1. Antecedentes

La ocratoxina A (OTA) es producida por varias especies de hongos Penicillium y Aspergillus (1). La OTA se encuentra con frecuencia en diversas fuentes de alimentos como café, cerveza, vino, frutas, verduras, huevos, carne, alimentos para animales y granos (2, 3). OTA tiene una amplia distribución y alta toxicidad, lo que lleva a pérdidas financieras sustanciales dentro de las industrias ganadera y avícola. Esta situación plantea desafíos para cumplir con los requisitos globalizados de carne y productos lácteos y compromete la seguridad alimentaria. El selenio (Se), un mineral esencial para la salud animal, ha despertado un interés considerable en los últimos años (4-6). Las formas orgánicas de Se (como la selenometionina, la selenocisteína y la levadura enriquecida con Se), las formas inorgánicas (como el selenito de sodio) y las formas nano se utilizan actualmente como aditivos para piensos avícolas (7). En estudios anteriores, nano-Se ha demostrado una biodisponibilidad superior a sus contrapartes inorgánicas (8, 9). La microbiota intestinal, un componente esencial de la barrera intestinal, desempeña una función crítica en la preservación de la homeostasis intestinal y la protección de la salud del tracto intestinal (10). El nivel de diversidad exhibido por la microbiota intestinal indica la intrincada variedad de especies presentes dentro de ella. Varias variables externas, incluida la ingesta dietética, los medicamentos y las toxinas derivadas de fuentes ambientales, pueden afectar la composición de la microbiota intestinal. La investigación ha demostrado que las micotoxinas, incluidas, entre otras, la fumonisina B1, la zearalenona, la aflatoxina B1 y la ocratoxina A, pueden alterar potencialmente el equilibrio de la microbiota intestinal al reducir la población de bacterias beneficiosas y promover el crecimiento de bacterias patógenas (11-13). La metabolómica, que analiza e identifica metabolitos en células y tejidos, es esencial para el diagnóstico de enfermedades, el desarrollo de fármacos y el análisis toxicológico (14-16). Sin embargo, existe una investigación limitada sobre los mecanismos de acción de micotoxinas como la OTA basada en la metabolómica. Este estudio investigó el impacto de la suplementación con Nano-Se en la dieta sobre la microbiota intestinal en pollos con desafíos OTA utilizando el análisis de ARNr 16S. LC-MS proporciona una cobertura completa de sustancias y se considera la técnica más estable y apropiada para estudiar el metabolismo. El contenido cecal se examinó utilizando una estrategia de investigación metabolómica LC-MS. El estudio examinó metabolitos endógenos entre grupos basados en bioinformática y analizó las vías metabólicas para identificar posibles biomarcadores. Este enfoque nos ayudó a comprender el mecanismo de acción de Nano-Se en pollos expuestos a OTA.

2. Metodología

2.1. Materiales

Los puntos de referencia OTA utilizados se obtuvieron de Pribolab (Immunos, Singapur) y tenían un nivel de pureza superior al 98%. El espécimen de Nano-Se utilizado en este estudio tenía un diámetro que oscilaba entre 30 y 60 nm y una pureza de Se del 99,5%. La fuente de Nano-Se fue la cohorte de Bosar Biology (Guangzhou, China). Los cristales OTA de alta pureza se solubilizaron en etanol absoluto a 1 mg por 10 mL. Se creó una suspensión mezclando la solución resultante con 90 ml de aceite de girasol estéril. En el experimento se utilizaron reactivos de grado analítico.

2.2. Animales

Se adquirió una cohorte de 80 pollos de engorde neonatales de un criadero comercial y se les permitió 3 días para la aclimatación después del transporte a un entorno nuevo. A los pollos se les proporcionó acceso sin restricciones tanto a alimentos como a agua. La formulación y el contenido nutricional de la dieta basal se diseñaron de acuerdo con el NRC Nutrient Requirement (2012), como se detalla en la Tabla 1. La dieta para cada cohorte se preparó simultáneamente y se conservó en recipientes herméticos antes de la alimentación, y el experimento duró 21 días.

2.3. Diseño experimental y tratamiento

Los pollitos se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos iguales, incluyendo el grupo Se (1 mg/kg de Nano-Se en la dieta), el grupo OTA (50 μg/kg OTA por peso corporal), el grupo OTA-Se (50 μg/kg OTA + 1 mg/kg Nano-Se) y un grupo control. Las dosis se recalibraron en alineación con las variaciones de peso en los pollos de engorde (17, 18). Tras la conclusión del experimento, todos los pollos fueron sacrificados a través de la bisección de vasos cervicales. Seis pollos de engorde de cada grupo tenían su contenido cecal congelado utilizando métodos estériles, y su hígado y yeyuno se fijaron en paraformaldehído al 4% (p/v). Estos tejidos se procesaron posteriormente a través de deshidratación, infiltración, incrustación, corte y tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en cumplimiento de los procedimientos estándar de examen histopatológico.

2.4. Secuenciación del ARNr 16S y análisis bioinformáticos

QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen™, Alemania) extrajo ADN bacteriano entérico del contenido cecal almacenado. La región V16-V3 del ADNr 4S se sometió a amplificación por PCR a través de cebadores 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCA) y 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT). Los amplicones se evaluaron a través de electroforesis en gel al 2%. Después de eso, AxyPrep DNA Gel Extraction (Axygen™, Estados Unidos) recuperó amplicones probados de dicho gel. La detección y cuantificación de productos de PCR se realizó utilizando un microfluorómetro QuantiFluor-ST™ (Promega, Madison, WI, Estados Unidos). Posteriormente, las bibliotecas MiSeq fueron preparadas para la pirosecuenciación en MiSeq (Illumina™, Estados Unidos). Las secuencias que exhibieron una similitud de al menos el 97% se agruparon en una sola unidad taxonómica operacional (OTU) después de ser sometidas a limpieza. Los análisis bioinformáticos se realizaron a través de Majorbio^®®®1 (Shanghai, China). Se accedió a la plataforma el 25 de octubre de 2022. El estudio empleó el Análisis Discriminante de Mínimos Cuadrados Parciales (PLS-DA), demostrando análisis de diversidad de β a nivel OUT, utilizando índices UniFrac ponderados y Bray-Curtis. La prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis probó variaciones con significación estadística relacionada con la abundancia dentro de los niveles de filo / género.

