Introducción

La leucosis aviar (AL) es una enfermedad inmunosupresora causada por la infección por el virus de la leucemia aviar (ALV) (1). Las principales manifestaciones de la enfermedad son tumores multiorgánicos, inmunosupresión e infecciones fáciles o secundarias de otros patógenos. Conduce a pérdidas económicas directas después de la disminución del rendimiento de la producción, lo que afecta gravemente el desarrollo saludable de la industria avícola (2). Entre los 11 subgrupos de ALV conocidos, los pollos más infectados en China fueron el subgrupo J, seguido por el subgrupo A y el subgrupo B (3). El ALV es un retrovirus aviar común y natural. La transmisión del ALV se produce principalmente a través de la vía vertical desde el embrión infectado hasta la descendencia, y también puede transmitirse horizontalmente tras el contacto directo o indirecto con los pollos infectados o los contaminantes contaminados por el virus (4), lo que tiene una velocidad de transmisión rápida y una fuerte infectividad. No solo eso, sino que el ALV también puede transmitirse a través de vacunas vivas comerciales contaminadas (5). Las hembras infectadas con ALV-J a través de la inseminación artificial pueden transmitir el virus verticalmente a su descendencia a través de sus huevos (6), por lo que la única forma de aislar la transmisión del ALV es eliminar los pollos positivos mediante pruebas para detectar el patógeno (7). En respuesta, se han realizado estudios sobre el desarrollo de una vacuna contra el ALV (8), pero la vacuna no proporciona una protección adecuada para las aves de corral. Por lo tanto, el cribado precoz del virus y la detección rápida son esenciales para la prevención y el control de los virus antivirus.

La amplificación por adición de recombinasa (RAA) es un nuevo tipo de tecnología de amplificación rápida de ácidos nucleicos que permite una rápida expansión de ADN o ARN a baja temperatura (generalmente 37 °C), con el producto de amplificación obtenido en 30 min (9, 10). Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) y sus proteínas relacionadas (Cas) constituyen el sistema CRISPR/Cas. Su capacidad de corte transversal permite la identificación y el corte precisos de objetivos específicos de ácidos nucleicos. El sistema se utiliza como una herramienta útil para la edición del genoma y el diagnóstico de ácidos nucleicos debido a su alta sensibilidad y especificidad (11, 12). Entre ellos, Cas13a tiene la capacidad de reconocer objetivos de ARN a través de ARN CRISPR (crRNA) y actividad de corte colateral (13). Basado en la proteína Cas13a, el sistema SHERLOCK combina Cas13a con la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) para lograr el diagnóstico molecular mediante la utilización de la actividad de escisión colateral (14). En este experimento, se utilizó el método RAA-CRISPR/Cas13a-tira reactiva de flujo lateral (LFD) para detectar el ALV, y el principio de reacción se mostró en la Figura 1. Después de la extracción de ácido nucleico del patógeno que se va a probar, se realiza la reacción de amplificación de RAA. El complejo formado por la recombinasa, la proteína de unión monocatenaria y el cebador RAA escanea el ADN bicatenario y el ADN bicatenario no rotado en la secuencia homóloga al cebador. La proteína de unión monocatenaria evita que el ADN monocatenario se repliegue, y luego la ADN polimerasa completa la extensión de la cadena. Después de eso, el ADN que contiene el promotor T7 es transcrito por T7 in vitro para formar ARN monocatenario que contiene un gran número de secuencias diana. Cas13a se une al crRNA para reconocer la secuencia diana. Si el complejo reconoce la secuencia diana, se activa la actividad de escisión colateral de la nucleasa Cas13a. La 6-FAM-Biotina informó que la molécula fue cortada y unida al complejo de anticuerpos anti-FAM marcado con oro coloidal, y la línea de detección (T) fue positiva. Si el complejo no reconoce la secuencia diana, la nucleasa Cas13a no se activa, y el complejo de la molécula reportera con anticuerpos anti-FAM marcados con oro coloidal es capturado por estreptavidina, y solo la línea de control (C) es negativa. En la actualidad, la tecnología RAA-CRISPR/Cas13a se ha utilizado ampliamente en la detección del nuevo coronavirus (SARS-CoV-2) (15), virus de plantas (16), virus de la peste porcina africana (PPA) (17) y otros campos.

