Introducción

La paratuberculosis es una enfermedad crónica y debilitante de los rumiantes causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Mapa) (1) y responsable de pérdidas económicas globales significativas estimadas en aproximadamente US $ 12,61 millones y 364,31 millones de dólares en ganado lechero español y de la Unión Europea, respectivamente (2, 3). Map es una bacteria ubicua transmitida entre el ganado a una edad temprana a través de la ruta fecal-oral, aunque las manifestaciones clínicas pueden aparecer varios años después de la infección (4). La respuesta inmune protectora inicial contra Map se ha relacionado con una fuerte respuesta inmune mediada por células caracterizada por la liberación de la citoquina proinflamatoria interferón γ (IFN-γ), la formación de granulomas y la aclaramiento de las micobacterias (5, 6). En este sentido, los animales infectados por el mapa pueden mostrar una variedad de lesiones que se ha demostrado que están estrechamente relacionadas con las diferentes fases de la enfermedad. Las lesiones tempranas de paratuberculosis se caracterizan por granulomas pequeños y bien demarcados, llamados formas focales o multifocales, ubicados dentro del tejido linfoide intestinal que también se pueden ver en animales adultos, donde se consideran formas de latencia o resistencia; la interrupción de la respuesta inmune mediada por células protectoras conduce al desarrollo de lesiones difusas y Los métodos patológicos para la caracterización de lesiones paratuberculosis se han aplicado con éxito en trabajos anteriores como un indicador confiable de la presencia de la infección de Map y la forma de la enfermedad mostrada por los animales infectados (9-11).

El largo período de incubación y la capacidad de Map para persistir en los programas de control de la obstrucciones ambientales basados en medidas de gestión de la higiene o el diagnóstico precoz y el sacrificio de animales positivos (12, 13). Por esta razón, la vacunación con vacunas de muerte por calor disponibles en el mercado se ha considerado como la medida más rentable para el control de la paratuberculosis, ya que su uso reduce la incidencia de la enfermedad dentro del rebaño (14, 15). La vacunación conduce a una reducción tanto de la colonización de los tejidos intestinales como del número de animales clínicamente afectados, logrando una disminución de aproximadamente el 90 % en la aparición de animales de eliminación de mapas (16-18).

Sin embargo, los mecanismos que podrían estar involucrados en la protección asociada con la vacunación aún no se entienden completamente (12, 13). La protección otorgada por las vacunas contra la infección de Map se ha correlacionado con una respuesta inmune temprana y fuerte mediada por células (19-21), a pesar del hecho de que hay un bajo porcentaje de fracaso de vacunación, donde algunos animales vacunados podrían permanecer altamente infecciosos y desarrollar lesiones graves (16, 22, 23).

La mayoría de las vacunas muertas por paratuberculosis se basan en la cepa Map 316F, que ha demostrado una reducción de la virulencia (carga bacteriana tisular) durante la infección experimental de los terneros con este aislado vivo, probablemente debido a pasajes continuos in vitro (24). En este sentido, la inmunización subcutánea de ovejas con cepa Map 316F por sí sola no mostró una respuesta inmune mediada por células y humoral significativa (25). La suplementación con adyuvantes de aceite mineral es un principio fundamental para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos y su liberación continua con el fin de promover una respuesta inmune robusta a través de la montura de una fuerte inflamación local en el lugar de la inyección (26). En un experimento anterior, se encontraron variaciones significativas en la respuesta inmune cuando las vacunas paratuberculosas hechas con diferentes adyuvantes se administraron por vía subcutánea a las ovejas (25). Por otro lado, se ha demostrado que la única administración de adyuvantes provoca una respuesta inmune inespecífica cuyo efecto protector no se ha evaluado en detalle (27-29). En el caso de las vacunas contra la paratuberculosis, el efecto que cada componente podría tener en una respuesta protectora contra la infección de Map no se ha aclarado por completo.

Además, Map comparte un alto número de antígenos comunes con micobacterias relacionadas como Mycobacterium bovis (Mbv) o Mycobacterium caprae, responsables de la tuberculosis en rumiantes, un hecho que está más allá de las reacciones cruzadas que aparecen cuando se utilizan pruebas de base inmunológica para el diagnóstico de tuberculosis en animales infectados o vacunados por paratuber Esto también podría estar asociado con la reducción significativa de las lesiones relacionadas con la tuberculosis logradas después de la vacunación contra la paratuberculosis en cabras y terneros (32, 33). A pesar de este hecho, aún se desconoce el efecto de la inmunización con micobacterias relacionadas con la tuberculosis en el desarrollo de la paratuberculosis.

Por lo tanto, el objetivo de este estudio era analizar el efecto de la vacunación homóloga o heteróloga de las cabras, y un desafío posterior con Map, sobre la respuesta inmune y la protección y evaluar si los diferentes componentes de estas vacunas (bacterias inactivadas o adyuvantes) podrían participar en la respuesta del huésped vacunado contra Map.

Materiales y métodos

Declaración de ética

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las leyes europeas (86/609) y españolas (R.D. 223/1988, R.D. 1021/2005, R.D. 53/2013) y aprobado por el gobierno local siguiendo el informe y las sugerencias del Subcomité de Experimentos y Bienestar Animal de la Universidad de León (ULE) (OEBA-ULE-016-2017).

Vacunas, productos de inmunización y desafío de inóculo

La vacuna comercial de Silirum^® contra la paratuberculosis y sus componentes (el adyuvante de MontanideTM y la cepa Map 316F incluida en la vacuna) fueron preparadas por separado y enviadas por el fabricante, CZ Vaccines (Porriño, España), mientras que la vacuna Mbv inactivada térmicamente (HIMB) y sus componentes (un adyu En resumen, cada dosis de la vacuna HIMB (1 ml) consistía en una suspensión acuosa de 107 unidades formadoras de colonias (CFU) inactivadas por calor de la cepa de NEIKER de Mbv 1403 (84-85 °C durante 45 minutos) emulsionada en adyuvant de MontanideTM ISA 50 V 2 (eppic, Francia). Además, cada bacteria inactivada y productos de inmunización adyuvante se ajustaron a la misma dosis administrada en las vacunas Silirum^® y HIMB. Por lo tanto, cada dosis (1 ml) de bacterias inactivadas (109 UFC del mapa 316F y 107 UFC de las cepas de Mbv 1403) se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS), mientras que cada dosis de adyuvant de MontanideTM (1 ml) (utilizada en las vacunas Silirum^® y HIMB) se emuls

Además, la cepa del mapa de bovinos 764 se preparó para el desafío, como lo describieron anteriormente Fernández et al. (11). En resumen, la cepa Map 764 se cultivó en caldo Middlebrook 7H9 enriquecido con un 10% de ácido oleico-albúmina-dextrosa-catalasa (OADC) y 2 mg · L−¹ Mycobactin J (7H9 OADC MJ) durante 3 semanas a 37 ± 1°C. Luego, los cultivos se cosecharon por centrifugación a 3.000 g durante 10 minutos, y los gránulos bacterianos se lavaron dos veces y se resuspendiaron en PBS. Con el fin de interrumpir los grupos bacterianos, la suspensión resultante se pasó hacia arriba y hacia abajo a través de una aguja de calibre 27 varias veces y se hizo vórtices. La concentración bacteriana se estimó mediante la densidad óptica (O.D.) y la estimación de UFC de diluciones en serie de 10 veces plateadas en 7H9 OADC MJ solidificado con agar. Finalmente, las suspensiones se ajustaron a 1,2 × 1010 UFC · mL−¹ y se mantuvieron a 4 °C durante todo el período de desafío (2 semanas), y los grupos bacterianos se interrumpieron de nuevo antes de la inoculación oral, como se mencionó anteriormente.