2.5. Tratamiento de muestras de metaboloma

Se pesó con precisión una muestra de 50 mg de contenido de cecal y se combinó con perlas de molienda de 6 mm, una solución de extracción de 400 ml que consistía en una proporción de 4:1 de metanol a agua (v:v) y una solución estándar que contenía 0,02 mg de ml.⁻¹ estándar (L-2-clorofenilalanina). La mezcla resultante se colocó en un tubo de centrifugación de 2 ml. Después de 6 minutos de molienda de tejidos (-10 ° C / 50 Hz), se realizó la recolección ultrasónica (30 min / 5 ° C / 40 kHz). Posteriormente, la muestra se sometió a una temperatura de -20 ° C durante 30 min y se sometió a centrifugación durante 15 min a 9.400×4 g a 20 ° C. Se transfirió un volumen de <> μL (sobrenadante) de cada muestra utilizando una pipeta a un vial de muestra que contenía una cánula interna para la evaluación computarizada. Se intercaló una inyección de muestra de control de calidad (QC) después de cada seis muestras. Los especímenes se sometieron a análisis a través de LC-MS, con seis réplicas biológicas por grupo.

2.6. Detección de metabolitos por LC-MS

El análisis LC-MS se realizó utilizando la plataforma UHPLC-Q Exactive (ThermoFisher-Scientific™, China). Los parámetros de cromatografía se establecieron de la siguiente manera: la columna utilizada fue HSS T3 con dimensiones de 100 mm × 2,1 mm de diámetro interior y un tamaño de partícula de 1,8 μm. La fase móvil A consistió en 5% de acetonitrilo y 95% de agua con 0,1% de ácido fórmico, y la fase móvil B contenía 47,5% de alcohol isopropílico, 47,5% de acetonitrilo y 5% de agua con 0,1% de ácido fórmico. El caudal volumétrico fue de 0,40 ml / min, el volumen de inyección fue de 2 μL y la temperatura de la columna fue de 40 ° C. La técnica MS utilizó ionización por electrospray para obtener señales de espectro de masas para muestras. El rango de escaneo masivo se estableció en 70-1,050 m / z, y se emplearon modos de escaneo de iones negativos y positivos. Las condiciones experimentales abarcaron los siguientes parámetros operativos: un voltaje de iones negativos de 2.800 V, un voltaje de iones positivos de 3.500 V, presión de gas de vaina a 40 psi, presión de gas de calefacción auxiliar a 10 psi, temperatura de calentamiento de la fuente de iones a 400 ° C, energía de colisión cíclica de 20-40-60 V, una resolución de espectrometría de masas primaria (MS1) de 70,000, junto con una resolución de espectrometría de masas secundaria (MS2) de 17,500.^®

2.7. Preprocesamiento de datos y búsqueda en bases de datos

El software Progenesis QI procesó datos sin procesar, estandarizando las intensidades de respuesta de la muestra desde los picos de espectro de masas para minimizar los errores derivados de la preparación de la muestra y la inestabilidad del instrumento. Los especímenes con una desviación estándar relativa (DSR) > del 30% fueron excluidos de las evaluaciones. La matriz de datos eventual para una mayor investigación se obtuvo realizando una transformación logarítmica en las variables. Los datos metabolómicos se adquirieron integrando los espectros MS1 y MS2 a través de conjuntos de datos de bases de datos metabólicos disponibles públicamente, a saber, HMDB² y Metlin.³

2.8. Proyecciones ortogonales al análisis discriminante de estructuras latentes (OPLS-DA)

OPLS-DA obtuvo información sobre las variaciones metabólicas tanto dentro como entre los grupos de muestras. Los metabolitos que mostraron diferencias significativas se eligieron según sus puntuaciones de Variable Importante en Proyección (VIP) y los valores p obtenidos de la prueba t de Student. Se asumió que los metabolitos que exhibían una puntuación VIP de ≥1 y p < 0,05 tenían significación estadística. Posteriormente, los metabolitos diferenciales fueron identificados y clasificados a través de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG)⁴ para determinar las vías metabólicas afectadas. Se consideró que las vías KEGG estaban significativamente enriquecidas si tenían p < 0,05.

2.9. Análisis estadísticos

Los resultados experimentales se informaron en forma de valores medios junto con sus correspondientes desviaciones estándar. Los efectos anticoccidiales se analizaron mediante la prueba ANOVA unidireccional. Los métodos estadísticos para las pruebas de suma de rangos T/Wilcoxon/Tukey evaluaron las disparidades entre los cuatro tratamientos. p < 0,05 se consideró que confería significación estadística.

3. Resultados

3.1. Resultados del crecimiento

La Tabla 2 presenta el impacto de la suplementación con OTA y Nano-Se en el rendimiento de crecimiento de los pollos de engorde. No se observaron diferencias estadísticamente significativas (p > 0,10) en el peso corporal inicial (IBW) entre los grupos. Sin embargo, en el día 21, el peso corporal final (FBW) se redujo significativamente en respuesta a los tratamientos con OTA (p < 0,05). Además, se encontró que la ganancia diaria promedio (ADG) en el grupo OTA fue inferior a los otros grupos (p < 0,01). Sin embargo, la ingesta diaria promedio de alimento (ADFI) se mantuvo constante en los cuatro grupos. En cuanto a la relación de conversión alimenticia (FCR), se observó una disminución en FCR con la adición de Nano-Se del día 1 al 21 (p < 0,05).