En este estudio, se combinaron RAA, CRISPR/Cas13a y LFD para diseñar el cebador RAA y el crRNA de acuerdo con la secuencia conservada del gen ALV env. Después de establecer y optimizar el sistema de reacción RAA-CRISPR/Cas13a-LFD, se evaluó su especificidad, sensibilidad, repetibilidad y fiabilidad clínica, con el fin de establecer un método de detección de ALV rápido, sensible, específico y visualizado en resultados, con el objetivo de proporcionar una herramienta poderosa para la detección, prevención y control rápidos de ALV en el campo.

Materiales y métodos

Extracción de ácidos nucleicos

ALV, FAdV, IBDV, NDV y MDV fueron cepas almacenadas en el laboratorio de enfermedades infecciosas animales de la Universidad Agrícola de Hebei. El IBV (AV1511) y el ILTV (AV195) se compraron a la Administración de Medicamentos Veterinarios de China. El ADN de FAdV, ILTV, MDV y el ARN de ALV, IBDV, NDV e IBV se extrajeron mediante TIANamp Virus DNA/RNA Kit (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.), y el ARN se transcribió inversamente en ADNc y se almacenó a -20 °C para su uso futuro.

Diseño de cebadores y crRNAs y cribado de cebadores

De acuerdo con la secuencia del gen env de ALV registrada en GenBank (número de entrada: MF926336.1, OP837418.1, ON840108.1, HQ260975.1, MG700538.1, MG700535.1, MG700534.1, MG700537.1, MG700533.1, HM235664.1, KC841153.1), se utilizaron el software SnapGene y DNAMAN para el análisis comparativo para determinar la secuencia conservada en la región gp37 del gen env (Figura 2A), y se diseñaron tres pares de cebadores específicos de RAA (Tabla 1). Añadir en el cebador delantero secuencias promotoras de ARN polimerasa T7 del extremo 5′ (T7; GAAATTAAT ACGACTCACTATAGGG; Figura 2B). Utilizando el ADNc de ALV como plantilla, se realizó una reacción de amplificación de RAA. El sistema de reacción fue de 50 μL, incluyendo tampón 25 μL, agua purificada 13,8 μL, cebador directo 2,1 μL (10 μM), cebador inverso 2,1 μL (10 μM), molde de ADN 2 μL y 5 μL de acetato de magnesio. La amplificación se realizó a 37°C durante 30 min, y luego se purificaron los productos amplificados. Los resultados se observaron mediante electroforesis de agarosa al 2% y se seleccionaron un par de cebadores óptimos. Además, se diseñó crRNA en la secuencia conservada del gen env, crRNA por LwaCas13a estructura de anillo de tallo fijo (GTTTTAGTCCCCTTCGTTTGGGGTAGTCTAA ATCCCCTAGTGTGAGTCATTTC) y la longitud de la secuencia diana de 28 nt (Tabla 1), que se incluyó en el área de amplificación del cebador. En este experimento se utilizó PCR-F/R para verificar la sensibilidad de la electroforesis de PCR-agarosa. Tanto el cebador como el crRNA fueron sintetizados por la empresa Sangon Biotech (Shanghai).

Construir plásmido estándar

El ADNc de ALV se utilizó como molde para la amplificación por PCR. El sistema de reacción de PCR fue de 25 μL, incluyendo 2 × Taq Mix 12,5 μL, cebador directo (10 μM) 0,5 μL, cebador inverso (10 μM) 0,5 μL, plantilla 1 μL, ddH₂O 10,5 μL. El procedimiento de reacción fue el siguiente: 94 °C 5 min, 94 °C 30 s, 53 °C 30 s, 72 °C 30 s, 35 ciclos, 72 °C extendido durante 5 min. Los productos de PCR se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Se utilizó el kit de extracción de gel de ADN de columna SanPrep (Sangon Bioengineering Co., Ltd., Shanghai, China) para la recuperación de gel. El ADN recuperado se conectó al vector T-Vector pMD 19 (Takara Biomedical Technology Co., Ltd., Beijing, China) y se introdujo en células competentes DH5α. Después del cultivo nocturno, se examinaron las colonias azules y blancas, se seleccionaron las colonias blancas y se extrajeron los plásmidos con el kit de extracción de plásmidos (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.). El plásmido estándar fue secuenciado por Sangon Biotech.