Diseño experimental

En este estudio se utilizaron un total de 50 hembras de raza de cabra de Murciano-Granadina de 1 mes de edad. Los animales fueron seleccionados de una bandada sin signos clínicos y dieron negativo para paratuberculosis y tuberculosis en los últimos 10 años. Además, no se identificaron reactores positivos en las campañas oficiales anuales de erradicación de la tuberculosis, basadas en la prueba cutánea intradérmica, realizadas por las autoridades regionales de salud animal durante los últimos 5 años. El estado libre de paratuberculosis y tuberculosis de los animales experimentales se confirmó mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a la enzima de anticuerpos (ELISA) contra Map (ID Screen^® Paratuberculosis indirect, IDVet, Gabrels, Francia) y Mbv (INgezim Tuberculosis DR, Eurofins Technology, Madrid, España) y Después de un período de adaptación de 15 días en las instalaciones del Instituto de Ganadería de Montaña (IGM-ULE) en León (España), los niños de cabra fueron asignados al azar en corrales separados, sometidos a prácticas de gestión estándar, y su estado de salud y bienestar se revisaba diariamente.

Al comienzo del estudio, y de acuerdo con el protocolo de vacunación y/o infección a seguir, las cabras se clasificaron en 10 grupos (n = 5) y se distribuyeron en diferentes corrales para evitar el contacto directo entre grupos de acuerdo con el siguiente esquema (Figura 1):

VS: Silirum^® vacunado y no infectado

VSI: Silirum^® vacunado e infectado

VH: HIMB vacunado y no infectado

VHI: HIMB vacunado e infectado

StrSI: inmunizado con la cepa Map 316F Silirum^® e infectado

StrHI: inmunizado con la cepa Mbv 1403 HIMB e infectado

AdjSI: inmunizado con el adyuvante MontanideTM Silirum^® e infectado

AdjHI: inmunizado con la vacuna MontanideTM HIMB adyuvante e infectado

NV: no vacunados y no infectados

NVI: no vacunados e infectados

No se incluyeron animales no infectados en grupos inmunizados con bacterias o adyuvantes inactivados, debido al hecho de que el estudio se centró en la evaluación del efecto de los componentes de las vacunas en la protección, después de la infección de Map, y esto implicaría la inclusión de un gran número de animales y grupos que obstaculizarían el estudio.

La vacunación se realizó al comienzo del experimento, el día 0, mediante una inyección subcutánea en el pecho con 1 ml de vacuna Silirum^®, 109 Mapa 316F Silirum^® cepas de la cepa de la vacuna CFU, 1 ml de MontanideTM Silirum^® adyuvante (CZ Vaccines, Porriño, España), 1 ml de

Cuarenta y cinco días después de la vacunación (dpv), los animales fueron desafiados por vía oral (Figura 1) utilizando una jeringa automática con una cantidad total de 1,2 × 1010 Mapa 764-CFU diluidos en 40 ml de PBS como lo describió anteriormente por Fernández et al. (11), mientras que 40 ml de PBS se administraron por vía oral a animales A lo largo del ensayo experimental, todas las cabras fueron monitoreadas diariamente en busca de signos clínicos y se tomaron muestras cada 30 días hasta el sacrificio (Figura 1). A 190 dpv, se realizaron necropsias completas y muestreo postmortem en todas las cabras después de ser sacrificadas humanamente por sedación profunda con xilazina (XILAGESIC^®, Laboratorios Calier, Barcelona, España) y una posterior inyección intravenosa de T61^® (MSD Animal Health, Salamanca, España) seguida de exsanguinación (Figura 1).

Colección de muestras

Las muestras de sangre se recogieron mensualmente de la vena yugular en tubos de Vacutainer con heparina de litio (Becton Dickinson and Company, Reino Unido) y sin anticoagulante (Becton Dickinson and Company, Reino Unido). Luego, las muestras heparinizadas se procesaron inmediatamente para la prueba de liberación IFN-γ en respuesta a los derivados de proteínas de los antígenos aviadores (PPDa) y bovinos (PPDb) a 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv (Figura 1). Al mismo tiempo, también se recogió sangre heparinizada para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (35) y su posterior caracterización mediante citometría de flujo. Además, se procesaron muestras no heparinizadas para pruebas de determinación de anticuerpos Map (ID Screen^® Paratuberculosis indirect, IDVet, Gabrels, Francia) y Mbv específicas (INgezim Tuberculosis DR, Eurofins Technology, Madrid, España) en 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv (Figura 1).

Las muestras fecales de cada cabra se recogieron por separado en guantes de plástico desechables directamente del recto a 190 dpv, antes de la eutanasia del animal, y se congelaron a -20 °C hasta su procesamiento para la detección de mapas a través del cultivo bacteriológico.

Los animales fueron sacrificados el día 190 dpv y se realizó una necropsia regulada, ordenada y completa. Después del examen bruto de las vísceras, las muestras del íleon (zonas proximal, media y distal), el yeyuno (zonas proximal, media y distal), la válvula ileocecal y los parches de Peyer jejunal (al menos tres parches de cada zona: proximal, medio y distal), junto con los ganglios linfáticos mesen Además, las muestras de íleon distal, parches jejunal Peyer y ganglio linfático mesentérico también se recogieron y almacenaron a -20 °C para el aislamiento de mapas por cultivo y detección por reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) en tiempo real, así como se procesaron inmediatamente para el aislamiento de leucocitos con el fin

Aislamiento de PBMC y leucocitos tisulares

Los PBMC se aislaron como se describió anteriormente (35). En resumen, se centrifugaron 30 ml de sangre periférica heparinizada y los PBMC se aislaron por centrifugación de gradientes utilizando LymphoprepTM (STEMCELL Technologies^®, Colonia, Alemania). Los PBMC resultantes se lavaron tres veces con PBS, y las suspensiones celulares se resuspensiónron en medio RPMI1640 suplementado + GlutaMaxTM (Gibco, Paisley, Reino Unido) y se contaron en una cámara Neubauer y se ajustaron a una concentración final de 106 células · mL-1. Las muestras intestinales y los ganglios linfáticos mesentéricos se recogieron y lavaron en PBS durante la necropsia, se pusieron en tubos de halcón individuales que contenían 30 ml de medio estéril suplementado RPMI1640 y se procesaron en el laboratorio dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Para el aislamiento de linfocitos tisulares, se abrieron 5 cm de parches de ileum y jejunal Peyer mostrando la mucosa y se lavaron con PBS hasta que se eliminaron los restos fecales, mientras que la grasa pericapsular se eliminó de los ganglios linfáticos. Se eliminó el exceso de tejido alrededor de cada parche de Peyer, y se raspó y picó la mucosa de los parches de ileum y Peyer. Además, 50 mg de tejido ganglio linfático mesentér se cortaron en trozos pequeños y se cortaron con una hoja de bisturí. El tejido picado se suspendió en 11 ml de PBS con EDTA (2 mM) y se procesó con una licuadora de estómago (Masticador, IUL) durante 2,5 minutos. Luego, se pasaron 10 ml de la parte superior homogeneizada a través del filtro de 40 μm (Thermo Fisher Scientific, Madrid, España), y la suspensión resultante se superpuso en un volumen igual de LymphoprepTM y se centrifugó a 800 g durante 30 minutos sin parada ni aceleración. Las células de la capa de interfaz se lavaron tres veces con PBS/EDTA, se contaron en una cámara de Neubauer y se resuspendiaron en RPMI1640 suplementado a una concentración final de 106 células · mL-1.