3.2. Cambios histopatológicos en el intestino y el hígado

Las características morfológicas del yeyuno fueron normales tanto en el grupo control como en el grupo de tratamiento SE, exhibiendo una estructura completa de la membrana mucosa intestinal. Las vellosidades intestinales estaban claras y bien alineadas, sin cambios anormales significativos (Figuras 1A, D). Por el contrario, el yeyuno de los pollos de engorde en el grupo OTA estaba notablemente distendido, con desprendimiento extenso de la mucosa intestinal y daño estructural observable (Figura 1B). Después del pretratamiento con Nano-Se, se mitigó el desprendimiento de la mucosa intestinal en el yeyuno de pollos de engorde, y no se observaron cambios perceptibles en la lámina propia (Figura 1C).

La tinción HE aclaró aún más la condición del tejido hepático. En los pollos de los grupos control y Se, no se observaron signos de inflamación, congestión, sangrado, necrosis o exudación (Figuras 1E, H). En el grupo OTA, el hígado mostró signos de inflamación, sobre todo debido a la infiltración extensa de células inflamatorias desencadenada por OTA, particularmente una alta concentración de linfocitos y eosinófilos (Figura 1F). Se detectaron alteraciones patomorfológicas mínimas en el grupo OTA-Se (Figura 1G). En conjunto, estos hallazgos indican que la suplementación con Nano-Se proporcionó un efecto protector contra la lesión hepática inducida por OTA en pollos.

3.3. Datos de secuencias de ADN

El análisis de secuenciación de alto rendimiento para los contenidos de cecal de pollo se realizó utilizando la plataforma Illumina MiSeq. Después de QC, se obtuvieron 640.107 secuencias válidas, con un promedio de 40.006 secuencias por espécimen. Entre estas secuencias de alta calidad, aproximadamente el 99,95% eran más largas que 400 pb, con la mayoría oscilando entre 401 y 420 pb (Figura 2A).

Sobre la base de un umbral de similitud del 97%, todas las lecturas efectivas se agruparon en OTU. Las curvas de rarefacción para los cuatro grupos alcanzaron una meseta, lo que sugiere que la profundidad de secuenciación empleada en dicha investigación fue suficiente para evaluar la composición de la población microbiana derivada de muestras y representar con precisión las colonias microbianas fecales (Figura 2B). La riqueza y la uniformidad de la composición de la microbiota fueron comparables entre los cuatro grupos mediante el análisis de abundancia de rango dentro del nivel de OTU (Figura 2C). La idoneidad de los esfuerzos de muestreo fue apoyada por curvas de rarefacción y abundancia de rango para cada espécimen.

3.4. Efectos de la ocratoxina A y Nano-Se en la composición microbiana intestinal

La diversidad alfa mide el número de especies y su diversidad dentro de un espécimen en particular. La diversidad alfa se puede evaluar utilizando diferentes índices. Los índices mencionados anteriormente comprenden ACE, Chao1, Simpson y Shannon. Los índices ACE y Chao1 cuantifican la abundancia de especies, que se refiere a las cantidades totales de especies presentes dentro de un espécimen dado. Por otro lado, los índices de Simpson y Shannon evalúan la diversidad de especies, considerando el número de especies y su abundancia relativa dentro del espécimen. El análisis de diversidad alfa indicó que no hubo variaciones estadísticamente significativas dentro del índice de Simpson, el índice de Shannon, el índice Chao1 y el índice ACE en las cuatro cohortes terapéuticas (p > 0,05) (Tabla 3).

La diversidad beta evaluó las variaciones dentro de la complejidad de las especies dentro de los especímenes, como lo demuestra un índice Unifrac ponderado. Con respecto a la diversidad β, PLS-DA reveló que la similitud en la diversidad de especies difería significativamente cuando los pollos recibieron OTA y Nano-Se (Figura 3A). Se observó una clara separación entre los grupos dentro de la flora cecal del pollo, lo que indica que la estructura de la flora cecal del pollo había sido alterada.

Como se ilustra en la Figura 3B, el filo primario de la microbiota intestinal de pollos de engorde fue Firmicutes, seguido de Proteobacteria. La abundancia relativa de Firmicutes dentro de la cohorte OTA fue mayor que la cohorte control y similar al grupo OTA-Se.

Los géneros predominantes dentro del intestino incluyeron Lactobacillus, norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014, unclassified_f__Lachnospiraceae y Ruminococcus_torques_group (Figura 3C). Entre estos géneros, la abundancia relativa de Lachnospiraceae fue mayor dentro del grupo OTA-Se. Por el contrario, la abundancia relativa de Clostridia fue mayor dentro del grupo OTA.

Se realizó una comparación supervisada de muestras mediante LEfSe y análisis discriminante lineal logarítmico (LDA). Los resultados de LEfSe, que se muestran en la Figura 3D, revelaron que, en comparación con el grupo de control, las bacterias dominantes dentro de la cohorte OTA-Se fueron s__Lactobacillus_johnsonii y f__Leuconostocaceae a nivel de filo a género.

3.5. Análisis del metaboloma

Las muestras de control de calidad evaluaron la consistencia/reproducibilidad de los métodos de investigación, con inyecciones arbitrarias realizadas durante la inyección de la muestra. Más del 70% de los valores de RSD para las muestras de control de calidad fueron inferiores al 30%, lo que sugiere que los conjuntos de datos recopilados a través de tales métodos de investigación mostraron estabilidad.

