Introducción

Los folículos ováricos quísticos (COF) son una causa común de insuficiencia reproductiva en el ganado hembra (1-4). Tradicionalmente, los COF se definían como estructuras foliculares no ovuladoras que miden mayores o iguales a 25 mm que persisten durante al menos 10 días sin la presencia de un cuerpo lúteo funcional (CL) (4, 5). Esta definición se ha modificado para incluir estructuras foliculares con diámetros que van de 17 a 22 mm y que persisten durante 7 a 8 días (3, 4). Los informes anteriores estiman que la incidencia de COF en el ganado lechero varía entre el 6 y el 60 %. Pueden resolverse espontáneamente antes de la primera ovulación posparto y, por lo tanto, pueden pasar desapercibidos (1, 2). Se cree que los folículos ováricos quísticos son el resultado de la disfunción neuroendocrinológica del eje hipotalámico-hipofisario-gonadal (2, 6), a menudo combinada con la desregulación local durante el desarrollo folicular (7). Sin embargo, a pesar de la extensa investigación, el mecanismo de desarrollo del COF no está claro (7-9).

En condiciones de campo, el diagnóstico de COF se basa en anomalías de comportamiento, examen transrectal del tracto genital, incluida la ecografía (EE. UU.) y, ocasionalmente, en perfiles de progesterona en sangre (P4). Se han utilizado diferentes regímenes de tratamiento que involucran la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), gonadotropina coriónica humana (hCG), prostaglandina F2α (PGF2α) y P4 con respuestas ováricas variables y tasas de curación (2,10, 11). La gonadotropina coriónica humana se ha utilizado para tratar con éxito los COF que no responden a la GnRH (2,5). Sin embargo, debido a su alto peso molecular y contenido de carbohidratos, la administración repetida de hCG puede dar lugar al desarrollo de anticuerpos hCG en el ganado (12, 13). Con respecto a este punto, Giordano et al. (13) informaron que los niveles circulantes de anticuerpos hCG que pueden interferir con la ovulación no se alcanzaron hasta 7 a 14 días después de la inyección de hCG (2.000 UI). Estos resultados sugieren que las dosis bajas de hCG administradas más de una vez en un plazo de 7 días pueden ser una alternativa práctica para el tratamiento de los COF en vacas lecheras. Sin embargo, hasta donde sabemos, la administración de una sola dosis de 3.000 a 10.000 UI hCG se utiliza de forma rutinaria para tratar COF en ganado, y ningún estudio de campo ha explorado la administración de dosis bajas repetidas de hCG en vacas con COF, centrándose especialmente en el desarrollo folicular ovárico después de la administración de hCG. Por lo tanto, es importante determinar la importancia terapéutica de la hCG para los COF que no responden a la GnRH. El objetivo de este estudio de campo preliminar fue explorar los efectos de diferentes dosis de hCG (dosis únicas frente a múltiples dosis divididas) en el desarrollo folicular ovárico en vacas lecheras con COF.

Materiales y métodos

Animales y gestión

Para este estudio se utilizaron vacas Holstein lactantes de cinco granjas lecheras comerciales en la prefectura de Yamaguchi, Japón. El estudio se realizó de abril de 2013 a noviembre de 2014. Todos los animales fueron cuidados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Yamaguchi, Yamaguchi, Japón), y se obtuvo el consentimiento informado de todos los productores de leche. Las vacas se alojaban en establos libres y se alimentaban con dieta de raciones mixtas totales ad libitum y agua. La dieta se formuló para cumplir con los requisitos de las vacas lecheras lactantes de alta producción (recomendaciones del NRC). Las puntuaciones de condición corporal de las vacas estaban entre 3,25 y 3,5, y el rendimiento promedio anual de leche de rebaño fue de entre 8.000 y 9.000 kg. A lo largo de los experimentos, las vacas fueron ordeñadas dos veces al día y se controlaron las enfermedades sistémicas o metabólicas simultáneas. Todas las vacas utilizadas en el presente estudio estaban libres de estas enfermedades.

