2 que incluye plcD, una glicosiltransferasa (ORF2), una sulfito oxidasa (ORF3) y un transportador de la familia RND (ORF4), que se sabe que está ausente en la cepa H37Rv de M. tuberculosis (región de deleción relacionada con H37Rv o RvD). La región adyacente a RvD2, llamada RD152, estaba completamente ausente en estas tres cepas. También se encontró que estas dos regiones estaban parcialmente (RvD2) o completamente (RD152) ausentes en la cepa M. microti-45, la cepa filogenéticamente más cercana de las tres cepas belgas. Además, se encontró que la región RD152 estaba ausente en la cepa G25824. Se encontró que otros genes estaban deledos en las tres cepas belgas, pero presentes en las cepas OV254 y M. bovis (Tabla 3, punto C). Además de los genes asociados a RDs/MiDs, exclusivamente ausentes en M. microti OV254, se identificaron otros cinco genes durante el análisis del pangenoma, como se muestra en la Tabla 3, punto D.

Identificación de genes codificantes de proteínas como potenciales marcadores de diagnóstico

Proteínas codificadas por los genes de RDs presentes en cepas virulentas de M. bovis y ausentes en todas las cepas de M. microti estudiadas (RD1^mic, RD3 y MiD3) y viceversa (RD4, RD11, RD12^bov, RD13 y N-RD25^bov/cap), así como las proteínas con variación de presencia/ausencia entre M. bovis virulento y M. microti Se analizaron más a fondo las cepas. Dado que el objetivo era identificar antígenos «universales», no se consideraron los genes que presentaban variación de presencia/ausencia entre las diferentes cepas de M. microti.

De estas 80 proteínas, se predijo que 52 tenían un péptido señal, que sería secretado de forma no clásica y/o que se localizaría en la matriz extracelular mediante las herramientas SignalP6.0, SecretomeP2.0, Psortb3.0, Gpos-mPLoc y CELLO2.5. Protein-BLAST reveló que 27 de estas 52 proteínas tenían poca o ninguna homología con ninguna secuencia de miembros MAC en la base de datos. Tres proteínas pertenecientes a la proteína de la familia PE/PPE (PE_PGRS50, PPE55 y PE_PGRS21) mostraron una similitud de secuencia entre el 40 y el 60%, pero una cobertura de consultas muy baja (5-18%) en las secuencias alineadas, y se mantuvieron en este trabajo. A continuación, se evaluó la propensión antigénica de estas 30 proteínas utilizando los servidores VaxiJen 2.0 y ANTIGENpro.

Después de estos pasos de selección, quedaron un total de 28 proteínas que fueron predichas por al menos una de las herramientas para ser secretadas o localizadas en la superficie celular, con baja conservación en micobacterias ambientales y propiedades antigénicas putativas (Tabla 4 y Tablas Suplementarias 3-5).

Predicción de epítopos serodominantes

Se identificaron un total de 157 regiones predichas como epítopos lineales y conformacionales con una puntuación de antigenicidad >0,5 en el servidor VaxiJen 2.0 y se consideraron como epítopos prometedores para el serodiagnóstico. Las secuencias peptídicas con mayor puntuación de antigenicidad se muestran en la Tabla 5 para las 28 proteínas analizadas.

Tabla 5. Lista final de los epítopos de las células B del análisis in silico.

Discusión

M. microti es menos virulento en los seres humanos y el ganado que otros miembros del MTBC (51), y no se considera un agente causal de tuberculosis en animales según la nueva ley de sanidad animal (UE 2016/429). Sin embargo, su propagación y el creciente número de casos notificados de infección en diferentes huéspedes (9-11, 13, 76, 77) es motivo de preocupación para la identificación y el tratamiento de estrategias de control de la tuberculosis en animales, especialmente cuando la prevalencia de la tuberculosis animal es baja. Los datos de campo sugieren que M. microti puede interferir con varias pruebas diagnósticas ante-mortem utilizadas en los programas de vigilancia de la tuberculosis animal en ganado, camélidos y otras especies [datos no publicados del NRL belga; (11)].