Según la fórmula, se calcula el número de copias de ADN contenidas en un plásmido por unidad de volumen:

El plásmido estándar construido se diluyó a 10⁹–10⁰ copias/μL mediante el método de dilución de 10 veces y se almacenó a -20 °C para su uso posterior.

Establecimiento del método de detección RAA-CRISPR/Cas13a-LFD

La reacción RAA se realizó de acuerdo con las instrucciones del kit de amplificación de ácido nucleico RAA (Anhui Microanaly Genetech Co., Ltd., Hefei, China). El sistema de reacción RAA fue de 50 μL, incluyendo tampón 25 μL, agua purificada 13,8 μL, cebador directo 2,1 μL (10 μM), cebador inverso 2,1 μL (10 μM), molde de ADNc 2 μL y 5 μL de acetato de magnesio. En primer lugar, los reactivos, excepto el acetato de magnesio, se añadieron sucesivamente al tubo de expansión que contenía la enzima de liofilización, y después de mezclar suavemente a mano, se añadieron 5 μL de acetato de magnesio a la tapa, que luego se amplificó en un dispositivo de amplificación a temperatura constante a 37 °C durante 30 min.

El sistema de reacción RAA-CRISPR/Cas13a-LFD es de 50 μL, incluyendo 4 μL de mezcla de tampón NTP (New England Biolabs; 25 mmol/L), 2 μL de inhibidor de la RNasa (Takara Biomedical Technology Co., Ltd., Pekín, China; 40 U/μL), 4 μL Cas13a (Magigen China; 80 nmol/L), 2 μL de crRNA (80 ng/uL), 2 μL de sonda de doble marcado de ARN (Bio-Lifesci, China; 100 μmol/L), 1 μL de mezcla de ARN polimerasa T7 (New England Biolabs), 0,5 μL de MgCl₂ (Coolaber, China), 1 μL de tampón HEPES (Solarbio, China), 28,5 μL de agua estéril sin enzimas y 5 μL de producto de amplificación RAA. Los reactivos se mezclaron completamente y se incubaron a 37 °C durante 25 min. Posteriormente, se añadieron 50 μL de productos de reacción a la LFD y los resultados se observaron en un plazo de 3 a 5 minutos.

Optimización del sistema de reacción RAA-CRISPR/Cas13a-LFD

Los factores que afectan la eficiencia de la amplificación, incluido el tiempo de amplificación de RAA, la concentración de Cas13a, la concentración de crRNA y el tiempo de reacción CRISPR, se optimizaron mediante el uso del sistema de reacción anterior. El tiempo de amplificación de RAA está configurado para comenzar a partir de 10 minutos y aumentar el gradiente cada 5 minutos. Si aparecen líneas de detección claras, este tiempo se selecciona como el tiempo óptimo de amplificación de RAA. La concentración de Cas13a se fijó en 40 nmol/L y aumentó en un gradiente de cada 20 nmol/L, mientras que otros factores permanecieron sin cambios. Cuando apareció una línea de detección clara, esta concentración se seleccionó como la concentración óptima de Cas13a. Bajo la concentración óptima de Cas13a, la concentración de crRNA se estableció en 10 ng/μL, y el aumento del gradiente fue cada 10 ng/μL, y otros factores permanecieron sin cambios. Si aparecía una línea de detección clara, la concentración se seleccionaba como la concentración óptima de ARNcr. Bajo la concentración óptima de Cas13a y crRNA, el tiempo de reacción de CRISPR se estableció para comenzar a partir de 10 minutos y aumentar el gradiente cada 5 minutos hasta que apareciera una línea de detección clara.

Detección específica

El ADN de FAdV, ILTV y MDV y el ADNc de ALV, IBDV, NDV e IBV se utilizaron como plantillas, respectivamente, y ddH₂O se estableció como control negativo para evaluar la especificidad del ensayo RAA-CRISPR/Cas13a-LFD.

Detección de sensibilidad

Se utilizó el plásmido estándar ALV diluido (10^7-10 0 copias/μL) como plantilla, y ddH₂O como control negativo. Para la detección se utilizó el método PCR-Agar-gel, electroforesis, qPCR y RAA-CRISPR/Cas13a-LFD, y cada método se repitió tres veces para evaluar su sensibilidad.