Diagnóstico/detección de vacas con folículos ováricos quísticos, tratamiento y muestreo de sangre

Las vacas fueron seleccionadas durante las visitas rutinarias a la granja en función de las quejas de los agricultores y los registros reproductivos posparto proporcionados por los veterinarios locales. Sobre la base de la selección preliminar de los veterinarios, las vacas posparto con un folículo anulotorio de 25 mm de diámetro por palpación rectal y monitoreo de EE. UU. que persistieron en el ovario durante más de 7 días sin un CL funcional, fueron diagnosticadas con COF de acuerdo con los informes publicados (2-4), por un veterinario. Entre las vacas con COF, algunas habían sido inseminadas artificialmente más de tres veces y no habían quedado embarazadas, y habían recibido tratamiento hormonal adicional (excluyendo hCG) durante el período posparto. En este estudio, las concentraciones plasmáticas de P4 de todas las muestras de sangre recogidas almacenadas se midieron después del tratamiento con un ensayo. Por lo tanto, se desconocía la función de los CL de las vacas en cada grupo de tratamiento en el momento de la primera administración de hCG. Sobre la base de las concentraciones de P4 medidas después de la administración de hCG, se consideró que todas las vacas con una concentración de P4 de más de 1,0 ng/ml al comienzo del estudio tenían un CL funcional (14), y se excluyeron del estudio.

Las vacas diagnosticadas con COF se asignaron al azar a cuatro grupos de tratamiento; hCG-1 (n = 3; edad: 2,3 ± 0,6 años), una dosis única de 4.500 UI el día 1 (primer día de tratamiento); hCG-2 (n = 3; edad: 4,0 ± 2,6 años), 2.250 UI en los días 1 y 3; hCG Todas las inyecciones fueron intramusculares. Comenzó el tratamiento para hCG-1 a 149,0 ± 19,9 días en leche (rango; 126-161 días); para hCG-2 a 177,0 ± 147,2 (rango; 67-357 días); para hCG-3 a 221,0 ± 124,2 (rango; 90-337 días); y hCG-C a 113

Se recogieron muestras de sangre de la vena yugular de cada grupo para el perfil de P4 en suero, en los días 1, 3, 5, 7 y 14. Las muestras de sangre recogidas se colocaron inmediatamente en una nevera y se transportaron al laboratorio. Después de la centrifugación a 500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente, el suero se separó y se congeló a -30 °C hasta el análisis hormonal. El escaneo transrectal de ambos ovarios también se realizó en los días 1, 3, 5, 7 y 14 utilizando un escáner estadounidense de matriz lineal equipado con una sonda rectal de 5 MHz para evaluar la dinámica folicular. En cada punto de muestreo, las estructuras ováricas se evaluaron mediante escaneo de EE. UU. y grabación de vídeo; se midieron tanto el número como el tamaño de los folículos antrales visibles y los CL. Los procedimientos del estudio, incluida la administración de hCG, el muestreo de sangre y el seguimiento de EE. UU., se ilustran en la Figura 1.

FIGURA 1. Protocolo experimental de las administraciones de hCG, muestreo de sangre y examen ultrasonográfico ovárico para cada grupo.

Ensayo P4

Las concentraciones plasmáticas de P4 se determinaron mediante un inmunoensayo enzimático después de la extracción con un éter dietílico, como se describió anteriormente (15). La eficiencia de extracción de P4 fue del 90 %. La dosis efectiva del 50 % del ensayo P4 fue de 0,66 ng/ml, y la concentración mínima detectable de este ensayo fue de 0,05 ng/ml. Los coeficientes medios de variación intra-ensayo e interensayo fueron del 2,9 y el 1,9 %, respectivamente. Se utilizaron datos hormonales para confirmar y apoyar el monitoreo de la CL y el desarrollo folicular en EE. UU.