En este estudio, primero realizamos la secuenciación del genoma completo en tres cepas de campo de M. microti y comparamos la diversidad genómica dentro de los datos de la secuenciación del genoma completo de M. microti disponibles públicamente. En segundo lugar, comparamos los genomas completos de diferentes cepas de M. microti y M. bovis, mediante la caracterización de polimorfismos de secuencia grande (RDs, MiDs y RvD) y análisis pangenómicos para identificar marcadores potenciales para discriminar entre las dos micobacterias en el diagnóstico de TB animal. El análisis se centró en las proteínas que probablemente sean adecuadas para las pruebas diagnósticas serológicas. Los ensayos serológicos son las principales pruebas ante-mortem utilizadas para detectar la TB en camélidos [debido al bajo rendimiento de los ensayos IFNɤ y SICCT en estos huéspedes; (4)] sin embargo, actualmente no hay ensayos disponibles para distinguir entre las infecciones por M. microti y M. bovis. A continuación, se utilizó un enfoque in silico para seleccionar los mejores epítopos de células B a partir de estas proteínas para su uso en el serodiagnóstico.

El análisis filogenómico proporcionó información sobre la diversidad genética dentro de las especies de M. microti, incluidas las diferencias entre los aislados recolectados de diferentes especies hospederas. Como se mostró anteriormente en (39), las cepas de M. microti tendían a agruparse en función de su patrón de espoligopatrón más que de su especie huésped. Sin embargo, el soporte de arranque para las relaciones entre clados fue muy bajo, lo que indica una baja confianza en la ubicación relativa de los clados, posiblemente debido a los limitados datos de WGS disponibles para M. microti. Se optó por armonizar la detección del espoligotipo dedeterminándola in silico utilizando los conjuntos de datos de WGS para reducir el sesgo entre las muestras. En algunos casos, los espoligotipos que se extrajeron de los datos de la WGS difirieron ligeramente de los informados anteriormente (20, 38), lo que puede deberse a la dificultad inherente para determinar los espoligotipos, tanto en técnicas de laboratorio seco como de laboratorio húmedo. Las distancias de SNP entre cepas de M. microti aisladas de granjas de alpaca belga podrían proporcionar una indicación de posibles vínculos epidemiológicos entre cepas. Se ha estimado que la tasa media de sustitución de M. tuberculosis es de 0,3 a 0,5 SNP por genoma por año y se han definido umbrales de SNP que van desde 5 (estricto, lo más probable) hasta 12 SNP (más putativo) para inferir eventos de transmisión (78, 79). Varios estudios llevados a cabo en aislados de M. bovis sugieren que una tasa similar podría ser aplicable para especies micobacterianas adaptadas a los animales (78, 80-83). Sobre la base de estos umbrales de SNP, es poco probable que las cepas de M. microti VAR696 y MI20-1, MI20-2, aisladas de dos granjas belgas diferentes y que difieren en 18 SNP, estén relacionadas epidemiológicamente. En contraste, las dos cepas de M. microti MI20-1 y MI20-2 aisladas de la misma granja y que muestran 8 SNPs de diferencia, podrían estar relacionadas con un evento de transmisión pasado o interacciones epidemiológicas pasadas dentro de la misma granja. Sin embargo, estos perfiles de SNP también podrían deberse a diferentes introducciones anteriores, a la introducción de animales infectados (con diferentes genotipos) procedentes de diferentes localidades, o a diferentes cepas que circulan en la misma explotación o en la región.