La viabilidad celular determinada por la exclusión del tinte azul tripano suele ser >90% tanto para PBMC como para linfocitos tisulares (los datos no se muestran).

Respuesta inmune humoral periférica y mediada por células locales y periférica

Se procesaron muestras enteras de sangre periférica heparinizada tomadas a 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv dentro de las 3 horas posteriores a la recolección. Para cada animal, tres pozos de una placa de tejido de 24 pozos (Thermo Fischer Scientific, Rochester, NY) se llenaron con 1,5 ml de sangre cada uno y se mezclaron con 100 μL de PBS estéril (control negativo) o se estimularon con 100 μL de PPDa o PPDb (CZ Vaccines, Porriño, Después de 22 horas de estimulación, las placas se centrifugaron a 750 g durante 15 minutos, y el plasma se recogió y almacenaba a -20 °C hasta que se probara.

Para el análisis de la respuesta inmune local mediada por células, un total de 2 × 106 leucocitos mononucleares aislados de íleon, parches de Peyer y ganglios linfáticos mesentéricos se sembraron por pozos por pozos cada uno de una placa de tejido de 24 pozos y se estimularon como se describe para la sangre entera. Después de 22 horas de estimulación, las placas se centrifugaron a 750 g durante 15 minutos, y los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -20 °C hasta que se probaron.

La producción de IFN-γ en estos ensayos se evaluó mediante duplicado utilizando ELISA comercial para IFN-γ bovinos siguiendo las instrucciones del fabricante (prueba Bovigam^® Mbv IFN-γ para ganado, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.), y los valores de absorbancia se midieron espectrofotométricamente utilizando un lector ELISA ELX800 ( Los valores de O.D. se ajustaron dividiendo el plasma o el valor de O.D. sobrenadante por el valor de O.D. de control negativo de cada placa para evitar variaciones entre placas. Los resultados se expresaron como valores de índice de aves y bovinos por medio del cociente entre el O.D. medio de PPDa o O.D. del plasma estimulado con PPDb, respectivamente, y el O.D. medio del plasma de control negativo (11, 36).

Se permitió que las muestras de sangre no heparinizadas coagularse y se retractaran, y el suero se almacenó a -20 °C hasta su uso. Cada suero se probó para detectar anticuerpos específicos contra Map (37) y Mbv (38) utilizando pruebas ELISA comerciales (ID Screen^® Paratuberculosis indirect, IDVet, Gabrels, Francia; e INgezim Tuberculosis DR Eurofins Technology, Madrid, España, respectivamente) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como la relación S/P de los anticuerpos Map y Mbv calculada dividiendo la O.D. corregida de la muestra por la O.D. corregida del control positivo y multiplicándose por 100 (39).

Detección cuantitativa en tiempo real del mapa

El ADN se extrajo de 50 mg de íleon distal, parches jejunal Peyer y ganglio linfático mesentér utilizando el kit de purificación de ADN tisular Maxwell^® 16 (Promega, WI, EE. UU.) con el instrumento Maxwell 16 (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. A partir de eso, el ADN se cuantificó utilizando el kit QuantiFluorTM ONEdsDNA System (Promega, WI, EE. UU.) y el fluorómetro QuantusTM (Promega, WI, EE. UU.). El ADN extraído se diluyó a 50 ng · μL−¹ y se almacenó a -20 °C hasta que se realizó la qPCR. Se extrajo y cuantifica el ADN genómico de 2 × 108 CFU del mapa y de 50 mg de tejidos de un animal no infectado para generar una curva estándar.

La detección de la secuencia del mapa IS900 se realizó como se describió anteriormente por Arteche-Villasol et al. (40). Además, la cuantificación del ADN de mapa y la sensibilidad analítica de qPCR se evaluaron mediante la construcción de una curva estándar diluida de 10 veces utilizando ADN genómico de mapa que oscila entre 1.000 pg y 0,001 pg/reacción mezclada con 100 ng/reacción de ADN tisular de un animal no infectado. Las muestras se consideraron positivas cuando el pico de disociación (Tm) fue de 89,1 ± 1,5 °C y los ciclos de umbral (Ct) fueron ≤ 37 (41, 42). Los resultados de qPCR se analizaron utilizando 7500 Software v2.0.6 (Applied BiosystemsTM). La cantidad de ADN del mapa (pg) de cada pozo se calculó mediante la interpolación de sus valores de Ct con la curva estándar como se describió anteriormente (43), y la cantidad media se calculó a partir de ambos duplicados.

Mapa de cultivo tisular y fecal

El íleon distal, los parches de Peyer jejunal y el ganglio linfático mesentér de cada animal se probaron individualmente, mientras que las muestras fecales se agruparon en grupos de tres cabras cada una. Los segmentos del parche de Ileum y Peyer (12 cm) y 2 gramos de ganglio linfático mesentéreo se procesaron como se describe para el aislamiento de leucocitos tisulares y siguiendo los métodos descritos anteriormente (44). Brevemente, 2 g de cada charco de muestras de tejido y fecales se descontaminaron con 38 ml de cloruro de hexadecilpiridinio y se homogeneizaron en una licuadora de estómago (Masticador, IUL) durante aproximadamente 15 s. Después de 18 horas de descontaminación, se utilizaron 200 μL de la suspensión para inocular dos tubos que contenían el medio de yema de huevo de Herrold complementado con piruvato sódico y micobactina J (MJ) y dos tubos que contenían 7H9 OADC suplementado con MJ, penicilina, anfotericina y Los cultivos se incubaron a 37 °C ± 1°C, y el crecimiento se comprobó mediante un examen con un microscopio estereoscópico después de 8, 12, 16 y 20 semanas de post-minulación. Los cultivos se consideraban positivos si se observaban una o más colonias de mapas característicos en cualquier tubo. Las colonias aisladas en ambos medios fueron confirmadas por una PCR múltiplex en tiempo real que detecta las secuencias de mapas IS900 e ISMap02(45).

Análisis citométrico de flujo de PBMC y leucocitos tisulares

Se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo de un solo color para la caracterización fenotípica de PBMC aislados a 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv y leucocitos mononucleares aislados del íleon distal, los parches jejunal Peyer y el ganglio linfático mesentérico. Un número total de 2 × 105 células por pozo se sembraron en una placa de 96 pozos (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) e incubaron con anticuerpos primarios contra los marcadores de superficie de linfocitos detallados en la Tabla 1 durante 1 h a 4 °C. Después, las células se lavaron dos veces con PBS e incubaron con anticuerpos secundarios conjugados apropiados durante 1 h a 4°C (Tabla 1). Finalmente, las células se fijaron con el 1 % de CellFIXTM (Becton Dickinson and Company, Erembodegem, Bélgica) hasta que se analizaron. La adquisición de muestras de 10.000 eventos se realizó utilizando un citómetro de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec^®), donde los eventos se cerraron durante el análisis de adquisición como se describió anteriormente en otros lugares (35) para descartar la presencia de aire y dobles. Luego, el análisis de los datos se llevó a cabo utilizando el MACSQuantify10 SoftwareTM (Miltenyi Biotec^®), y los resultados se expresaron como porcentaje de células positivas.