Análisis de datos clínicos

Después de la administración de hCG, la aparición de ovulación se detectó mediante el monitoreo de EE. UU., y la formación de CL se confirmó a través de concentraciones plasmáticas de P4 superiores a 1 ng/ml en tres muestras consecutivas. El número de folículos se contó y clasificó de la siguiente manera: menos de 4, 5–9, 10–14 y 15-19 mm.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el software informático StatView^® (Abac Concept, Inc., Berkeley, CA, EE. UU.). El área de COF, el número de folículos y las concentraciones de P4 se expresaron como medias ± SEM. Se utilizó un análisis no paramétrico de la varianza (Kruskal-Wallis) para explorar las diferencias entre grupos (tratamiento) en el número folicular y las concentraciones de P4, y las diferencias dentro del grupo (cada día después de la administración de hCG) en las concentraciones de P4. Los valores de probabilidad inferiores a 0,05 (P < 0,05) se consideraron estadísticamente significativos, mientras que se consideró que el valor P inferior a 0,1 (P < 0,1) indica una tendencia hacia la significación.

Resultados

Actividad ovárica después de las administraciones de hCG detectadas por EE. UU.

La tabla 1 proporciona un resumen de la actividad ovárica de los cuatro grupos de tratamiento durante el período experimental de 14 días. Con la excepción de una vaca en el grupo hCG-2, todos los animales con COF mostraron reducciones de tamaño, luteinización u ovulación después de la administración de hCG. Después de la administración de hCG, se observó un nuevo desarrollo de CL en 3, 3, 3 y 1 vaca(s) de 3 vacas cada una en los grupos hCG-1, hCG-2, hCG-3 y hCG-C, respectivamente. El día 14, no se observaron nuevos COF en el grupo hCG-1 o en el grupo hCG-2, pero se identificó uno en una vaca del grupo hCG-3.

TABLA 1. Resumen de las actividades ováricas de cuatro grupos durante los períodos experimentales.

La figura 2 muestra el número medio de folículos clasificados por diámetro. Se observó un aumento significativo en el número de folículos < 4 mm de diámetro (P < 0,05) en el grupo hCG-2 el día 5 en comparación con los otros días. Además, se observó una diferencia significativa en el número de folículos < 4 mm (P < 0,05) entre ambos grupos hCG-2 y hCG-3, en comparación con el grupo hCG-C, en el día 5. Se observó una tendencia (P = 0,08) para que el número de folículos de 5 a 9 mm aumente en los grupos hCG-3, hCG-2 y hCG-1 en comparación con el grupo hCG-C en el día 7. No se observaron diferencias entre los grupos en cuanto al número de folículos de 10-14 o 15-19 mm de diámetro.

FIGURA 2. Número medio de folículos desarrollados, categorizados por diámetro, en cada grupo. *Indica que el número de folículos en el día 5 en el grupo hCG-2 fue significativamente diferente al de otros días dentro del grupo; a,b, significativamente diferente (P < 0,05); c,d, tendencia a una diferencia (P < 0,1).

La figura 3 muestra el cambio en el área de COF después de la administración de hCG en cada grupo, en comparación con el área de COF original. Aunque el tamaño de todos los COF de todos los grupos disminuyó, la única reducción significativa en el área se observó en el grupo hCG-C.

FIGURA 3. Cambio medio (± SEM) en el área de los folículos ováricos quísticos en las vacas de cada grupo. El área del folículo quístico en el día 1 se consideró al 100 %. *Indica una reducción significativa en el área del folículo ovárico quístico en comparación con el día 1.

Concentración de progesterona después de la administración de hCG

La figura 4 muestra los perfiles P4 de sangre de cada grupo después de la administración de hCG. Se observó una tendencia a que la concentración de P4 aumentara (P < 0,1) en los grupos hCG-1 y hCG-2 el día 14 en comparación con el día 1. Los niveles de progesterona en todos los grupos de hCG en el día 14 fueron superiores a 1 ng/ml, lo que sugiere el desarrollo de una CL funcional. La proporción de vacas en los días 7 y 14 con P4 > 1 ng/ml fue del 100% (3/3) y 100% (3/3) en hCG-1; 100% (3/3) y 67% (2/3) en hCG-2; 67% (2/3) y 100% (3/3) en hCG-3; y 33% (1/3) y 33% (1/3) en hCG-C, Además, se observó una tendencia a una diferencia en la concentración de P4 (P = 0,07) entre los grupos hCG-1 y hCG-C el día 5.

