1 Introducción

Las citocinas son proteínas clave de señalización celular en diversas vías inmunitarias y homeostáticas y han contribuido a la comprensión de la fisiopatología de las enfermedades inmunitarias tanto en medicina humana como veterinaria (1, 2). En la epidermis, los queratinocitos producen un vasto repertorio de citoquinas, incluidas interleucinas, factores de crecimiento, factores estimulantes de colonias y quimiocinas, en respuesta a estímulos externos como alérgenos, infecciones bacterianas o sustancias químicas (3). La expresión de citoquinas se ha investigado en los trastornos inflamatorios de la piel para obtener información sobre los procesos fisiológicos y patológicos de la enfermedad (3). Estudios previos sobre el análisis de citoquinas en trastornos inflamatorios de la piel han utilizado citocinas séricas o muestras de piel recogidas por biopsia (3, 4). Sin embargo, el suero solo refleja los cambios en la expresión de citoquinas en todo el cuerpo y no refleja la expresión de citocinas en la piel misma. Además, debido a que la biopsia de piel es un método invasivo, existen limitaciones en su uso para recopilar datos de muchos pacientes. Por lo tanto, la investigación sobre métodos no invasivos para analizar la expresión de citoquinas en la piel se ha vuelto de interés recientemente. Estos métodos emplean la recolección de muestras del cerumen, la superficie ocular y el estrato córneo mediante la extracción de cinta adhesiva (3, 5-7). Estos métodos no invasivos permiten tomar muestras de muchos pacientes y analizar la expresión de citoquinas en la piel.

Entre estos métodos no invasivos, el cerumen es una sustancia biológica compuesta por lípidos, proteínas, aminoácidos e hidratos de carbono producidos por queratinocitos y ceruminosos y refleja el estado fisiopatológico del conducto auditivo (5, 8). Además, cuando se produce inflamación en el canal auditivo, el cerumen contiene moléculas de defensa antimicrobianas, como lisozima e inmunoglobulinas, así como proteínas adicionales con funciones antimicrobianas (8). Un estudio previo que investigó la expresión de miRNA en perros con otitis externa (OE) demostró cambios en el perfil de miRNA entre perros sanos y afectados por otitis, y la bioinformática mostró que los miRNA alterados en el cerumen pueden estar involucrados en la modulación de la respuesta inmune del huésped (5). Además, un estudio previo en el que se utilizaron análisis multiplex de citoquinas en los canales auditivos de perros con OE causada por dermatitis atópica mostró un aumento de los niveles de interleucina (IL)-8 e IL10 (6). Sin embargo, el estudio anterior seleccionó solo OE no infectados para evitar la producción de citoquinas proinflamatorias relacionadas con la contaminación/proliferación de microorganismos. Malassezia y Staphylococcus spp. Estimula la producción de citoquinas por los queratinocitos epidérmicos (9, 10). Por lo tanto, la evaluación de la expresión de citoquinas en pacientes con OE infectados con estos microorganismos proporciona más información sobre el análisis de citocinas utilizando el cerumen en infecciones primarias y secundarias por OE.

El objetivo de este estudio fue determinar las concentraciones de citoquinas que pueden ser detectadas mediante técnicas no invasivas para la recolección de cerumen en la superficie de la piel. Para ello, seleccionamos células OE infectadas que indujeron la secreción de citoquinas proinflamatorias en líneas celulares de queratinocitos tras la exposición a agentes microbianos. La OE infectada se dividió a su vez por la OE ceruminosa de Malassezia y la OE bacteriana supurativa y se analizó la concentración de citocinas derivadas de queratinocitos, incluyendo IL-8/ligando quimiocina (CXCL)8, IL-10, IL-6, factor de necrosis tumoral (TNF)-α e IL-1ß. Además, para investigar si el aumento de la expresión de citoquinas en OE infectados refleja el estado inflamatorio del canal auditivo, se analizaron las concentraciones de citocinas en relación con el número de agentes infecciosos (levaduras Malassezia y bacterias en forma de cocos/bastoncillos) y células inflamatorias.