El sistema de reacción de PCR fue de 25 μL, compuesto por 2 × Taq Mix de 12,5 μL, cebador directo (10 μM) 0,5 μL, cebador inverso (10 μM) 0,5 μL, molde (10^7-10 0 copias/μL) 1 μL, ddH₂O 10,5 μL. El procedimiento de reacción fue el siguiente: 94 °C 5 min, 94 °C 30 s, 53 °C 30 s, 72 °C 30 s, 35 ciclos, 72 °C extendido durante 5 min. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para determinar el límite mínimo de detección.

El sistema de reacción de qPCR fue de 20 μL, incluyendo TB Green Premix Ex TaqTMII (TliRNaseH Plus; 2×; Takara Biomedical Technology Co., Ltd., Pekín, China) 12,5 μL, cebadores directos e inversos PCR (10 μM) 1,0 μL cada uno, plantillas (10⁶–10⁰ copias/μL) 1,0 μL, ddH₂O 9,5 μL, Procedimiento de reacción: 95 °C 30 s; Los resultados se observaron después de 40 ciclos a 95 °C durante 5 s y a 60 °C durante 30 s.

El ensayo RAA-CRISPR/Cas13a-LFD utilizó 10^5-10 0 copias/plásmido estándar μL como plantilla y se llevó a cabo de acuerdo con el sistema de reacción optimizado para determinar el límite mínimo de detección del método.

Detección de repetibilidad

Se utilizaron tres plásmidos estándar de ALV con diferente concentración después de la dilución (10⁶ copias/μL, 10³ copias/μL y 10⁰ copias/μL) como plantilla, y la prueba se repitió 3 veces para cada concentración, y ddH₂O se estableció como control negativo. Evaluar la repetibilidad del método RAA-CRISPR/Cas13a-LFD.

Pruebas de muestras clínicas

Las muestras de hígado y riñón de 130 pollos enfermos del norte de China con diagnóstico clínico preliminar de AL se detectaron mediante PCR-Agar-electroforesis, RAA-CRISPR/Cas13a-LFD y qPCR (las muestras se recogieron en 7 granjas de pollos). Se calculó la tasa de coincidencia del método RAA-CRISPR/Cas13a-LFD y los dos métodos de detección, y se evaluó la factibilidad de la aplicación del método en muestras clínicas.

Resultados

Cribado de cebadores RAA

Los resultados del cribado de cebadores mostraron que la eficiencia de amplificación de las combinaciones de cebadores RAA-F2/R1, F2/R2 y F2/R3 fue mayor que la de otras combinaciones de cebadores, entre las cuales la combinación de cebadores F2/R3 no mostró amplificación inespecífica, por lo que se seleccionó la combinación RAA-F2/R3 como el mejor cebador. El resultado se muestra en la Figura 3.

Figura 3. Cribado de cebadores para la detección de ALV mediante ensayo RAA. La combinación de cebadores F2 / R3 tiene una buena eficiencia de amplificación y no hay amplificación inespecífica, que es la mejor combinación de cebadores. RAA: amplificación asistida por recombinasa.

Optimización del sistema de reacción RAA-CRISPR/Cas13a-LFD

Sobre la base de la línea de detección clara de LFD, se verificaron las condiciones óptimas de reacción de RAA-CRISPR/Cas13a-LFD como un tiempo de amplificación de RAA de 20 min, una concentración de crRNA de 30 ng/μL y un tiempo de reacción CRISPR de 20 min, respectivamente. Cuando la concentración de Cas13a es de 60 y 80 nmol/L, aparecen líneas de detección claras en ambos casos, por lo que la concentración óptima de Cas13a es de 60 nmol/L. El resultado se muestra en la Figura 4.

Figura 4. Optimización del sistema de reacción RAA-CRISPR/Cas13a-LFD. (A) Optimización del tiempo de amplificación de RAA, el tiempo óptimo de amplificación de RAA fue de 20 min. (B) Cribado de la concentración óptima de Cas13a, la concentración óptima de Cas13a fue de 60 nmol/L. (C) Cribado de concentración óptima de crRNA, la concentración óptima de crRNA fue de 30 ng/μL. (D) Detección de tiempo de respuesta CRISPR óptimo, el tiempo de reacción óptimo de CRISPR fue de 20 min. Línea C, línea de control de calidad; Línea T, línea de prueba.