Examen histopatológico

Los tejidos fijos para el examen histopatológico se procesaron convencionalmente para la incrustación de parafina y se mancharon con la técnica hematoxilina-eosina y Ziehl-Neelsen para la detección de bacilos ácidos rápidos (46).

Las lesiones consistentes con la infección del mapa se clasificaron como focales, multifocales a y multifocales b, o formas difusas de acuerdo con la presencia y ubicación de los granulomas y siguiendo las pautas descritas anteriormente para los rumiantes pequeños (8, 46). En resumen, las lesiones se caracterizaron como formas focales cuando los granulomas se restringieron al tejido linfoide de los parches Peyer; formas multifocales cuando los granulomas se ubicaron en la lámina propia adyacente al tejido linfoide (multifocal a) o no (multifocal b) y formas difusas cuando los granulomas se propagan a amplias áreas de La clasificación de cada animal se basó en su lesión granulomatosa más grave. Después del examen histopatológico, el número de granulomas por sección de tejido se cuantificó en todas las muestras de tejido como se describe en otra parte (11,46). Se seleccionaron tres secciones de tejido de cada sitio intestinal (es decir, zonas del íleon, proximal, medio y distal; zonas jejunum – proximal, media y distales; válvula ileocecal y parches de Peyer jejunal, zonas proximales, medias y distales) y dos secciones de cada ganglio linfático (es decir, ganglios mesenter

Análisis estadístico

La distribución normal de los resultados de los anticuerpos específicos de Map y Mbv, la producción local y periférica de IFN-γ y la proporción de subpoblaciones de linfocitos periféricos y de tejido se evaluaron para la normalidad utilizando la prueba Shapiro-Wilk. Los datos de la producción de IFN-γ y las pruebas ELISA de anticuerpos se transformaron logarítmicamente. Luego, se analizaron los resultados de citometría de flujo y ELISA de la producción periférica de IFN-γ y anticuerpos utilizando el procedimiento de modelo lineal generalizado (GLM) para evaluar los principales efectos de la vacunación, el desafío, el tiempo y sus interacciones. Posteriormente, las diferencias entre los grupos de vacunación por cada vez muestreados se estimaron utilizando la corrección Tukey-Kramer para comparaciones múltiples. Del mismo modo, los principales efectos de la vacunación, los tejidos y sus interacciones se estimaron en los resultados de la producción local de IFN-γ, seguido de la evaluación de las diferencias entre los grupos de vacunación y los tejidos utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer. Además, las diferencias entre los grupos en el número de cabras con lesiones se evaluaron utilizando las pruebas exactas de χ2 y Fisher. Además, después de la transformación logarítmica, las diferencias en los recuentos de granulomas entre los grupos de vacunación se calcularon utilizando la prueba t de Student. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el software GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, EE. UU.), excluyendo los GLM que se realizaron con el software R 3.5.3 (R Development Core Team, 2019). P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Respuesta inmune mediada por células periféricas y locales (IFN-γ)

Los resultados de GLM mostraron que los valores de los índices aviares y bovinos alcanzaron niveles significativos de 60 a 190 dpv en los grupos VS, VSI, VH y VHI (p < 0,001 y p < 0,01 respectivamente) (Figuras 2A,B). Además, la inmunización contra Silirum^® (VS y VSI) y la vacuna HIMB (VH y VHI) ejerció un efecto considerable en los valores del índice de las aves, independientemente del estado de infección (p < 0,01 y p < 0,001, respectivamente) (Figura 2A), pero solo los grupos VHI, VH y StrHI mostraron un efecto significativo en Además, el desafío oral afectó significativamente a los niveles de índice aviar de los grupos VSI, VHI (p < 0,001) y NVI (p < 0,05) y en los valores de índice bovino de los grupos VSI, VHI (p < 0,01) y StrHI (p < 0,05).

FIGURA 2. Cinética de la producción de IFN-γ por sangre entera estimulada con antígenos avianos (PPDa) y bovinos (PPDb). Los resultados se expresan como valores de índice de O.D. avia (A) y bovina (B) de cada grupo de vacunación (n = 5) (NV, no vacunado y no infectado; NVI, no vacunado e infectado; VS, Silirum^® vacunado y no infectado; VSI, Silirum^® vacunado e infectado; VH, HIM La línea roja con puntos verticales representa el momento del desafío oral del mapa (45 dpv). Las diferencias significativas determinadas por comparaciones múltiples se representaron como ^*p < 0,05, ^**p < 0,01, ^***p < 0,001,^****p < 0,0001.

El análisis de comparaciones múltiples mostró que el grupo VSI tenía valores de índice de aviar más altos que NV, NVI, StrSI, AdjSI y AdjHI a 60 y 120 dpv, mientras que el grupo VS mostró estas diferencias solo a 120 dpv (Figura 2A). Por el contrario, estos grupos no mostraron ninguna diferencia significativa en los niveles de los índices bovinos (Figura 2B). Además, no se observaron diferencias entre VS y VSI ni en los valores de índice aviar o bovino en ningún momento. Por otro lado, el grupo VHI mostró mayores valores de índice aviar que NVI, NV, StrSI, AdjSI y AdjHI a 120 dpv (Figura 2A). Además, los valores del índice bovino de este grupo fueron significativamente más altos que NV, NVI, StrSI, AdjSI y AdjHI en 90, 120, 150 y 190 dpv y mayores que VH a 120 dpv (Figura 2B).

La producción local de IFN-γ en leucocitos mononucleares purificados de tejidos y estimulados con PPDa y PPDb fue menor que la observada en PBMC. Además, los valores del índice de aves de aves fueron más heterogéneos que los niveles de índice bovinos a causa de la mayor variabilidad individual observada en los primeros (Figuras 3A,B), específicamente en los grupos NVI, VH, VHI, StrHI y AdjSI (Figura 3A). Los parches de Peyer y el ganglio linfático mesentér del grupo NVI mostraron los valores más altos de índice de aviar seguidos de los íleon, los parches de Peyer y el ganglio linfático mesentérico del grupo StrHI (Figura 3A). Sin embargo, el análisis estadístico no mostró ningún efecto significativo de la vacunación o la ubicación del tejido en los valores del índice de aves o bovinos (p > 0,05). Además, tampoco se observaron diferencias significativas entre los grupos vacunados en el análisis de comparaciones múltiples (p < 0,05). Mientras tanto, se observaron diferencias significativas en los valores del índice de aves dentro del grupo NVI, donde la producción de IFN-γ fue mayor en los parches Peyer y el ganglio linfático mesentérico que en el íleon (p < 0,05) (Figura 3A). Además, a pesar de la alta variabilidad dentro de los grupos observados en los valores de los índices bovinos, los valores de los ganglios linfáticos mesentéricos del grupo VH fueron considerablemente más altos que los de los parches de íleon y Peyer (p < 0,01) (Figura 3B).

FIGURA 3. Producción de IFN-γ por leucocitos de íleon (IL), parches jejunal Peyer (JPP) y ganglio linfático mesentérico (MLN) estimulados con antígenos aviar (PPDa) y bovino (PPDb). Los resultados se expresan como valores de índice de O.D. aviar (A) y bovina (B) de cada grupo de vacunación (n = 5) (NV, no vacunado y no infectado; NVI, no vacunado e infectado; VS, Silirum^® vacunado y no infectado; VSI, Silirum^® vacunado e infectado; VH, Las barras y las líneas verticales representan valores medios y desviaciones estándar, respectivamente. Las diferencias significativas determinadas por comparaciones múltiples se representaron como ^*p < 0,05, ^**p < 0,01, ^***p < 0,001,^****p < 0,0001.