Para explorar los cambios en los metabolitos intestinales inducidos por la suplementación dietética de OTA y Nano-Se, se aplicó un enfoque metabolómico no dirigido para analizar los perfiles de metabolitos del contenido cecal. OPLS-DA se utilizó para discernir distintos patrones metabólicos, como se ilustra en las Figuras 4A, C. Este análisis reveló perfiles metabólicos separados entre los grupos OTA y Control y entre las cohortes OTA-Se y OTA. OPLS-DA permitió filtrar variaciones irrelevantes, mejorando la capacidad de identificar metabolitos diferenciales sustanciales entre los diferentes grupos. La cercanía de los puntos duplicados para los dos grupos de muestra indica una buena repetibilidad de los datos.

La validación del modelo OPLS-DA se llevó a cabo dentro de esta investigación para evitar el sobreajuste. Las separaciones claras entre los grupos OTA (puntos azules) y Control Control (puntos verdes) (R2 = 0.9956, Q2 = −0.0026, Figura 4B) y entre los grupos OTA (puntos azules) y OTA-Se (puntos amarillos) (R2 = 0.9967, Q2 = 0.0661, Figura 4D) fueron demostradas por los modelos OPLS-DA. Cuanto mayores sean los valores de R2 y Q2, mayor será la fiabilidad teórica para este modelo. Los datos adquiridos sugieren que ambos modelos demuestran una estabilidad favorable y no sobreajuste. Se confirma que el material es suficientemente reproducible y apropiado para posteriores validaciones cualitativas y cuantitativas de ensayos, como lo demuestran estos resultados.

3.6. Análisis diferencial de metabolitos

Los metabolitos se seleccionaron diferencialmente utilizando el valor VIP (VIP > 1) del modelo OPLS-DA junto con el valor de p (p < 0,05) de la prueba t de muestra independiente de todos los metabolitos identificados. Los metabolitos diferenciales elegidos sirvieron como variables marcadoras para distinguir entre cohortes. En comparación con la cohorte control, la cohorte OTA exhibió una identificación inicial de 515 metabolitos diferenciales, con 259 dentro del modo positivo y 256 dentro del modo de iones negativos. Entre estos metabolitos, 276 fueron regulados al alza, mientras que 239 fueron regulados a la baja (Figura 5A). Tras la comparación de los grupos OTA y OTA-Se, se detectó un colectivo de 514 metabolitos distintos (277 dentro del modo positivo y 237 dentro del modo de iones negativos) a través de ambos modos de análisis (Figura 5B). Entre los metabolitos reconocidos, 214 mostraron una disminución significativa, mientras que 300 mostraron un aumento.

Los metabolitos diferenciales identificados en este estudio fueron anotados dentro de HMDB para ser clasificados. Los resultados mostraron que los lípidos/moléculas similares a los lípidos constituían el 23,87% de los metabolitos diferencialmente agregados dentro de las cohortes OTA y OTA-Se. Los ácidos/derivados orgánicos fueron la segunda cohorte más abundante con un 23,44%, seguidos de los compuestos organoheterocíclicos con un 21,29%, los benzenoides con un 8,17%, los fenilpropanoides y los policétidos con un 7,96%, los compuestos orgánicos de oxígeno con un 7,31%, los alcaloides y derivados con un 2,37%, los nucleósidos, nucleótidos y análogos con un 2,15%, los compuestos orgánicos de nitrógeno con un 1,29% y los compuestos restantes con un 0,44% (Figura 5C).

Se realizó un análisis adicional de los metabolitos identificados utilizando el análisis KEGG para investigar las posibles vías afectadas por las intervenciones OTA y Nano-Se. Las 10 principales vías metabólicas de KEGG con enriquecimiento significativo para diferentes metabolitos se encontraron utilizando la base de datos KEGG. En comparación con la cohorte de control, las vías con los valores de impacto más altos dentro de la cohorte OTA incluyeron el metabolismo de la riboflavina, la degradación del aminobenzoato, la degradación del limoneno y el pineno, la biosíntesis de arginina y el metabolismo de la alanina, el aspartato y el glutamato. Entre los metabolitos implicados en estas vías, la riboflavina, el benzoato, el ácido oxoglutárico y la L-glutamina disminuyeron notablemente dentro de la cohorte OTA en comparación con el grupo control. Por el contrario, el ácido benzoico, el ácido gálico y la citrulina aumentaron dentro de la cohorte OTA en relación con la cohorte de control (Figura 5D).

Al comparar la cohorte OTA con la cohorte OTA-Se, las distintas vías metabólicas dentro del contenido intestinal incluyeron la degradación del aminobenzoato, el metabolismo de la galactosa, la biosíntesis de isoflavonoides y la biosíntesis de flavonoides. Entre los metabolitos que participan en estas vías metabólicas, el ácido protocatecúico, el ácido 4-hidroxibenzoico, la D-galactosa, la daidzeína, la liquiritigenina y la naringenina fueron altamente elevados dentro de la cohorte OTA-Se en comparación con el grupo OTA. Por el contrario, el ácido galactónico y el mioinositol se redujeron dentro de la cohorte OTA-Se en comparación con la cohorte OTA (Figura 5E).