2 Materiales y métodos

2.1 Perros

En este estudio se inscribieron perros de los clientes, independientemente de su raza o sexo. Antes de comenzar el estudio, se obtuvo el consentimiento informado por escrito de ambos propietarios y la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional de Jeonbuk (NON2022-101). Los perros se dividieron en tres grupos, a saber, perros con Malassezia ceruminosa OE (n = 25), OE bacteriano supurativo (n = 15) y controles (n = 24). Los perros con el grupo Ceruminoso Malassezia OE presentaron eritema y secreción ceruminosa en el conducto auditivo. En la citología de los hisopos del canal auditivo, se observaron principalmente levaduras Malassezia (más de cinco organismos/yacimiento petrolífero de inmersión) y queratina (Figura 1A). El grupo OE bacteriano supurativo incluyó perros que mostraron erosión a lesiones ulcerativas y secreción purulenta en el conducto auditivo. En la citología de los hisopos del canal auditivo, se observaron principalmente células inflamatorias, como neutrófilos degenerativos, macrófagos y bacterias, incluidos bastones y cocos (más de 10 organismos/yacimiento petrolífero de inmersión), mientras que los organismos Malassezia rara vez se observaron (Figura 1B). Se excluyeron las infecciones mixtas con levaduras y bacterias Malassezia. En el grupo de control se incluyeron perros sanos sin antecedentes de OE. Se excluyeron los perros sometidos a tratamiento con terapias tópicas o sistémicas antibacterianas, antifúngicas o antiinflamatorias en los 30 días anteriores al estudio.

Figura 1. Imágenes representativas del examen citológico en un perro con Malassezia ceruminosa OE y un perro con bacterias supurativas OE La citología del perro con Malassezia ceruminosa OE reveló que se observaron principalmente numerosas levaduras Malassezia y queratina (A). Un perro con OE bacteriano supurativo mostró un gran número de bacterias en forma de coco/bastoncillos y células inflamatorias, como neutrófilos degenerativos y macrófagos. Rara vez se observó Malassezia (B).

2.2 Evaluación clínica y citológica

Los oídos se examinaron con un videootoscopio y se utilizó una puntuación de 0-3 en el índice de otitis (OTIS)3 para evaluar la gravedad de la otitis, como se informó anteriormente (11). El eritema, la hiperplasia, las erosiones/ulceraciones y los exudados de los conductos auditivos vertical y horizontal se evaluaron en una escala de 0 a 3 para obtener una puntuación total de 0 a 12. La citología se realizó mediante la recolección del cerumen con un hisopo de algodón seco no estéril estándar de la unión de los canales auditivos vertical y horizontal. Los portaobjetos se secaron y se tiñeron con tinción Diff Quick. Las puntuaciones de citología de 0 a 4 se asignaron en función de la presencia de Malassezia, bacterias en forma de cocos/bastoncillos y células inflamatorias como neutrófilos y macrófagos, utilizando métodos modificados de los informados anteriormente (12). En consecuencia, para las puntuaciones de Malassezia en perros con Malassezia OE ceruminosa, se asignó una puntuación de 0 cuando no se observaron levaduras ovaladas de Malassezia: 1 para 1-5, 2 para 5-10, 3 para 10-20 y 4 para >20 bajo aceite de inmersión. Para las puntuaciones bacterianas en bacterias supurativas OE, se dio una puntuación de 0 cuando no se observaron cocos ni bacterias en forma de bastoncillos, 1 para 1-10, 2 para 10-20, 3 para 20-40 y 4 para >40 en un campo petrolífero de inmersión. Además, para la puntuación de células inflamatorias en la OE de bacterias supurativas, se asignó una puntuación de 0 donde no se observaron células inflamatorias: 1 para 1-5, 2 para 5-10, 3 para 10-20 y 4 para >20 dentro del campo petrolero de inmersión. Además, para identificar los agentes bacterianos, se realizaron cultivos bacterianos en ocho de 15 perros con OE bacteriano supurativo. Las muestras de hisopos de oído se cultivaron en agar sangre y las colonias se identificaron mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF) (VITEK MS v.2; bioMérieux, Inc., Durham, NC, EE. UU.).