Respuesta humoral periférica

Los resultados de GLM estimaron que la producción de anticuerpos específicos de Map y Mbv alcanzó niveles significativos de 60 a 190 dpv (p < 0,001 y p < 0,0001, respectivamente) en los grupos vacunados con Silirum^® y HIMB (Figuras 4A,B). Además, el desafío oral aumentó la producción de anticuerpos específicos del mapa en los grupos vacunados VSI, VHI (p < 0,001) y NVI (p < 0,05) (Figura 4A) y la producción de anticuerpos específicos de Mbv en VHI (p < 0,001) (Figura 4B). Además, el análisis de comparaciones múltiples mostró que solo VSI tenía valores S/P específicos de Mape significativamente más altos en comparación con los grupos inmunizados con adyuvantes, bacterias inactivadas y no vacunados a 90, 120, 150 y 190 dpv, mientras que no se observaron diferencias significativas en VHI (Figura 4A). Además, no se observaron diferencias significativas en los niveles de anticuerpos del mapa, ni entre los grupos de vacunación Silirum^® y HIMB ni entre los grupos vacunados infectados y no infectados.

FIGURA 4. Cinética de los niveles de anticuerpos sééricos de la sangre periférica. Los resultados se expresan como la relación S/P de los anticuerpos específicos de Map (A) y Mbv (B) de cada grupo de vacunación (n = 5) (NV, no vacunados y no infectados; NVI, no vacunados e infectados; VS, Silirum^® vacunados y no infectados; VSI, Silirum^® vacunados e infectados; VH La línea roja con puntos verticales representa el momento del desafío oral del mapa (45 dpv). Las diferencias significativas determinadas por comparaciones múltiples se representaron como ^*p < 0,05, ^**p < 0,01, ^***p < 0,001,^****p < 0,0001.

Los valores de S/P específicos de Mbv fueron significativamente más altos al comparar el grupo VHI con los grupos VS, VSI, StrSI, StrHI, AdjSI y AdjHI en 60, 90, 120, 150 y 190 dpv (Figura 4B). Sin embargo, solo se observaron diferencias significativas entre VHI y VH a 120, 150 y 190 dpv (Figura 4B).

PCR cuantitativa y bacteriología de tejidos y heces

La detección del mapa se confirmó mediante qPCR (n = 4) y cultivo bacteriológico (n = 3) dentro de las cabras infectadas (n = 35). Los animales positivos a qPCR correspondían a (i) dos cabras de StrHI (gnos ganglio linfáticos mesenéricos y parches de Peyer, respectivamente), (ii) una de VHI (parcidos de Peyer) y (iii) una de AdjSI (parcidos de Peyer). Además, los animales positivos al cultivo bacteriológico correspondían a una cabra cada uno de NVI, VHI (ileum, parches Peyer y ganglios linfáticos mesentéricos positivos) y VSI (leum y ganglios linfáticos mesentéricos positivos). Solo los parches de Peyer de la cabra de VHI mostraron resultados positivos para ambas técnicas de detección. Todas las muestras de tejido de grupos no infectados fueron negativas para la amplificación de la secuencia IS900por qPCR o cultivo bacteriológico. El cultivo bacteriológico de Map fue negativo en cada muestra fecal analizada.

Subconjuntos de linfocitos de sangre y tejidos periféricos relativos

Las desviaciones medias y estándar de las proporciones relativas de tres linfocitos T (CD4⁺, CD8⁺ y CD3⁺), un linfocito T γδ y dos marcadores de superficie de linfocitos B (CD21⁺ y CD20⁺) se estimaron mediante citometría de flujo.

A lo largo de todos los grupos, la mayor proporción relativa de células positivas en PBMC aislados de sangre entera correspondía a linfocitos T γδ (30,46 % ± 3,55%), mientras que la proporción más baja se observó en linfocitos B CD20⁺ (5,96 ± 1,48%) a lo largo del estudio (Tabla Complementaria 1). Sin embargo, a pesar de que el análisis estadístico muestra oscilaciones significativas (p < 0,001) de las proporciones relativas de linfocitos CD4⁺, CD8⁺, WC1⁺, CD21⁺, CD3⁺ y CD20⁺ en diferentes muestreos, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p > 0,05).

La citometría de flujo realizada en células purificadas a partir de muestras de tejido mostró que los niveles de proporción relativa más altos correspondían a linfocitos B CD21⁺ en el íleon (39,47 ± 4,71%), los parches de Peyer (26,81 ± 3,59%) y el ganglio linfático mesentére (44,90 ± 3,52%), mientras El análisis estadístico mostró una influencia significativa de la vacunación e inmunización con bacterias inactivadas y adyuvantes en la proporción relativa de subconjuntos de linfocitos tisulares (p < 0,05). Sin embargo, los resultados de las comparaciones entre grupos no mostraron un patrón claro entre la proporción relativa de subpoblaciones de linfocitos y los diferentes grupos probablemente debido a la variabilidad individual observada dentro de los grupos. La media, la desviación estándar y los resultados de las comparaciones múltiples de las subpoblaciones relativas de linfocitos en los parches de ileum, Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos se resumen en las Tablas Suplementarias 2-4.

Hallazgos patológicos

No se encontraron lesiones gruesas compatibles con la paratuberculosis en ningún animal.Se detectaron lesiones granulomatotosas microoscópicas características de la infección de Map en todos los grupos infectados, con diferencias en la gravedad y distribución. El número de cabras por grupo con lesiones según el tejido y el número de cabras por grupo clasificadas en términos de gravedad de las lesiones se muestran en la Tabla 2. Las cabras con granulomas pequeños y bien definidos compuestos de macrófagos, con un abundante citoplasma pálido y un núcleo grande, escoltados por unos pocos linfocitos ubicados exclusivamente en el área interfolcular del tejido linfoide intestinal, se clasificaron como focales (n = 5) (Figura 5A). Además, las cabras con granulomas bien definidos en el área interfolcular de los parches Peyer y también en la lámina propia estrechamente asociadas con el tejido linfoide intestinal se clasificaron como multifocal a (n = 5) (Figura 5B). Finalmente, la presencia de lesiones granulomatotosas no solo en los parches de Peyer y la lámina propia relacionada, sino también en áreas de la mucosa sin ninguna asociación con el tejido linfoide se consideró como b multifocal (n = 13) (Figura 5C). No se notaron lesiones difusas en los tejidos de ninguna cabra (n = 0). Los grupos VSI y VHI fueron los menos afectados, con solo un animal de cada grupo que desarrollaba lesiones granulomatosas, mostrando diferencias significativas en comparación con el NVI en el que las lesiones estaban presentes en todos los animales (p < 0,05). Además, las lesiones de la cabra VSI se clasificaron como focales, mientras que la cabra del grupo VHI mostró lesiones más graves, clasificadas como multifocal b como todas las cabras del NVI. Además, la mayoría de las cabras inmunizadas con cepas (StrSI y StrHI) desarrollaron formas b multifocales, a excepción de un animal de StrHI con una lesión focal. Por el contrario, entre los animales inmunizados con adyuvantes (AdjSI y AdjHI), solo un animal del AdjSI mostró lesiones b multifocales, mientras que las lesiones focales y multifocales a se encontraron en las cabras restantes. No se detectaron diferencias significativas en el número de cabras con lesiones granulomatosas en grupos inmunizados con bacterias inactivadas o adyuvantes (p > 0,05). Las lesiones granulomatotas se localizaron principalmente en los parches jejunales de Peyer seguidos de íleon distal, ganglios linfáticos, válvula ileocecal y yjunio, aunque las lesiones observadas en los ganglios linfáticos siempre se asociaron con la presencia de lesiones granulomatosas en el intestino (Tabla 3). No se observaron lesiones microscópicas en los grupos que permanecieron como no infectados. No se detectaron bacilos ácidos-rápidos en las lesiones de ninguna de las cabras infectadas.