La correlación entre los diferentes géneros microbianos y los metabolitos cecales modificados se determinó utilizando los valores del coeficiente de correlación de Spearman en un análisis de correlación (Figura 5F). El presente estudio ha revelado asociaciones que tienen una significación estadística considerable (p < 0,05, r > 0,70) a través de bacterias particulares presentes dentro del ciego y metabolitos distintivos en la comparación de OTA vs OTA-Se. Dos metabolitos distintos, Daidzeína y Liquiritigenina, involucrados dentro de la vía de biosíntesis de isoflavonoides, mostraron correlaciones positivas significativas con Firmicutes, Turicibacter y Butyrivibrio. Además, el ácido protocatecúico, presente en las vías de degradación de aminobenzoato y degradación de benzoatos, demostró una correlación positiva con oscillospirales, firmicutes y Butyrivibrio mientras que reveló una correlación negativa con Erysipelotrichaceae. Aunque el metabolismo directo de estos productos metabólicos por la microbiota intestinal sigue estando determinado de manera concluyente, los resultados destacan una estrecha interacción entre las especies microbianas intestinales y los metabolitos, lo que sugiere que la suplementación con Nano-Se puede haber inducido alteraciones notables en la microbiota intestinal, lo que en última instancia conduce a cambios significativos en la abundancia de metabolitos del huésped.

4. Discusión

OTA (C20H18ClNO6; peso molecular: 403.8) es una micotoxina predominante originaria de varias especies de Penicillium y Aspergillus. Su presencia generalizada y la contaminación de cultivos y alimentos plantean importantes amenazas para la salud humana y animal (2). Se, un oligoelemento esencial para los mamíferos, incluidos los humanos, exhibe una fuerte correlación entre sus funciones fisiológicas y la prevalencia de enfermedades (19). Investigaciones anteriores han destacado el papel crucial de Sé en la disminución del daño infligido a los animales por las micotoxinas (20-22). En la investigación actual, los pollos alimentados con alimentos contaminados con OTA mostraron una marcada disminución en FBW, ADG y una elevación notable en los hallazgos de FCR congruentes con estudios previos (23, 24). Además, la literatura existente ha demostrado que incluso una exposición menor a la OTA en animales puede provocar alteraciones patológicas y funcionales en el hígado y los intestinos (25-30). Nuestros hallazgos se alinean con estos estudios anteriores, lo que indica que la suplementación con Nano-Se puede proteger a los pollos contra el daño inducido por OTA. La microbiota intestinal, reconocida como un indicador crítico y sensible de la salud gastrointestinal, está inevitablemente influenciada por contaminantes ambientales, incluidas micotoxinas como la OTA. En los últimos años, un creciente cuerpo de evidencia ha demostrado que la OTA tiene un efecto perjudicial sobre la integridad de la barrera intestinal, induce estrés oxidativo e inflamación, y reduce la abundancia de microorganismos beneficiosos (31-35). La OTA induce alteraciones en la composición de la microbiota intestinal, afectando el filo, el género y los niveles de especies (36). La literatura ha documentado un aumento considerable en el enriquecimiento de Bacteroides en ratones expuestos a OTA (37). La investigación en pollos de engorde y patos ha indicado que la OTA reduce la abundancia/diversidad de la microbiota cecal, lo que provoca daños en la unión estrecha intestinal (38).

Recientemente, la comunidad científica ha mostrado una mayor curiosidad por comprender los efectos moduladores de Se en la microbiota intestinal. Cuando se expusieron a levaduras enriquecidas con selenio, los pollos de engorde sometidos a OTA experimentaron alteraciones en la diversidad de su microbiota cecal (30). Zhang et al., al analizar las variaciones en la distribución de Se en la región de Enshi de Hubei, China, observaron una mayor prevalencia de Bacteroidetes en áreas con concentraciones más altas de Se en comparación con regiones con concentraciones de Se más bajas (39). Sus hallazgos revelaron que la suplementación dietética de Se puede influir en las reacciones inmunológicas del intestino y la funcionalidad de barrera. Esto está relacionado con la alteración de la microbiota intestinal a través de procedimientos de trasplante de microbiota fecal (40). Además, la suplementación dietética de SE mejoró notablemente la diversidad de la microbiota de los ratones (41). La suplementación con levadura y cultivo de levadura enriquecida con selenio contribuyó a la homeostasis intestinal al elevar la abundancia relativa de microbiota asociada a antiinflamatorios, mitigando así el daño causado por la infección por S. enteritidis (42). Los resultados de la investigación indican que la adición de nanopartículas de Se dietéticas (SeNP) puede modular eficazmente la microbiota intestinal y sus procesos metabólicos, reduciendo la gravedad de la toxicidad aguda causada por el dicuat (43). El consumo de SeNP que excede los requisitos nutricionales puede mejorar la composición de la microbiota intestinal, protegiendo así contra las disfunciones intestinales (44). Una concentración intermedia de SeNPs a 0,9 mg / kg demostró la mayor eficacia en la mejora de la salud intestinal mediante la promoción de bacterias beneficiosas, incluyendo Faecalibacterium y Lactobacillus (45).

El presente estudio determinó que las poblaciones de Clostridia aumentaron mientras que la abundancia de Lactobacillus y Lachnospiraceae disminuyó dentro del grupo OTA, pero estos niveles se normalizaron después de la suplementación con Nano-Se. Clostridium, incluyendo especies como Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, y Clostridium tetani, puede generar exotoxinas y están asociadas con numerosas enfermedades (46). La investigación ha revelado una correlación positiva entre Clostridium y la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), una citoquina proinflamatoria (47). Se encontró que el nivel de bacterias Clostridium estaba fuertemente correlacionado con la gravedad de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (48) dentro de la microbiota intestinal de pollos expuestos a OTA, la administración oral de aflatoxina B1 (AFB1) disminuyó la diversidad alfa de la microbiota intestinal en pollos de engorde y aumentó la abundancia de varias bacterias perjudiciales, incluido Clostridium (49). Además, AFB1 aumentó significativamente Bacteroidales de Bacteroidetes y Clostridiales de Firmicutes en ratas, mientras que Lactococcus sp., Streptococcus sp. y Lactobacillales de Firmicutes disminuyeron (50). Otro estudio encontró que el tratamiento con deoxinivalenol (DON) aumentó la abundancia de clostridiales dentro de la microbiota intestinal (51, 52). En otros estudios, la cohorte OTA tuvo niveles significativamente más altos de Aerococcus, Romboutsia y Clostridium sensu stricto 1. Sin embargo, el kéfir tibetano redujo la abundancia de estas tres bacterias (53). Estos hallazgos implican que la micotoxina altera la composición de la microbiota intestinal y favorece el crecimiento de bacterias dañinas, produciendo efectos tóxicos.