Detección específica

La prueba de especificidad mostró que solo el ALV fue positivo y no se encontró una línea de prueba entre otros virus y los controles negativos, lo que indica que no hubo reacción cruzada entre el ALV y el MDV, FAdV, IBDV, NDV, ILTV e IBV, y el método tuvo buena especificidad. El resultado se muestra en la figura 5.

Figura 5. Especificidad del ensayo RAA-CRISPR/Cas13a-LFD. NC: control negativo; línea C, línea de control de calidad; Línea T, línea de prueba. Solo el ALV mostró las líneas T y C, mientras que otros virus y el control negativo mostraron solo la línea C.

Detección de sensibilidad

Los resultados de la evaluación de sensibilidad mostraron que el límite mínimo de detección de PCR fue de 10⁴ copias/μL, qPCR fue de 10¹ copias/μL y RAA-CRISPR/Cas13a-LFD fue de 10⁰ copias/μL. La sensibilidad es 10 veces mayor que la de la qPCR y 10.000 veces mayor que la de la PCR. El resultado se muestra en la Figura 6.

Figura 6. Sensibilidad del ensayo RAA-CRISPR/Cas13a-LFD. (A) MÉTODO RAA-CRISPR/Cas13a-LFD, el límite mínimo de detección es de 10⁰ copias/μL. (B) Método de electroforesis PCR-agarosa, el límite mínimo de detección es de 10⁴ copias/μL. (C) método qPCR, el límite mínimo de detección es de 10¹ copias/μL. NC: control negativo; línea C, línea de control de calidad; Línea T, línea de prueba.

Detección de repetibilidad

Los resultados de la prueba de repetibilidad mostraron que los plásmidos estándar de diferentes concentraciones fueron positivos y el grupo control negativo, lo que indica que el método de detección tuvo buena repetibilidad y estabilidad. El resultado se muestra en la Figura 7.

Figura 7. Repetibilidad del ensayo RAA-CRISPR/Cas13a-LFD. (De la A a la C) Tres ensayos repetidos de tres concentraciones de plantilla. NC: control negativo; línea C, línea de control de calidad; Línea T, línea de prueba. Las líneas T y C se mostraron en los tres grupos de replicación, y solo las líneas C se mostraron en los controles negativos.

Pruebas de muestras clínicas

Los resultados de las pruebas de muestras clínicas de ALV mostraron (Tabla 2) que se detectaron 42 muestras positivas mediante RAA-CRISPR/Cas13a-LFD, y la tasa de coincidencia con la electroforesis de PCR-Agarosa fue del 97,69% y del 99,23% con el método qPCR, lo que indica que el método RAA-CRISPR/Cas13a-LFD tiene una capacidad de detección precisa y puede utilizarse para la detección clínica.

Tabla 2. Resultados de las pruebas clínicas de los dos métodos.

Discusión

Desde su primer descubrimiento en China en 1999, el ALV-J se ha extendido rápidamente por todo el país. En su día fue una enfermedad importante que ponía en peligro a la industria avícola de China, con una tasa de mortalidad y morbilidad de hasta el 50%, lo que supuso una gran amenaza para el suministro de productos de pollo ponedor durante mucho tiempo y provocó graves pérdidas económicas a la industria avícola (18).