TABLA 2. Número de animales de cada grupo con lesiones microscópicas consistentes con paratuberculosis de acuerdo con el tejido examinado y su gravedad (focal, multifocal a, multifocal b y difuso).

FIGURA 5. Tipos de lesiones granulomatosis paratuberculosas encontradas en el estudio. (A) Lesión fecal: granulomas bien demarcados compuestos por pequeños grupos de macrófagos ubicados en el área interfolicular de los parches de Peyer. (B) Lesión multifocal a: pequeños granulomas ubicados en el área interfolcular del tejido linfoide (asterisco) y en la lámina propia asociada (cabezas de flecha). (C) Lensión multifocal b: granulomas ubicados en la lámina propia en un área desprovista de tejido linfoide.

TABLA 3. Resultados del recuento de granulomas. Número de granulomas según su ubicación para cada grupo y número total y porcentaje (%) de granulomas por grupo.

El número total de granulomas por grupo se resumió en la Tabla 3. El grupo NVI mostró el número más alto, mientras que el más bajo correspondía a los grupos VSI y VHI. Además, el número de granulomas observados en los grupos StrSI y StrHI fue mayor que los observados en AdjSI y AdjHI. Se observaron diferencias significativas en el número medio de granulomas por grupo (Figura 6) entre los grupos NVI (159,60 ± 271.90) y VSI (4,60 ± 10,29) y VHI (6,20 ± 13,86) (p < 0,05). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en los grupos StrSI (57,60 ± 61,54), StrHI (61,40 ± 83,22), AdjSI (20,00 ± 26,82) y AdjHI (29,20 ± 33,86) (p > 0,05).

FIGURA 6. Recuento medio de granulomas de los tejidos de los grupos vacunados e infectados. Los datos se expresan como número medio de granulomas por grupo, y desviaciones estándar en cada grupo (n = 5) y las diferencias significativas se representaron como ^*p < 0,05, ^**p < 0,01,01, ^***p < 0,001, ^****p < 0,0001.

Discusión

Los estudios de vacunación contra la paratuberculosis realizados en rumiantes han demostrado resultados valiosos en la reducción del número de animales clínicamente afectados y la prevalencia de la enfermedad (16, 23). Sin embargo, la incapacidad de la respuesta inmune protectora provocada por la vacunación para prevenir completamente la infección y su progresión y propagación se está alejando del término «vacuna ideal» (47, 48). Esta desventaja se debe en parte a la falta de conocimiento sobre los mecanismos periféricos y locales relacionados con el éxito o el fracaso de la protección contra las micobacterias. Aquí, este trabajo analiza la respuesta inmune local y periférica provocada por la vacunación homóloga (Silirum^®) y heteróloga (vacunas IMB) y la inmunización con sus componentes por separado y su relación con el grado de protección estimado por la evaluación de las lesiones granulomatotosas microscópicas y la presencia de mapas en los tejidos.

A pesar de la identificación de lesiones granulomatosas de paratuberculosis distintivas en todos los grupos de cabras infectadas, independientemente de su estado de vacunación o inmunización, la variación en su gravedad refleja las observaciones de los estudios de campo y experimentales, ya que las lesiones observadas en cabras vacunadas con paratuberculosis eran leves (focales) y escasas, mientras No se notaron lesiones difusas, posibles debido al corto período de incubación de este trabajo (4-5 meses), en línea con otros estudios en los que se observaron lesiones b multifocales hasta 7 meses después de la infección, mientras que las lesiones de tipo difuso no se notificaron hasta 12 meses (46, 49). A pesar de este hecho, los resultados obtenidos aquí están de acuerdo con otros estudios experimentales en los que las lesiones observadas en animales vacunados se limitaron a formas regresivas (focales), contenidas en el área interfolcular del tejido linfoide intestinal, evitando su diseminación a través del intestino pero sin prevenir la infección, como se confirmó por la detección de Map en los tejidos

Hasta la fecha, los estudios de eficacia de la vacunación in vivo se han centrado principalmente en la inducción temprana y sostenida de IFN-γ periférico (20, 21, 52), ya que la liberación de esta citocina se ha asociado con la activación de los mecanismos antimicobacterianos y la prevención del crecimiento bacteriano intracelular (53, 54). Ciertamente, la dinámica de producción de IFN-γ observada en grupos vacunados por Silirum^® (es decir, VS y VSI) fue consistente con otros estudios realizados con niños de cabra vacunados con vacunas de muerte por el calor (52, 55). Además de la respuesta inmunitaria mediada por las células, los animales vacunados por Silirum^® también mostraron un aumento de los niveles de anticuerpos de Map. El papel de la respuesta humoral se ha subestimado, ya que se ha considerado ineficaz contra los patógenos intracelulares (56, 57). Sin embargo, un número emergente de estudios realizados en condiciones experimentales han sugerido el posible efecto positivo de los anticuerpos en el control de la paratuberculosis, incluso en relación con la vacunación (58-60). Esto se apoya en la fuerte respuesta humoral inicial observada en ovejas vacunadas con paratuberculosis y la capacidad de estos animales para modular esa respuesta en etapas posteriores para prevenir la progresión de la infección (60). Tanto las respuestas celulares como humorales se mejoraron significativamente en este estudio después del desafío experimental con Map. Estos resultados imitan el aumento en el IFN-γ observado en cabras vacunadas por paratuberculosis y expuestas naturalmente en condiciones de campo (61), aunque el aumento significativo en la producción de anticuerpos después de Map oral challenge aquí observado contrasta con estudios anteriores en los que la infección oral experimental en ovejas vacunadas no exhibió diferencias con animales no vacunados o incluso condujo a Sin embargo, las mayores respuestas celulares y humorales observadas aquí no impidieron la aparición de lesiones granulomatosas en el grupo VSI. Por lo tanto, a pesar de que la vacunación podría estar limitando la progresión y la gravedad de las lesiones, ya que solo una cabra VSI desarrolló un bajo número de granulomas focales, la respuesta celular y humoral periférica no permitió predecir la presencia de lesiones o infecciones en animales vacunados.