Las variaciones genómicas, como RD o SNP, son marcadores utilizados para estudiar la evolución o la relación epidemiológica existente entre las especies del MTBC o las cepas de la misma especie (82, 84). Estas variaciones también pueden ser útiles como marcadores diagnósticos. En este estudio, las diferencias genómicas entre las cepas de M. microti probadas se investigaron primero comparando los RD y los MiD. Se observó poca variación entre las cepas de M. microti para la mayoría de las regiones analizadas. Como se informó anteriormente, las cepas de M. microti se caracterizan por la deleción de la región^micra RD1, que contiene varios genes que codifican el sistema de secreción ESX-1, incluidos los factores de virulencia ESAT6 (Rv3875) y CFP10 (Rv3874). Las regiones MiD3, MiD4 y RD3 también estuvieron ausentes en todas las cepas de M. microti analizadas, incluidas las cepas belgas de M. microti (20, 39, 40). Sin embargo, se observaron diferencias entre las diferentes cepas de M. microti para algunos RDs/MiD, como RD5^mic, RD6, RD207/MiD1 y MiD2. La región RD5 contiene los loci de fosfolipasa C (plcA, plcB y plcC), y es muy variable entre las diferentes especies de micobacterias tuberculosas, pero también entre cepas de la misma especie, como se muestra en (21) y (39). La región RD6, que contiene el elemento IS1532, también se describe como altamente variable entre las cepas de MTBC (21). La presencia o deleción (parcial) de la región RD207 (que incluye la región MiD1) en las cepas de M. microti da como resultado la pérdida de espaciadores en el locus DR y, por lo tanto, estaría asociada con los espoligotipos de llama y topillo observados (20, 85). Dado que el cribado de RD se limita a regiones del genoma de M. tuberculosis H37Rv, se realizó un análisis pangenómico para revelar diferencias adicionales. Este análisis reveló la ausencia de varios genes que, después de una investigación más detallada, se identificaron como asociados con las regiones RvD2 y RD152. Estas dos regiones solo se encontraron (parcialmente) delecionadas en las cepas belgas y M. microti-45, pero estaban completamente presentes en la OV254 de referencia y otras cepas de M. microti estudiadas (excepto en la región RD152 que también se encontró delecionada en la cepa G25824). La región RvD2 se encuentra aguas abajo del gen plcD (Rv1755c) y codifica tres ORF (Mb1785-Mb1787) que se predice que son una proteína hipotética, una sulfito oxidasa putativa y una proteína transportadora transmembrana putativa (86-88). Se sabe que esta región está ausente en M. tuberculosis H37Rv, pero está presente en otros miembros del MTBC como M. bovis. La región RD152 codifica los genes Rv1758-Rv1765c (89), incluyendo una cutinasa putativa (cutinasa) y un miembro de la familia de proteínas PE_PGRS (wag22). Las deleciones de la región RD152 se han identificado previamente en las cepas nueve del linaje de M. africanum (90) y en las cepas de M. tuberculosis Beijing/W (91). Hasta donde sabemos, estas deleciones nunca han sido reportadas en M. microti u otras especies de MTBC adaptadas a los animales. Ambas regiones han sido reportadas como puntos calientes para las secuencias de inserción de IS6110, lo que puede facilitar eventos de recombinación (20, 85, 92). Por lo tanto, un mecanismo de deleción mediado por IS6110 podría ser responsable de la pérdida de las regiones RvD2 y RD152 en estas cepas. Sin embargo, las cepas con estas deleciones aún eran capaces de causar lesiones de tuberculosis en alpacas, como se observó con las cepas belgas de M. microti, lo que sugiere que estas regiones pueden no ser esenciales para la virulencia.

Se seleccionaron genes que mostraban variación de presencia-ausencia como posibles marcadores proteicos para distinguir las infecciones por M. bovis de las infecciones por M. microti. Se identificaron un total de 80 genes codificantes de proteínas que estaban exclusivamente presentes en todas las cepas de M. microti analizadas y ausentes en todas las cepas virulentas de M. bovis analizadas, o viceversa. El método de detección génica empleado en el análisis del pangenoma se basó, en algunos casos, en ensamblajes de genomas fragmentados. Por lo tanto, es posible que los genes se hayan pasado por alto debido a fracturas de ensamblaje u otras imprecisiones en los genomas ensamblados o predicciones de genes, lo que pone de relieve la necesidad de verificación in vitro. Sin embargo, este tipo de análisis son un método de cribado potente y rápido que puede utilizarse para generar bibliotecas de péptidos que se pueden probar in vitro. Muchos biomarcadores potenciales identificados en el presente análisis pangenómico han sido reportados previamente como antígenos potenciales para mejorar el diagnóstico serológico de la tuberculosis humana y/o bovina: Rv3872 (PE35), Rv3874 (CFP10), Rv3875 (ESAT6), Rv3876 (EspI) en RD1 (93-96), Rv1573, Rv1577c en RD3 (97), o Rv1508c, Rv1509, Rv1514c, Rv1516c en RD4 (93, 97). Además, varios de los genes con variación de presencia-ausencia identificados en este estudio codifican proteínas pertenecientes a las familias PE, PPE y Secuencia Polimórfica Rica en GC (PE_PGRS), incluyendo PE_PGRS21, PPE55 y PE_PGRS50. Las proteínas de estas familias, que constituyen ~10% del genoma de M. bovis (22), han sido descritas como factores de virulencia implicados en la patogénesis de la tuberculosis, pero también como factores que tienen un papel potencial en la variabilidad antigénica dentro del MTBC (98, 99). Además, se ha reportado que varias proteínas de la familia PE/PPE/PE_PGRS son inmunogénicas y pueden ser útiles en el diagnóstico de tuberculosis humana y/o animal (98, 100). Cabe destacar que los antígenos ESAT6 y CFP10, que se utilizan en varios ensayos para el diagnóstico de la tuberculosis en animales (por ejemplo, el ensayo IFNɤ y la prueba de tuberculosis Enferplex Camelid), están ausentes en las cepas de M. microti, pero presentes en las cepas de M. bovis (7, 101, 102). En consecuencia, la ausencia de una respuesta de anticuerpos a estos antígenos no confirma la ausencia de infección por M. microti, lo que pone de manifiesto la importancia de los antígenos específicos de M. microti.