Además, la abundancia de Lactobacillus aumentó considerablemente dentro de la cohorte OTA-Se en comparación con otros grupos. Está bien establecido que Lactobacillus tiene partes fundamentales para mantenerse saludable junto con la prevención y el tratamiento de enfermedades (54, 55). Con numerosos efectos beneficiosos, Lactobacillus produce lactato, que puede elevar la producción de butirato en las heces (56). Lactobacillus johnsonii ha exhibido propiedades antiobesidad al inhibir la inflamación intestinal y mantener la integridad de la barrera mucosa (57). La cohorte de alimentación dietética de alta energía exhibió una mayor abundancia de especies de Lactobacillaceae, específicamente Lactobacillus reuteri y Lactobacillus johnsonii, dentro del intestino superior (duodeno y ciego). Esta colonización condujo a efectos protectores sobre el revestimiento de la mucosa y redujo la inflamación (58). La investigación sobre la influencia de la OTA en la microbiota intestinal reveló niveles disminuidos de microorganismos ventajosos como bifidobacterias y Lactobacillus. Esta disminución indica que la OTA alteró el equilibrio de la microbiota, lo que podría resultar en una inmunidad comprometida (59). Los ratones administrados con OTA a través de medios intragástricos mostraron una reducción dentro de la prevalencia proporcional de Bifidobacterium spp. y Lactobacillus spp. (60). Además, Zearalenone provocó un aumento en Desulfovibrio y una disminución en la abundancia de Lactobacillus dentro del tejido del colon de ratones (61). La combinación de Bacillus cereus BC7 y la cepa de lactobacilos tuvo un impacto positivo en las respuestas inflamatorias intestinales y las alteraciones de la microbiota inducidas por la zearalenona (62, 63). Los resultados indicaron el aumento de la resistencia de Lactobacillus a OTA y su papel potencial dentro del proceso de desintoxicación de OTA.

La familia bacteriana, Lachnospiraceae, puede convertir el lactato y el acetato en butirato. Esta conversión se puede lograr utilizando diferentes vías enzimáticas, como las vías de la butiril-CoA o acetato CoA transferasa o la vía de la butirato quinasa (64) además de sus capacidades de producción de butirato, se sabe que Lachnospiraceae participa en la biosíntesis de vitamina B12 y exhibe el potencial de inhibir la colonización de Clostridium difficile dentro del tracto gastrointestinal (65). Se ha documentado que la familia Lachnospiraceae tiene funciones cruciales en la adquisición de glicanos dietéticos, la síntesis de metabolitos ventajosos, la mejora de la inmunidad y la facilitación del desarrollo neurológico en animales (66). Los estudios han demostrado que la administración de DON a cerdos a una dosis de 2,89 mg/kg dio lugar a diversas alteraciones dentro de la microbiota cecal. Esto marcó el comienzo de una disminución importante dentro de los niveles de f_Lachnospiraceae no clasificados, que se encontró que tenía una correlación positiva con la ingesta diaria promedio de alimento (67). La administración de OTA a ratones, seguida de la suplementación de kéfir tibetano, resultó en un aumento significativo en la abundancia de poblaciones bacterianas que desarrollan ácidos grasos de cadena corta (AGCC), como Lachnospiraceae, Ruminococcus y Blautia. Los AGCC se sintetizan a través de la microbiota intestinal mediante fermentación anaeróbica. Estos compuestos mejoran la integridad de la barrera intestinal y suprimen las reacciones inflamatorias (68). Dados los efectos positivos de Se en la composición de la microbiota intestinal de los pollos, los resultados actuales sugieren que Se podría mejorar la salud intestinal y servir como un aditivo candidato para promover la salud intestinal en pollos expuestos a OTA. Sin embargo, se requiere más investigación para dilucidar el mecanismo a través del cual Se promueve el crecimiento de microorganismos intestinales.

La metabolómica representa un nuevo enfoque analítico para detectar cambios en pequeños metabolitos endógenos. Los factores externos o las interrupciones internas pueden influir en estas alteraciones, y la metabolómica se puede emplear para diagnosticar y predecir los mecanismos subyacentes de tales cambios (69, 70). Múltiples investigaciones han documentado el impacto del consumo de Se en los procesos metabólicos (43, 71, 72). Se identificaron 515 metabolitos distintos dentro del ciego de pollos de engorde a través del análisis metabolómico después de un desafío OTA. El análisis KEGG reveló que estos metabolitos están enriquecidos en el metabolismo de la riboflavina, la degradación de aminobenzoatos, la degradación del limoneno y el pineno, la biosíntesis de arginina y el metabolismo de la alanina, el aspartato y el glutamato.