Además, los cambios en la proporción relativa de subpoblaciones de linfocitos también se han relacionado con infecciones micobacterianas (62–64). En este sentido, las vacas con enfermedad clínica han mostrado proporciones más bajas de linfocitos T CD4⁺, CD8⁺ y γδ que las vacas subclínicas en PBMC recién aislados (65). Además, en otro estudio, se detectaron porcentajes más altos de linfocitos T y B γδ y una disminución de CD4⁺ en los tejidos de ovejas infectadas durante la infección experimental de Early Map (10). Con respecto al efecto de la vacunación, se ha informado de que la infección de las ovejas vacunadas con Gudair^® con Map conduce a una disminución en las proporciones de linfocitos periféricos CD4⁺ y B a los 13 días posteriores al desafío evaluados en PBMC estimulados por el mapa in vitro, pero esto no se evaluó en células no estimuladas y recién aisladas (22). Por el contrario, no se detectaron cambios en la proporción relativa de linfocitos T periféricos (CD4⁺, CD8⁺, γδ y CD3⁺) o linfocitos B (CD20⁺ y CD21⁺) en PBMC recién aislados entre cualquier grupo en este estudio. Además, se estimaron diferencias en la proporción relativa de tejido de subpoblaciones de linfocitos, pero no se observó una relación clara entre estos resultados y la vacunación/inmunización y/o infección, probablemente debido a la alta variabilidad individual dentro de los grupos probados. Del mismo modo, no se observó ninguna relación entre la producción local de IFN-γ y el desarrollo de lesiones, ya sea en VSI u otros grupos infectados. En este sentido, solo los parches Peyer y el ganglio linfático mesentér del grupo NVI produjeron una producción de IFN-γ ligeramente más alta. Este resultado es consistente con el mayor número de granulomas detectados en este grupo, ya que un mayor número de lesiones granulomatosis se han relacionado con un mayor número de células inmunoetiquetadas IFN-γ (6) y es probable que las lesiones presentes en los grupos infectados restantes no sean suficientes para generar una respuesta inmune local mediada por células sustancial en respuesta a Por lo tanto, ni las respuestas inmunitarias celulares y humorales periféricas ni la evaluación de la proporción relativa de subpoblaciones de linfocitos en la sangre y los tejidos enteros ni la producción local de IFN-γ pudieron predecir a los animales que permanecen desprotegidos temprano después de la infección. Además, se ha demostrado que la vacunación reduce el número de bacterias excretadas tanto en el campo como en condiciones experimentales (17, 21, 37, 66). En este estudio, el mapa no se aisló en las heces de ninguna cabra. Se ha detectado una mayor eliminación de mapas en relación con el desarrollo de lesiones graves y signos clínicos en animales infectados de forma natural y experimental (67, 68), aunque podría detectarse de forma intermitente en animales con paratuberculosis subclínica (53, 69). Sin embargo, las heces se recogieron solo en sacrificio (145 días después de la infección), por lo que la presencia de Map podría haberse subestimado debido al corto tiempo posterior al desafío y al tiempo limitado muestreado. Además, se ha observado que la excrementación fecal se asocia con frecuencia con animales con un alto número de tejidos positivos para el cultivo y lesiones graves (70). Además, el bajo número de tejidos Map-positivos detectados por cultivo bacteriológico o qPCR (7 de 35 cabras infectadas) no fue sorprendente, ya que en varios trabajos anteriores, ya sea en casos naturales o experimentales (46, 71), se ha demostrado que la carga bacteriana en animales con lesiones similares a las encontradas en este estudio estaba ausente o era muy baja.

Curiosamente, solo una cabra del grupo VHI desarrolló lesiones granulomatosas de paratuberculosis, aunque clasificadas como b multifocal, lo que muestra la eficacia de la protección heteróloga que confiere la vacunación contra la tuberculosis contra la infección de Map. Al igual que la vacunación homóloga, los grupos vacunados por HIMB (es decir, VH y VHI) mostraron una producción significativa de IFN-γ y anticuerpos como se describió anteriormente en cabras (66, 72), incluso cuando la sangre se estimuló con PPDa. Además, también se observó un aumento en la producción de IFN-γ en cabras vacunadas por vía subcutánea con la vacuna HIMB y desafiadas por endobronquialmente con una micobacteria estrechamente relacionada (M. caprae) en condiciones experimentales (66), lo que demuestra una vez más que la elevación de estas respuestas no garantiza el éxito de la vacunación El efecto de protección cruzada relacionado con la vacunación se ha reportado previamente, ya que se observó una reducción de las lesiones pulmonares en cabras vacunadas con paratuberculosis (32) o terneros (33) infectados endobronquialmente con M. caprae o Mbv, respectivamente. Además, a pesar de este efecto beneficioso, se notó una reacción cruzada contra los antígenos micobacterianos estándar en el ensayo de liberación IFN-γ y en la determinación de anticuerpos específicos del mapa y implicó una desventaja relevante para la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DIVA) (31). Esta reacción cruzada se ha descrito previamente en respuesta a los antígenos micobacterianos PPDa y PPDb, aunque generalmente esta producción está sesgada hacia el antígeno relacionado con la estimulación homóloga (73–75). Es notable que se detectaran anticuerpos específicos contra Mbv solo en el grupo VHI y, durante un corto tiempo, en el grupo VH, mientras que se encontraron fácilmente anticuerpos específicos contra Map no solo en el grupo VSI, sino también en los grupos VS, VH y VHI. Los avances recientes en la evaluación de las proteínas recombinantes para las pruebas serológicas de Mbv, como la utilizada aquí (MBP83), han hecho posible minimizar la reacción cruzada inducida por la vacunación contra la paratuberculosis en el diagnóstico de tuberculosis (38, 76). Por lo tanto, el desarrollo y el uso/implementación de antígenos más específicos (reactivos DIVA) tanto para el ensayo IFN-γ como para la detección de anticuerpos son necesarios para mejorar el diagnóstico inmunológico de la paratuberculosis y la tuberculosis y para superar las interferencias producidas por la vacunación (31).

Al abordar el efecto de las cepas inactivadas de Silirum^® y HIMB individualmente, se observó que las cabras de StrSI y StrHI mostraban un mayor número de lesiones granulomatosas que afectaban a un mayor número de animales que las de los grupos VSI o VHI. Además, a pesar de que el número de granulomas era menor que el de las cabras NVI, estos también se clasificaron como b multifocal, lo que demuestra la progresión de la infección en estos grupos. En cuanto a las respuestas inmunitarias periféricas, solo el grupo StrHI mostró altos niveles periféricos de IFN-γ en respuesta a ambos antígenos micobacterianos, pero no a la producción de anticuerpos periféricos, lo que podría sugerir la capacidad de esta cepa para estimular solo la respuesta inmune celular periférica. En este sentido, en un estudio realizado en ganado, la administración oral de la cepa Mbv 1403 inactivada suspendida en PBS no mostró un aumento de la producción de IFN-γ en respuesta al antígeno bovino, mientras que la inmunización parenteral con esta cepa homogeneizada en el adyuvante MontanideTM ISA 50 V 2 (vacuNA IMB) mostró una elevación Por el contrario, no se detectaron respuestas inmunes celulares periféricas o humorales evidentes en el grupo StrSI, aunque IFN-γ aumentó a 150 dpv. En este sentido, es factible que este aumento tardío fuera el efecto de la infección de Map en lugar de la inmunización en sí, ya que los animales con la respuesta inmune periférica mediada por células más alta correspondían a aquellos con las lesiones granulomatosas más numerosas (datos no mostrados). Por lo tanto, esta limitada respuesta inmune periférica provocada por las bacterias inactivadas podría ser una consecuencia de su débil inmunogenicidad en ausencia de adyuvantes (78, 79).