En la actualidad, los métodos comúnmente utilizados para detectar el ALV en la clínica incluyen el aislamiento del virus, el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), la PCR, la PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real (qPCR) y la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). El aislamiento y la identificación de virus es el estándar de oro para la detección de ALV, pero requiere cultivo celular, lo que requiere mucho tiempo y laboriosidad. El método de detección LAMP tiene una alta sensibilidad, pero su diseño de cebador es complejo y fácil de contaminar (19, 20), lo que no es adecuado para una detección rápida a nivel de base. El método ELISA también debe combinarse con el aislamiento del virus y la PCR, y la operación es complicada (21). Aunque el método de detección de qPCR tiene una alta sensibilidad y especificidad (22) y puede juzgarse con precisión, requiere instrumentos complejos y costosos y experiencia del operador, y no es adecuado para un diagnóstico rápido in situ. Por lo tanto, establecer un método de detección rápido, preciso y conveniente es particularmente importante para el diagnóstico, la prevención y el control rápidos de la AL. El sistema CRISPR/Cas es un sistema de diagnóstico desarrollado por primera vez para ácidos nucleicos moleculares en 2016 (13). El RAA puede amplificar ácidos nucleicos virales a una temperatura de 37 °C a 42 °C sin instrumentos especiales de temperatura variable, y puede amplificar la señal inicial, que puede utilizarse para mejorar la sensibilidad del sistema CRISPR/Cas (12). Con la rápida evolución del diagnóstico molecular, la necesidad de pruebas rápidas ha aumentado, y los sistemas CRISPR/Cas, combinados con diversas tecnologías de amplificación isotérmica, se han utilizado para detectar varios tipos de patógenos, incluidas enfermedades virales, bacterianas y parasitarias. Zhang et al. (23) combinaron RAA con el sistema CRISPR-Cas13a para detectar el virus de la gripe aviar y utilizaron la amplificación específica de fragmentos de genes diana para proporcionar un nuevo método de detección para la detección del virus de la gripe aviar. An et al. (24) combinaron RPA con el sistema CRISPR-Cas13a para proporcionar un método de detección simple, rápido y específico para Salmonella. Zhao et al. (25) combinaron RAA con CRISPR/Cas13a para establecer un método de detección visual rápida y sensible para Toxoplasma gondii.

En este estudio, se desarrolló un método RAA-CRISPR/Cas13a-LFD para la detección rápida de la leucemia aviar, y los resultados se determinaron mediante el uso de tiras de flujo transversal. El método RAA-CRISPR/Cas13a-LFD puede completar la detección de genes objetivo en solo 40 minutos, y la capacidad de corte dirigido de la unión de Cas13a con crRNA hace que este método tenga una fuerte especificidad. La combinación de la tecnología RAA y el sistema CRISPR/Cas mejora la sensibilidad de detección. El límite mínimo de detección fue de 10⁰ copias/μL, que fue 10 veces más sensible que la qPCR y 10.000 veces más sensible que la PCR. Miao et al. (26) utilizaron RAA-CRISPR/Cas13a-LFD para detectar el virus Nipah con un límite de detección de 10³ copias/μL, que fue ligeramente inferior a la sensibilidad de este estudio. Dou et al. (27) establecieron un método de PCR cuantitativa multiplex para la detección de leucemia aviar en los subgrupos A, B, J y K, con un límite de detección de 10¹ copias/μL por respuesta, pero su funcionamiento es complejo y el instrumento es costoso. Xiang et al. (28) establecieron un método CPA para la detección del subgrupo J de leucemia aviar con un límite de detección de 10¹ copias/μL, pero su tiempo de respuesta fue largo y la sensibilidad fue solo 10 veces mayor que la del método de PCR. El método RAA-CRISPR / Cas13a-LFD tiene buena repetibilidad y estabilidad, y una alta tasa de coincidencia con el método de electroforesis PCR-Agarosa y el método qPCR para la detección del mismo lote de muestras, que es adecuado para la detección clínica.

En este estudio, se estableció el método RAA-CRISPR/Cas13a-LFD para la detección de campo de ALV, que tiene las ventajas de ser rápido, sensible y conveniente, y proporciona una tecnología confiable para el diagnóstico, prevención y control de AL.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres del repositorio o repositorios y el número de acceso se pueden encontrar en el artículo/material complementario.

Declaración de ética

Los estudios con animales fueron aprobados por la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Agrícola de Hebei, Baoding, China. Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones de los autores

JL: Redacción – revisión y edición, Redacción – borrador original, Metodología, Análisis formal, Curación de datos, Conceptualización. ZiZ: Escritura – revisión y edición, validación. ZoZ: Escritura – revisión y edición, Investigación. XC: Escritura – revisión y edición, Investigación. CW: Redacción – revisión y edición, supervisión. XZ: Redacción – revisión y edición, supervisión. TZ: Redacción – revisión y edición, supervisión.

Financiación

El/los autor/es declara(n) que se recibió apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Hebei (no. 22326608D).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda hacer su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Referencias