El metabolismo de la riboflavina está estrechamente relacionado con el metabolismo energético de las mitocondrias. La riboflavina es un precursor de dos coenzimas, flavina adenina dinucleótido y flavina mononucleótido. Estas coenzimas son fundamentales en varias reacciones redox biológicas, incluyendo la cadena de transporte de electrones, la oxidación de ácidos grasos, la degradación de aminoácidos y el ciclo del ácido tricarboxílico (73-76). Numerosos estudios han demostrado la capacidad de la riboflavina para preservar la integridad estructural del tracto intestinal y promover un rendimiento gastrointestinal óptimo en varias especies animales (77). La riboflavina puede regular varias vías que están involucradas en el mantenimiento de la función gastrointestinal. Se ha encontrado que la riboflavina aumenta la absorción de hierro y desempeña un papel dentro del sistema antioxidante. Las investigaciones in vitro e in vivo demostraron que la deficiencia de riboflavina puede provocar estrés oxidativo en los intestinos (78). Además, los estudios han demostrado que el nivel de riboflavina en un organismo puede afectar la composición de su microbioma intestinal, y una deficiencia de riboflavina puede conducir a un desequilibrio dentro de la microflora intestinal (79-84). Por lo tanto, las concentraciones disminuidas de riboflavina indican que OTA podría inducir daño a los intestinos al alterar el metabolismo de la riboflavina.

Las propiedades antiinflamatorias del limoneno y el pineno han sido ampliamente documentadas en la literatura científica. El limoneno, un hidrocarburo terpénico monocíclico natural en los cítricos, exhibe características antiinflamatorias al unirse selectivamente a los receptores A2A y reducir la inflamación (85). α-pineno, un hidrocarburo monoterpénico bicíclico, está comúnmente presente en los aceites esenciales de árboles coníferos y es un componente importante de compuestos orgánicos volátiles derivados de diversas especies de árboles. Este compuesto exhibe una variedad de actividades biológicas, incluidas propiedades antiinflamatorias (86). Los estudios han demostrado que el α-pineno exhibe propiedades antiinflamatorias y tiene potencial como una intervención terapéutica alternativa para la inflamación (87). Con base en las propiedades observadas, es una hipótesis razonable que el aumento de la actividad de las vías de degradación de limoneno y pineno dentro de la cohorte OTA podría reducir potencialmente sus concentraciones, mitigando así la reacción inflamatoria inducida por OTA. Sin embargo, se requiere una investigación adicional para comprender los mecanismos fundamentales.

La L-arginina es parte integral de numerosos procesos, incluyendo el ciclo de la ornitina, la síntesis de proteínas, la generación de óxido nítrico, el manejo del estrés oxidativo y la regulación de la respuesta inmune. Las alteraciones metabolómicas en las células expuestas a ZEA revelaron un enriquecimiento significativo de metabolitos diferenciales relacionados con la biosíntesis de arginina. Investigaciones posteriores demostraron que la suplementación con L-arginina mejoró considerablemente la viabilidad celular y disminuyó los niveles de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células expuestas a la zearalenona (88). Además, la OTA redujo notablemente los niveles de metabolitos diferenciales, como la L-glutamina, asociados con la biosíntesis de arginina en comparación con el grupo control. La L-glutamina, un aminoácido no esencial, es una fuente de energía crítica y un eliminador activo de radicales libres para las células de enterocitos y linfocitos. El intestino puede utilizar aproximadamente el 30% del total de L-glutamina, enfatizando su importancia como nutriente clave para la salud intestinal (89). Se ha demostrado que la L-glutamina estimula la proliferación y diferenciación celular, desempeñando un papel crucial en el apoyo al crecimiento y desarrollo del tracto gastrointestinal (90). Se ha confirmado que la suplementación con L-glutamina preserva la integridad del tejido intestinal y refuerza la barrera mucosa del intestino delgado (91). Tanto los estudios clínicos como los en animales sugieren que la L-glutamina ofrece protección contra el estrés, la invasión de organismos patógenos, la infección y los desafíos inmunológicos in vitro e in vivo (92, 93).

Sobre la base de estos hallazgos, se puede especular que la regulación a la baja de las vías relacionadas con la arginasa da como resultado una disminución del metabolismo de la arginina dentro del modelo examinado. Los resultados indican que la OTA afecta significativamente las vías metabólicas relevantes a través de sus efectos sobre los metabolitos, lo que en última instancia conduce a consecuencias perjudiciales sobre el metabolismo de los nutrientes y la morfología intestinal.

El análisis KEGG que comparó los grupos OTA y OTA-Se reveló que Nano-Se podría influir en la degradación de aminobenzoato y benzoato al elevar los niveles de ácido 4-hidroxibenzoico y ácido protocatecúico. Esta vía de degradación del aminobenzoato puede promover el metabolismo del triptófano y la degradación del benzoato (94). El ácido protocatecúico, un metabolito primario de polifenoles complejos, exhibe numerosas actividades biológicas, que abarcan propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antibacterianas y antiapoptóticas (95-97). Investigaciones anteriores han reportado el potencial del ácido protocatecúico para atenuar el daño intestinal (98). Un estudio demostró que la inclusión de ácido protocatecúico en la dieta de pollos de engorde de plumas amarillas mejoró significativamente su rendimiento de crecimiento, capacidad antioxidante, función inmune intestinal y estructura de la microbiota intestinal (99). La investigación que utilizó lechones desafiados con LPS reveló que el ácido protocatecúico mitigó el estrés oxidativo, la inflamación, el deterioro de la barrera intestinal y la alteración de la flora intestinal (100). Además, el ácido protocatecúico se muestra prometedor como agente desintoxicante contra la fumonisina B1 y AFB1 (101, 102).