El principal problema en el establecimiento de sistemas de inmunodiagnóstico es la identificación de proteínas inmunogénicas específicas de las especies objetivo. Se realizaron varios análisis in silico adicionales para obtener un conjunto de proteínas inmungénicas potenciales óptimas, incluida una evaluación de la homología de secuencia, la probabilidad antigénica y la accesibilidad de los anticuerpos. Las proteínas con alta similitud/identidad de secuencia con micobacterias ambientales, como los miembros de la MAC comúnmente aislados del ganado, pueden reaccionar de manera cruzada en las pruebas serológicas y, por lo tanto, se excluyeron (61, 63). Después de este filtrado adicional, se retuvieron un total de 28 proteínas candidatas. Sin embargo, es posible que los antígenos efectivos hayan sido eliminados por este filtrado. Por ejemplo, no se predijo que proteínas como Rv3871 (103), Rv1509, Rv2658c (97) y Rv1586c (104) fueran secretadas/localizadas en la superficie celular y/o antigénicas en este trabajo, mientras que se ha informado que inducen una respuesta de anticuerpos en pacientes con tuberculosis. Dado que nuestro objetivo era maximizar la detección de casos de infección por M. bovis vs. M. microti, solo se consideraron los antígenos proteicos «universales» presentes en todas las cepas de M. microti estudiadas, pero ausentes en todas las cepas virulentas de M. bovis (y viceversa). Aunque los genes que estaban ausentes/presentes en las cepas belgas de M. microti (y algunas otras cepas) no se consideraron como antígenos potenciales en este trabajo, puede ser valiosa una mayor investigación de estas proteínas.

La producción de proteínas recombinantes para obtener antígenos micobacterianos es una tarea desafiante asociada con altos costos y variabilidad de antígenos relacionados con los sistemas de expresión y los pasos de purificación de proteínas recombinantes. El uso de péptidos sintéticos puede proporcionar uniformidad en las preparaciones de antígenos y, por lo tanto, en los ensayos (105). Por lo tanto, la identificación de péptidos que contengan epítopos de células B inmunodominantes puede ser esencial para el desarrollo de estrategias diagnósticas dirigidas a la detección de anticuerpos. Una ventaja adicional es la reducción del coste asociado al número de péptidos para los que se debe evaluar experimentalmente la reactividad de los anticuerpos. Muchos estudios se han centrado principalmente en epítopos lineales de células B, mientras que una fracción importante de los epítopos de células B son conformacionales (106). Hasta hace poco, la predicción de epítopos conformacionales de células B requería que la estructura de la proteína se depositara en la base de datos PDB o el uso de herramientas de modelado de homología (106, 107). Sin embargo, el recientemente lanzado AlphaFold basado en redes neuronales es una poderosa alternativa que permite una predicción altamente precisa de la estructura de las proteínas (74). En este trabajo, se buscaron péptidos basados en epítopos de células B lineales y conformacionales utilizando varias herramientas in silico disponibles en línea para predecir epítopos de células B en función de secuencias de aminoácidos y / o datos estructurales de proteínas (74, 108). Por lo tanto, se identificaron un total de 157 péptidos que contenían epítopos de células B predichos a partir de las 28 proteínas seleccionadas previamente utilizando el enfoque in silico. Curiosamente, se informó previamente que algunos péptidos, que se derivaron de la secuencia completa de las proteínas candidatas, como el péptido EISTNIRQAGVQYSRADEEQ para RV3874 (109) o el péptido AGMKLGWHPYHFPDEPDSKQ para Rv2653c (110), inducen una respuesta CMI de moderada a fuerte en animales tuberculosos o pacientes, lo que sugiere que estos péptidos podrían activar tanto la inmunidad humoral como la celular y tienen potencial en diversas aplicaciones de diagnóstico. Sin embargo, no se encontró información en la literatura científica sobre el reconocimiento de estos péptidos específicos por parte de los anticuerpos en un ensayo serológico.