2.3 Análisis de la expresión de quimiocinas y citoquinas en el cerumen del conducto auditivo

El cerumen se obtuvo mediante la inserción de hisopos secos estériles en los canales auditivos vertical y horizontal. Las muestras de hisopos de oído se trataron con Tween 20 al 0,05% en solución salina tamponada con fosfato durante 30 min con sonicación. A continuación, los extractos se centrifugaron durante 5 min a 2100 × g para eliminar los sólidos cutáneos, y se recogieron alícuotas de los extractos. Las alícuotas se colocaron en tubos Eppendorf secos y se congelaron a -20 °C hasta el análisis. Las concentraciones totales de proteínas solubles se analizaron utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) con albúmina sérica bovina como patrón de referencia. Los inmunoensayos para detectar IL-8/CXCL8 (DY1608, R&D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.), IL-10 (DY735, R&D Systems), IL-6 (DY1609, R&D Systems), TNF-α (DY1507, R&D Systems) e IL-1ß (DY3747, R&D Systems) en el cerumen se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones caninas de IL-8/CXCL8, IL-10, IL-6, TNF-α e IL-1ß se calcularon como pg/mg de proteína soluble total.

2.4 Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el programa estadístico SPSS (versión 29.0. Armonk, Nueva York, IBM Corp.). Las concentraciones de citocinas en los tres grupos se analizaron estadísticamente mediante análisis de varianza de un factor (ANOVA), seguido de la prueba post-hoc de Tukey. Además, se utilizó la prueba de correlación de Pearson para analizar la correlación entre las concentraciones de citocinas y las puntuaciones de citología. Los coeficientes de correlación (r) de <−0,4 y > 0,4 indican correlaciones negativas y positivas significativas, respectivamente. La significación estadística se fijó en p < 0,05.

3 Resultados

3.1 Manifestaciones clínicas de los grupos OE y de los perros control

En la Tabla 1 se resumen la edad, el sexo, la raza y las puntuaciones de OTIS3 y citología de los participantes de los perros con OE de Malassezia y de los perros con OE bacteriana supurativa. En perros con Malassezia ceruminosa OE, las puntuaciones medias de OTIS3 fueron de 7,60 ± 1,53, 2,04 ± 0,54, 2,28 ± 0,46, 0,92 ± 0,57 y 2,36 ± 0,46 para las puntuaciones totales, eritema, hiperplasia, erosión/ulceración y exudado, respectivamente. Además, las puntuaciones medias de OTIS3 en perros con OE bacteriana supurativa fueron de 9,27 ± 1,44, 2,47 ± 0,52, 1,80 ± 0,86, 2,47 ± 0,52 y 2,71 ± 0,47 para las puntuaciones totales, eritema, hiperplasia, erosión/ulceración y exudado, respectivamente. La puntuación media de la citología de Malassezia en perros con OE ceruminosa de Malassezia fue de 3,29 ± 0,60 y la puntuación de células inflamatorias y bacteriana en perros con OE bacteriana supurativa fue de 2,84 ± 1,32 y 3,36 ± 1,05, respectivamente. Además, la citología de la OE bacteriana supurativa reveló que los 15 perros con OE bacteriana supurativa mostraban infecciones citológicas mixtas con bastones y cocos. Además, realizamos un cultivo bacteriano en ocho de 15 perros con OE bacteriano supurativo, que reveló una infección mixta de bacilos gramnegativos y cocos grampositivos en los ocho perros. Los detalles de las bacterias aisladas están presentes en la Tabla Suplementaria S1.

Tabla 1. Señales, puntuaciones OTIS3 y puntuaciones de citología en perros inscritos.