Además, se observó una regulación positiva de Daidzeína, Liquiritigenina y Naringenina dentro del grupo OTA-Se, mejorando la biosíntesis de isoflavonoides y la biosíntesis de flavonoides. Los flavonoides son reconocidos por sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias (103). Ciertos flavonoides, como la naringina y la luteolina, han sido identificados para aliviar la inflamación intestinal (104, 105). Se ha informado que los flavonoides derivados de plantas pueden modular la composición de la flora intestinal y mantener la salud intestinal y del organismo (106). La daidzeína, reconocida como un compuesto similar al estrógeno alternativo seguro y natural, se ha investigado cada vez más en la investigación científica. Los estudios realizados en la ciencia aviar han revelado que la daidzeína exhibe potencial como suplemento dietético para aumentar el desarrollo de órganos reproductivos, la calidad de la cáscara de huevo y el rendimiento de la puesta en gallinas ponedoras durante las etapas finales del ciclo de puesta (107, 108). La mezcla de Daidzeína y CH mejoró significativamente la actividad de SOD y GSH-px en plasma (109). Slackia sp., D-G6, una bacteria capaz de desintoxicar el deoxinivalenol, fue descubierta dentro del tracto intestinal de los pollos. Además de la desintoxicación de deoxinivalenol, la enzima D-G6 también cataliza la conversión de daidzeína a equol. Este compuesto exhibe potentes efectos estrogénicos y mitiga eficazmente el riesgo de enfermedades dependientes de estrógenos y relacionadas con la edad (110). El flavonoide liquiritigenina exhibe propiedades farmacológicas antiapoptóticas, antiinflamatorias, antioxidantes y antifibróticas (111). La naringenina, un flavonoide natural, exhibe características antioxidantes, antiproliferativas, antiinflamatorias y antimutagénicas (112). Estudios previos han demostrado que la naringenina proporciona protección celular contra el daño oxidativo inducido por el arsénico (113).

El tracto gastrointestinal sirve como la ubicación principal de la exposición a la OTA y es fundamental para la toxicidad inducida por OTA. La principal manifestación de la toxicidad entérica de la OTA es la inducción del estrés oxidativo y la respuesta inflamatoria, y el impacto de la intoxicación por OTA en la expresión génica de los marcadores de la vía de señalización relacionados con la inflamación y las citoquinas inflamatorias fue más pronunciado en el intestino en comparación con el riñón de los lechones (114). La investigación ha demostrado que la OTA causa daño oxidativo al tracto intestinal de los pollos de engorde, lo que lleva a la elevación de citoquinas proinflamatorias y la reducción de citoquinas antiinflamatorias dentro de los tejidos cecales de estas aves (40, 115). Los estudios realizados in vitro e in vivo han demostrado que la exposición a OTA conduce a una sobreproducción de radicales libres, lo que altera el equilibrio entre los sistemas antioxidante y oxidante y perjudica la función y la estructura de las membranas celulares (11). Los hallazgos indican que la exposición subcrónica a una dosis baja de OTA durante 30 días afecta significativamente la respuesta inmune y los mecanismos de autodefensa antioxidante dentro del intestino y el riñón. Además, ha habido informes que relacionan la alteración de la microbiota intestinal con el daño intestinal, la inflamación y la integridad de la barrera comprometida (116). Como resultado, la elevación de estos metabolitos antiinflamatorios y antioxidantes (ácido protocatecúico, daidzeína, liquiritigenina y naringenina) debido a la intervención de Se puede reforzar las capacidades antiinflamatorias y antioxidantes del tejido huésped. La suplementación en pollos expuestos a OTA puede proteger el intestino mediante la modulación de metabolitos. Los estudios futuros deberían verificar aún más estos hallazgos y profundizar en el mecanismo subyacente de Se para mejorar la salud intestinal de manera más integral utilizando varios modelos experimentales. Además, la relación entre la microbiota intestinal y el microbioma intestinal justifica una mayor exploración.

5. Conclusión

En resumen, esta investigación investigó la influencia protectora de Nano-Se en pollos alimentados con OTA. Los resultados del análisis de la secuenciación del ARNr 16S y la metabolómica no dirigida indicaron que Nano-Se podría modular la comunidad de la microbiota intestinal y los metabolitos. La suplementación de Nano-Se tiene el potencial de mitigar las alteraciones en la microbiota intestinal causadas por la exposición a OTA a través de la promoción de poblaciones microbianas favorables y la supresión de bacterias patógenas. Además, el tratamiento con Nano-Se también influyó en el contenido de metabolitos cecales. Este trabajo ofrece un enfoque novedoso para investigar el papel protector de Nano-Se dentro de la enterotoxicidad inducida por OTA en pollos. Hasta donde sabemos, esta es la primera investigación que explora el impacto tóxico de la OTA en las aves de corral, especialmente en lo que respecta a la microbiota intestinal y las respuestas metabólicas intestinales. Nuestros resultados contribuyen a una comprensión más profunda de cómo la microbiota intestinal está involucrada en las interrupciones de la barrera intestinal inducidas por OTA y sugieren posibles medidas preventivas innovadoras contra tales disfunciones. En particular, nuestra investigación se limitó a los efectos de una sola micotoxina en los pollos, a pesar de que innumerables micotoxinas son frecuentes en la ganadería. Por lo tanto, se justifican estudios más completos para dilucidar los impactos de diversas micotoxinas en la microbiota intestinal y las capacidades contrarias de Nano-Se.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres del repositorio / repositorios y los números de acceso se pueden encontrar en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA934281.

Declaración ética

El estudio en animales fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yichun, Yichun, China. El estudio se realizó de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales.

Contribuciones del autor

MF y WH fueron responsables de la concepción y el diseño del estudio. MF y BL revisaron el manuscrito. MF, WH y BL participaron en la redacción del manuscrito. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión presentada.

Financiación

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Ciencia y Tecnología del Departamento Provincial de Educación de Jiangxi (GJJ211632) y el Fondo de Investigación Científica Inicial de la Universidad de Yichun (3360119046).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Notas

Referencias