FIGURA 4. Concentración sérica de P4 (media ± SEM) de cada grupo de hCG. a,b, se observó una tendencia (P = 0,07) para una diferencia entre los grupos hCG-1 y hCG-C. *Se observó una tendencia a un aumento de las concentraciones de P4 en los grupos hCG-1 (P = 0,054) y hCG-2 (P = 0,051) en el día 14 en comparación con el día 1.

Discusión

En el presente estudio, nos centramos en la eficacia de métodos alternativos de administración de hCG, es decir, dosis divididas simples o múltiples para vacas diagnosticadas con COF refractarios, para evaluar las respuestas ováricas y las concentraciones séricas de P4. Aunque el número de vacas incluidas en el estudio fue pequeño, nuestros resultados sugieren que las dosis bajas repetidas de hCG con el tiempo pueden mejorar el desarrollo folicular ovárico de las vacas con COF.

Se han notificado diferentes respuestas de los COF al tratamiento con hCG, incluyendo luteinización parcial o completa, regresión y ovulación (1, 2). En el presente estudio, se observó una regresión significativa de los COF refractarios en el grupo hCG-3 el día 7 en comparación con los otros grupos, lo que indica que la administración repetida de hCG de dosis bajas puede ser más efectiva para la regresión de los COF. Una dosis de 3.000 UI de hCG dio lugar al desarrollo y selección de nuevos folículos dominantes 4 días después del tratamiento (11). El número de folículos de < 4 mm de diámetro aumentó después de la administración de hCG en los grupos hCG-2 y hCG-3. Esto puede ser el resultado de la dosis baja y la administración sucesiva de hCG. Los folículos pueden haber aumentado de tamaño a 5 a 9 mm de diámetro para el día 5 o el día 7; sin embargo, nuestra observación de que el número de folículos de mayor tamaño (posiblemente folículos dominantes; 5-9 y 10-14 mm de diámetro) disminuyó en el día 3, puede deberse a la ovulación después del aumento de En general, nuestros resultados indican que varios métodos de administración de hCG no afectan significativamente al desarrollo folicular ovárico, pero pueden afectar el tamaño y la categoría de los números foliculares.

Una ventaja de usar hCG en lugar de GnRH para inducir la ovulación es que las acciones de hCG no se ven afectadas por los niveles in vivo de P4. Por el contrario, la respuesta ovulatoria a la GnRH puede variar significativamente, dependiendo del entorno endocrino en el momento de la inyección, porque la magnitud del aumento de LH depende de las concentraciones circulantes de P4 (13). Nuestros resultados sugieren que el método de administración de hCG (dosis y/o patrón) en vacas con COF puede afectar la respuesta ovárica y, por lo tanto, la eficacia terapéutica. Recientemente, se desarrolló un protocolo de tratamiento, basado en la administración secuencial de GnRH, PGF2α y GnRH (protocoloGPG), como estrategia terapéutica para quistes ováricos (16, 17). Nuestros resultados con respecto al desarrollo folicular de vacas con COF sugieren que la administración repetida y de dosis bajas de hCG, en lugar de una sola inyección de GnRH, puede ser un tratamiento alternativo práctico para los COF, especialmente teniendo en cuenta que la administración repetida de dosis bajas de hCG se asoció con el reclutamiento de un número significativamente mayor de folículos

En conclusión, nuestros resultados sugieren que la dosis baja y la administración repetida de hCG pueden ser una terapia alternativa efectiva para las vacas con COF refractarios. El reclutamiento folicular de los ovarios y el desarrollo posterior se vieron afectados por las diferentes dosis de hCG en el estudio. Sin embargo, la respuesta ovulatoria y la formación de CL no fueron diferentes entre los diversos grupos tratados con hCG. Se justifican más investigaciones en condiciones de campo e involucrando a un gran número de vacas y la medición de anticuerpos anti-hCG después de la administración de hCG.

Contribuciones del autor

TeO y TaO concibieron y diseñaron los experimentos. TeO, MiT, CK, MaT y TaO realizaron los experimentos. TeO, MiT, MW, PV, FT y TaO contribuyeron a la preparación del borrador. Todos los autores contribuyeron a revisar el artículo.

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Referencias