Los ensayos in silico pueden guiar las pruebas experimentales para detectar antígenos putativos de manera más eficiente. En este trabajo, se utilizó un enfoque in silico para identificar péptidos antigénicos putativos que contienen epítopos de células B que discriminan entre infecciones por M. bovis y M. microti en el serodiagnóstico de tuberculosis animal. No obstante, se requieren análisis in vitro para identificar péptidos inmunológicamente relevantes entre los seleccionados in silico. La inmunorreactividad de los péptidos debe evaluarse mediante inmunoensayo (por ejemplo, ELISA) con un número suficiente de sueros de referencia, es decir, sueros de animales presuntamente no infectados con un estado conocido y sueros de animales con infección por M. bovis o M. microti confirmada por cultivo bacteriano y métodos moleculares. Los péptidos con los valores más altos de sensibilidad y especificidad se evaluarán más a fondo para determinar su capacidad serodiagnóstica en un panel más grande de sueros. Datos anteriores informaron que la respuesta de anticuerpos a los antígenos puede aumentar en bovinos, alpacas y cabras después de la prueba de tuberculina intradérmica, lo que puede afectar el rendimiento de las pruebas serológicas, en particular la sensibilidad (4, 14, 109). Esto debería ser considerado en los estudios futuros. Además, aunque el uso de péptidos sintéticos cuidadosamente seleccionados disminuye la inclusión de regiones de reacción cruzada de los antígenos proteicos, podría ser necesario confirmar la ausencia de una respuesta específica en el ensayo utilizando sueros de animales infectados por NTM. Dado que las combinaciones de antígenos micobacterianos (péptidos o proteínas recombinantes) están indicadas para mejorar el serodiagnóstico de la tuberculosis en humanos y animales (16, 105, 111), el rendimiento diagnóstico de los péptidos confirmados como inmunogénicos en ensayos preliminares podría evaluarse más a fondo en ensayos serológicos multiplexados o mediante antígenos polipeptídicos.

Con el uso de WGS, pudimos extraer biomarcadores potenciales en todo el genoma. Además, el análisis basado en SNP del genoma completo nos permitió caracterizar las relaciones entre cepas. A medida que aumenta el número de conjuntos de datos de la secuenciación del genoma completo de M. microti, a lo que contribuye nuestro estudio, la eficacia de estos análisis basados en la secuenciación del genoma completo puede aumentar aún más. En conclusión, los resultados presentados en este estudio pueden contribuir al desarrollo de pruebas serológicas que puedan diferenciar entre M. bovis y M. microti en el futuro, evitando así diagnósticos erróneos en el control de TB en animales.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres de los repositorios y los números de acceso se pueden encontrar en el artículo/Material complementario.

Declaración ética

No se requirió la aprobación ética para el estudio con animales de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales porque los órganos de las alpacas se obtuvieron como parte del programa nacional belga de control de la tuberculosis bovina (TBB), de acuerdo con las directrices oficiales de la Autoridad Federal para el control de la TBB en Bélgica [es decir, la Agencia Federal para la Seguridad de la Cadena Alimentaria [FASFC] y los servicios veterinarios].

Contribuciones de los autores

CM: Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Metodología, Software, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. BB: Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Metodología, Software, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. VL-L: Escritura – revisión y edición. KV: Metodología, Supervisión, Redacción – revisión y edición. SD: Metodología, Redacción – revisión y edición. NR: Escritura – revisión y edición. LM: Escritura, revisión y edición. DF: Redacción – revisión y edición. SM: Conceptualización, Supervisión, Redacción – revisión y edición.

Financiación

El/los autor/es declara(n) que no se recibió apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo.

Reconocimientos

Agradecemos a Wiebke Jansen y Philippe Vannoorenberghe por su asistencia técnica, junto con la Agencia de Sanidad Animal y Vegetal (APHA) por la información sobre las cepas de M. microti aisladas de animales en el Reino Unido. También agradecemos a los técnicos del servicio de actividades transversales en Genómica Aplicada en Sciensano, Bélgica, por realizar una de las corridas de secuenciación del genoma completo. Además, nos gustaría agradecer al Laboratorio Europeo de Referencia para la Tuberculosis Bovina por su asistencia en la detección de la infección por parte del MTBC.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda hacer su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2024.1446930/full#supplementary-material

Figura complementaria 1 | Presencia de regiones RDs y MiDs en los conjuntos de datos de M. microti. En esta figura se muestra el porcentaje de las regiones RD y MiDs correspondientes que se cubrieron con el enfoque basado en mapeo de lectura para cada conjunto de datos.

Figura complementaria 2 | Resultados del análisis pangenómico, que muestran el número de genes detectados exclusivamente en todas las cepas de M. microti y todas las cepas virulentas de M. bovis. Nótese que se consideraron las 22 cepas de M. microti y las dos cepas virulentas de M. bovis (AF2122/97 y MB3601). Las barras horizontales indican el número total de genes detectados en las especies correspondientes mediante el análisis del pangenoma. Las líneas verticales indican el tamaño de la superposición, tal como lo indican los puntos en la matriz de pertenencia.

Referencias