3.2 Expresión de citoquinas en cerumen de grupos OE y perros control

Para analizar la expresión de citoquinas y quimiocinas en el cerumen de perros con OE, se investigaron las concentraciones de citocitos derivados de queratinocitos de IL-8/CXCL8, IL-10, IL-6, TNF-α e IL-1ß utilizando kits de ELISA disponibles comercialmente y se calcularon como proteína soluble pg/mg. En ambos grupos de Malassezia ceruminosa OE (p < 0,01) y OE bacteriana supurativa (p < 0,01), las concentraciones de IL-8/CXCL8 fueron significativamente más altas que las de los perros control (Figura 2A). Además, las concentraciones de IL-8/CXCL8 en sujetos con OE bacteriano supurativo fueron significativamente más altas que las de sujetos con OE de Malassezia ceruminosa (p < 0,01, Figura 2A). Además, se detectó un aumento de la expresión de IL-1ß en perros con OE bacteriana supurativa, en comparación con aquellos con OE de Malassezia y perros control (p < 0,01, Figura 2B). Las concentraciones de IL-6 fueron significativamente mayores en los perros con OE bacteriano supurativo que en los perros con OE de Malassezia y control (p < 0,01, Figura 2C). Por el contrario, en los perros Malassezia OE y control, la IL6 apenas se detectó utilizando el inmunoensayo utilizado en este estudio (Figura 2C). Además, la expresión de IL-10 y TNF-α fue indetectable en todos los sujetos que utilizaron el kit de inmunoensayo disponible comercialmente utilizado en este estudio.

Figura 2. Las concentraciones de citoquinas en el cerumen de los perros control, los perros con Malassezia ceruminosa OE y los perros con bacterias supurativas OE Las concentraciones de IL-8/CXCL8 fueron significativamente mayores en la CERUMINOSA Malassezia OE y en la OE bacteriana supurativa que en los perros control, siendo los niveles más altos en la OE bacteriana supurativa (A). Además, se detectó un aumento de las concentraciones de IL-1ß en perros con OE bacteriano supurativo, comparando las de Malassezia OE y los perros control (B). Las concentraciones de IL-6 fueron significativamente mayores en los perros con OE bacteriano supurativo que en los perros con Malassezia OE y control (C) (NS, sin diferencia significativa; **p < 0,01).

3.3 Correlación de las concentraciones de citocinas con las puntuaciones de citología

Se investigó la correlación de la puntuación de Malassezia con las concentraciones de IL-8/CXCL8 en perros con OE ceruminoso de Malassezia, y la correlación de las puntuaciones de células inflamatorias y bacterianas con la concentración de IL-8/CXCL8, IL-6 e IL-1ß en perros con OE bacteriana supurativa. En perros con Malassezia ceruminosa OE, las concentraciones de IL-8/CXCL8 mostraron una correlación positiva con la puntuación de Malassezia (Figura 3A, r = 0,630, p < 0,01). En perros con OE bacteriana supurativa, la concentración de IL-8/CXCL8 mostró una correlación positiva con la puntuación bacteriana (Figura 3B, r = 0,601, p = 0,018), mientras que no se observó una correlación significativa con la puntuación de neutrófilos (datos no mostrados). Además, las concentraciones de IL-6 e IL-1ß mostraron una correlación positiva con las puntuaciones de células inflamatorias (Figuras 3C, D, IL6; r = 0,520, p = 0,047, IL-1ß; r = 0,680, p < 0,01). Sin embargo, no se observaron correlaciones significativas entre las puntuaciones bacterianas y las concentraciones de IL-6 e IL-1ß (datos no mostrados).

Figura 3. Correlaciones de las concentraciones de citoquinas con la puntuación de Malassezia, la puntuación de bacterias y la puntuación inflamatoria. Aumento de las concentraciones de proteínas de fase aguda en perros con piometra La concentración de IL-8/CXCL8 en Malassezia CERUMINOSA OE se correlacionó positivamente con las puntuaciones de Malassezia ((A), r = 0,630, p < 0,01). En el OE bacteriano supurativo, la concentración de IL-8/CXCL8 se correlacionó positivamente con las puntuaciones bacterianas ((B), r = 0,601, p = 0,018). Las concentraciones de IL-6 (C) e IL-1ß (D) mostraron una correlación positiva con las puntuaciones de células inflamatorias (IL6; r = 0,520, p = 0,047, IL-1ß; r = 0,680, p < 0,01).