Además, la inmunización con adyuvantes (es decir, AdjSI y AdjHI) en ausencia de antígenos bacterianos dio lugar a un menor número de lesiones granulomatosas que en el grupo StrSI, StrHI o incluso NVI. Además, estas lesiones se clasificaron principalmente como a focal y multifocal, con solo un animal del AdjSI desarrollando lesiones b multifocales. En este sentido, no se detectaron respuestas inmunes celulares o humorales periféricas significativas en los grupos inmunizados adyuvantes. Esto está de acuerdo con un estudio anterior en el que no se registró una respuesta inmune periférica específica en los terneros inmunizados adyuvantes de MontanideTM ISA 50 V 2 (80). Sin embargo, solo AdjSI mostró un aumento posterior en la respuesta periférica IFN-γ (150 dpv) y anticuerpos específicos de Map (190 dpv) posiblemente asociados con la presencia de lesiones multifocales a y b en contraste con AdjHI que mostraron principalmente lesiones focales similares al grupo VSI, aunque el efecto principal de los adyuvantes no se pudo evaluar debido Esto es similar al aumento posterior observado en StrSI, StrHI y NVI, en los que también se detectaron lesiones b multifocales. Por lo tanto, es posible que el mayor número y extensión de las lesiones en estos grupos estuvieran correlacionados con una mayor respuesta de los linfocitos sensibilizados que podrían haber migrado del intestino a la sangre, como se sostó anteriormente (6).

El papel principal de los adyuvantes de aceite mineral en la vacunación es aumentar la respuesta inmune a través de la liberación sostenida del antígeno en el lugar de la inyección, asegurando la estimulación constante de la respuesta inmune (78). Los adyuvantes de MontanideTM, tal como se utilizan aquí, provocan un liposoma que protege el antígeno inactivado de la degradación, lo que lo impulsa a drenar los ganglios linfáticos a través del reclutamiento de células y linfocitos que presentan antígenos (79). Sin embargo, se han notificado diferencias en los perfiles de respuesta inmune dependiendo del tipo de adyuvante de MontanideTM (25, 81, 82). Por ejemplo, las respuestas de anticuerpos IFN-γ específicas del antígeno y de anticuerpos específicas de Map provocadas por la vacunación de ovejas con cepa Map 316F de muerte por calor combinada con MontanideTM ISA 50 V 2 fueron más bajas que las provocadas por la vacunación con la vacuna comercial Gudair^® (MontanideTM ISA 103 y 80) (25). Sin embargo, estas diferencias podrían estar relacionadas con la composición de los adyuvantes (tipo de ácidos grasos o emulsionante) y la intensidad de la respuesta inflamatoria en el lugar de la inyección, y a pesar de su importancia en la formulación de la vacuna, su interacción primaria con la respuesta inmune del huésped aún no se entiende completamente, ya que su efecto a menudo se estudia en Por esa razón, a pesar de la ausencia de diferencias estadísticas debido a la alta variabilidad individual, es sorprendente que el número y la gravedad limitados de las lesiones granulomatosas en los grupos AdjSI y AdjHI sin la liberación de un antígeno fueron bastante similares a los observados en los grupos VSI y VHI. En un estudio realizado en terneros, solo dos de los seis terneros inmunizados con MontanideTM ISA 50 V 2 mostraron un cultivo Mbv positivo en los ganglios preescapulares derecho después del desafío intranodular de Mbv (80), lo que sugiere que el adyuvante podría limitar, en cierta medida, la propagación de la infección. Se sabe que la aplicación de adyuvantes de agua en aceite mostró un claro efecto estimulante sobre la respuesta inmune del huésped antes de la inmunización con un antígeno (27). Sin embargo, en ausencia de una clara respuesta inmune periférica o local específica, es tentador plantear la hipótesis de que esta respuesta inmune protectora podría estar mediada por mecanismos inespecíficos que podrían ayudar al huésped a controlar la infección micobacteriana. Este mecanismo es desconocido, pero otras células inmunes, como las células presentadoras de antígenos (es decir, macrófagos, células dendríticas) podrían estar mediando en esta respuesta, ya que se reclutan en el sitio de inoculación (26) y posiblemente se están activando debido a la respuesta inflamatoria. De hecho, se ha planteado la hipótesis de que estas células pueden estar involucradas en el desarrollo de una respuesta inmune «entrenada» caracterizada por su respuesta aumentada y no específica después de la reinfección independientemente de la respuesta inmune adaptativa de la memoria (83).

En conjunto, este estudio ha evaluado los perfiles inmunológicos de dos vacunas inactivadas por calor contra la paratuberculosis y la tuberculosis antes y después del desafío de Map. Nuestros resultados destacaron el hecho de que los predictores como la respuesta periférica y local de IFN-γ, la producción de anticuerpos periféricos y la evaluación periférica y local de las subpoblaciones de linfocitos no pueden evaluar el resultado de la vacunación que solo se evalúa eficazmente mediante la evaluación de las lesiones microscópicas que ha demostrado ser un método eficaz para estimar el estado de la Sin embargo, tanto la vacunación homóloga como la vacunación heteróloga pudieron conferir una alta respuesta inmune protectora contra la infección de Map, limitando la progresión de las lesiones granulomatosas y demostrando además el beneficio potencial de la vacunación contra la tuberculosis en el control de la paratuberculosis. En este sentido, se necesitan más estudios centrados en la reducción de las interferencias en las pruebas serológicas utilizadas para el diagnóstico de paratuberculosis y tuberculosis, posiblemente dirigidos a rutas de vacunación alternativas o diferentes adyuvantes utilizados. Además, se observó un efecto interesante en la reducción del número y la gravedad de las lesiones granulomatosas de paratuberculosis en grupos inmunizados con adyuvantes de aceite mineral altamente refinado. Por lo tanto, se necesitan más estudios para evaluar el efecto de cada componente de la vacuna que podría estar involucrado en la protección contra las micobacterias.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos en bruto que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración de ética

El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Subcomité de Experimentos y Bienestar Animal de la Universidad de León (ULE) (OEBA-ULE-016-2017).

Contribuciones del autor

VP, JB, DG-E y NA-V diseñaron y llevaron a cabo el experimento. JE ayudó en el análisis estadístico. VP, JB, DG-E, NA-V, RV y MF participaron en las necropsias, así como en la recolección y análisis de muestras de sangre y tejido. La preparación de la vacuna Map inoculum y HIMB fue realizada por NE y IS que, junto con NA-V, participaron en el análisis bacteriológico. El manuscrito fue escrito por VP, JB, DG-E y NA-V. La versión final presentada fue leída y aprobada por todos los autores.

Financiación

Este trabajo fue apoyado financieramente por el Ministerio de Ciencia e Innovación de España (proyectos AGL2015-66540-C2-1-R y RTI2018-099496-B-I00), la Junta de Castilla y León (proyecto LE259P18) y el Instituto Nacional de Investigación Agronómica (proyecto RTA 2017-00089-00-00). NA-V recibió un contrato predoctoral (BES-2016-076513) del Ministerio de Ciencia e Innovación de España y DG-E y JE de un contrato postdoctoral del Ministerio de Ciencia e Innovación (subvenciones no. FJCI-2017-32020 y FJC2019-042422-I respectivamente).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias al personal del Instituto de Ganadería de Montaña (CSIC-ULE) por la entrega de los animales de experimentación. También agradecemos a CZ Vaccines por proporcionar los productos de inmunización utilizados en el estudio. Además, deseamos dar las gracias al personal del laboratorio de técnicas instrumentales de la Universidad de León y a la ayuda técnica de Carmen Agudín, Marta Silva, María Teresa Carro, Elena Molina y Ainara Badiola.

Material complementario

El material complementario de este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2021.744568/full#supplementary-material

Referencias