4 Discusión

El análisis del cerumen es un método no invasivo que es capaz de reflejar el estado inflamatorio de los perros (8). El presente estudio evaluó la expresión de citoquinas cutáneas en perros infectados con OE utilizando métodos no invasivos de hisopado de cerumen. Las citocinas en el cerumen se expresan diferencialmente entre la ceruminosa Malassezia OE y la OE bacteriana supurativa. En consecuencia, el OE ceruminoso de Malassezia mostró concentraciones de IL-8/CXCL8 mayores que las del control, mientras que el OE bacteriano supurativo mostró niveles significativamente mayores de IL-6, IL-1ß e IL-8/CXCL8. Los niveles de IL-8/CXCL8 son más altos en el OE bacteriano supurativo que en el CERUMINOSO Malassezia OE. Además, el aumento de los niveles de citoquinas se correlacionó positivamente con el número de agentes infecciosos o células inflamatorias. El presente estudio indica que los métodos no invasivos de hisopado de cerumen en perros con OE permiten el análisis de la expresión de citoquinas, lo que podría reflejar el estado fisiopatológico del canal auditivo. Las citocinas derivadas de queratinocitos pueden expresarse diferencialmente dependiendo de la presencia o ausencia de patógenos o células inflamatorias.

La IL-8/CXCL8 es un miembro de la familia de supergenes de citoquinas proinflamatorias y quimiotácticas, y es producida por macrófagos y otros tipos de células, como las células epiteliales de los queratinocitos (13). En este estudio, tanto la OE de Malassezia ceruminosa como la OE bacteriana supurativa mostraron un aumento significativo de las concentraciones de IL-8/CXCL8. Además, las concentraciones de IL-8/CXCL8 se correlacionaron positivamente con organismos infecciosos y bacterias de Malassezia. Se han reportado hallazgos similares con las concentraciones de IL-8 en el canal auditivo de ceruminoso en perros con OE que disminuyeron significativamente con la reducción de organismos Malassezia debido al uso de limpiadores de oídos (12). Estudios previos han demostrado que las especies de Malassezia inducen la secreción de IL-8 por los queratinocitos humanos (9, 14-16). Por lo tanto, el aumento de las concentraciones de IL-8/CXCL8 en el ceruminoso Malassezia OE puede estar relacionado con el alto número de microorganismos de Malassezia que inducen la secreción de IL-8/CXCL8 de los queratinocitos epidérmicos. Además, se ha reportado que bacterias como Staphylococcus spps. Inducen directamente la producción de IL-8 en queratinocitos humanos (10). En este estudio, el aumento de las concentraciones de IL-8/CXCL8 en el OE bacteriano supurativo podría estar asociado con un aumento de la colonización bacteriana en el canal auditivo. Las concentraciones de IL-8 fueron significativamente más altas en los perros con OE bacteriano supurativo que en aquellos con OE ceruminoso de Malassezia. Estos resultados se debieron a un mayor número de bacterias en el OE supurativo que en la levadura Malassezia en el OE ceruminoso y/o a la presencia de otras células inflamatorias en el OE supurativo.

De manera similar, se han reportado concentraciones significativamente mayores de IL-8 / CXCL8 en estudios previos que analizaron citoquinas mediante hisopos del cerumen o la superficie oclusal de perros con dermatitis atópica (6, 7). En un análisis de la expresión de citoquinas en hisopos conjuntivales, la IL-8 fue la única citocina que se incrementó significativamente en perros atópicos, mostrando una correlación positiva con las puntuaciones conjuntivales y de prurito (7). Además, la concentración de IL-8 también es significativamente mayor en los oídos de los perros atópicos que en los perros sanos (6). Curiosamente, a diferencia del presente estudio, el estudio anterior solo seleccionó pacientes con otitis no infectados para evitar la producción de citoquinas proinflamatorias relacionadas con los microbios. Dado que las concentraciones de IL-8/CXCL8 se ven afectadas por organismos infecciosos, incluida Malassezia y agentes bacterianos, se deben excluir los organismos infecciosos al estudiar la IL-8 como biomarcador de dermatitis atópica.

La IL-1β y la IL-6 son citoquinas proinflamatorias que son cruciales para las respuestas de defensa del huésped a infecciones y lesiones. Son producidos y secretados por varios tipos de células, en particular las del sistema inmune innato, como los monocitos y los macrófagos (17, 18). Además, se ha informado que las levaduras y bacterias Malassezia estimulan la producción de IL-1β e IL-6 a partir de queratinocitos epidérmicos (10, 19-21). Sin embargo, en este estudio, no se observaron aumentos significativos de estas citoquinas en los perros con ceruminosa Malassezia OE; en concreto, apenas se detectó IL-6 en estas muestras. Un estudio previo con el ensayo Luminex® demostró que la IL-6 era indetectable en el canal auditivo de perros con OE atópica (6). Por el contrario, este estudio mostró concentraciones significativamente mayores de IL-1ß e IL-6 en el cerumen de perros con OE bacteriano supurativo. Además, las concentraciones de estas citoquinas se correlacionaron positivamente con las puntuaciones de células inflamatorias. Por lo tanto, es posible que en el caso de OE con inflamación purulenta, la expresión de IL6 se incremente para reclutar neutrófilos y/o para aumentar aún más la producción de citoquinas por parte de las células inflamatorias. Por lo tanto, cuando se estudian citocinas a través del hisopado de la superficie de la piel, se pueden seleccionar IL-1ß e IL-6 como objetivos cuando hay inflamación purulenta.

Las expresiones de IL-10 y TNF-α no se detectaron en el ensayo ELISA utilizado en todos los sujetos. En un estudio previo con tecnología Luminex®, la concentración de IL-10 aumentó significativamente en el canal auditivo de perros con OE atópico (6). El rango de ensayo de los kits ELISA de IL-10 utilizados en este estudio fue de 31,2 a 2.000 pg/mL, mientras que los kits predefinidos que utilizaron la tecnología Luminex® en el estudio anterior tuvieron un rango de 12 a 50.000 pg/mL (6). Por lo tanto, la falta de IL-10 detectable en este estudio podría estar relacionada con el método analítico en el que los kits de ELISA disponibles comercialmente utilizados en este estudio tienen una sensibilidad relativamente menor para IL-10 en el cerumen de los canales auditivos de los perros. Además, dado que el TNF-α no fue detectable en un estudio con el ensayo Luminex® (6), el TNF-α podría expresarse mínimamente en el cerumen.

Las posibles limitaciones de este estudio son las siguientes. (1) Debido a que los factores primarios para la OE no se han identificado completamente, los efectos del factor primario sobre la expresión de citocinas no se han descartado por completo. Los factores primarios de OE, como la enfermedad cutánea allégica y la eondocrinopatía, podrían afectar a la expresión de citocinas. Es posible que haya citocinas que no se hayan podido detectar porque el análisis de citocinas se realizó utilizando kits de ELISA disponibles en el mercado. Se requieren estudios a gran escala de varios tipos de OE utilizando otros ensayos, como el ensayo Luminex®, para comprender mejor la expresión de citocinas como biomarcadores en perros con OE.

En conclusión, el presente estudio demostró que se detectaron niveles elevados de IL-8/CXCL8, IL-6 e IL-1ß utilizando hisopados de cerumen no invasivos en perros con OE infectados con Malassezia y bacterias. El presente estudio proporciona datos fundamentales para futuros análisis de la expresión de citoquinas de la piel, especialmente utilizando métodos no invasivos como el hisopado del cerumen, la superficie ocular y la extracción con cinta adhesiva del estrato córneo. Las citocinas diana pueden eliminarse dependiendo de la presencia o ausencia de agentes infecciosos y células inflamatorias.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración ética

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional de Jeonbuk. Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones de los autores

J-SY: Escritura – borrador original, Investigación. JP: Conceptualización, Escritura – revisión y edición.

Financiación

El/los autor/es declaran/n que se recibió apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Esta investigación fue financiada por el Proyecto No. PJ01690702 de la Administración de Desarrollo Rural de la República de Corea.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

El editor DY declaró una coautoría pasada con los autores JP y J-SY.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2024.1355569/full#supplementary-material

Referencias