La ausencia de luxS reduce la invasión de Avibacterium paragallinarum, pero no es esencial para la virulencia
La ausencia de luxS reduce la invasión de Avibacterium paragallinarum, pero no es esencial para la virulencia
Donghai Li1,2Caiyun Huo2
Guiping Li2Menghan Zhu2Fuzhou Xu2Jian Qiao1
Sol de Huiling2*- 1Departamento de Fisiopatología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Agrícola de China, Pekín (China)
- número arábigoLaboratorio Clave de Beijing para la Prevención y el Control de Enfermedades Infecciosas en el Ganado y las Aves de Corral, Instituto de Ganadería y Medicina Veterinaria, Academia de Ciencias Agrícolas y Forestales de Beijing, Beijing (China)
El patógeno respiratorio contagioso, Avibacterium paragallinarum, contribuye a la coriza infecciosa en las aves de corral. Sin embargo, las vacunas comerciales no han demostrado una protección perfecta contra la coriza infecciosa. Para buscar un enfoque alternativo, esta investigación tuvo como objetivo investigar si el sistema de detección de quórum de patógenos juega un papel crucial en su supervivencia y patogenicidad. El sistema de detección de quórum LuxS/AI-2 en muchas bacterias Gram-negativas y Gram-positivas detecta cambios ambientales para regular los rasgos fisiológicos y las propiedades virulentas, y el papel del gen luxS en Av. paragallinarum sigue sin estar claro. Para investigar el efecto del gen luxS en el sistema de detección de quórum de Av. paragallinarum, construimos un mutante luxS. El análisis de bioluminiscencia indicó que el gen luxS desempeña un papel vital en el sistema de detección de quórum LuxS/AI-2. El análisis de los genes relacionados con el sistema LuxS/AI-2 mostró que el nivel de ARNm pfs aumentó significativamente en la cepa mutante; sin embargo, los niveles de ARNm de lsrR, lsrK y lsrB no fueron significativamente diferentes en comparación con el tipo salvaje. La capacidad de la cepa mutante luxS para invadir las células HD11 y DF-1 disminuyó significativamente en comparación con la cepa de tipo salvaje. Además, todos los pollos desafiados con varias dosis de la cepa mutante luxS desarrollaron infecciones y síntomas, y aquellos desafiados con la dosis más baja mostraron solo diferencias menores en comparación con los pollos desafiados con la cepa de tipo salvaje. Por lo tanto, la deleción del gen luxS reduce la invasión, pero el gen luxS no juega un papel esencial en la patogénesis de A. paragallinarum.
1 Introducción
Avibacterium paragallinarum, miembro de la familia bacteriana Pasteurellaceae, es el agente etiológico de la coriza infecciosa, una enfermedad respiratoria altamente contagiosa en gallinas ponedoras (1, 2). Hinchazón facial, conjuntivitis, secreción nasal, diarrea y anorexia son los principales síntomas clínicos (3). La coriza infecciosa causa graves disminuciones en la producción de huevos y enormes pérdidas económicas para la industria avícola en todo el mundo (4). Muchos de los microorganismos que residen en las vías respiratorias son beneficiosos para el desarrollo normal y la fisiología del huésped (5), y las bacterias con funciones terapéuticas programadas son ahora una realidad tangible (6). Por lo tanto, las interacciones entre microbios presentan posibilidades para nuevas estrategias para tratar y prevenir enfermedades infecciosas.
La detección de quórum es un sistema de comunicación de célula a célula mediante el cual las bacterias detectan su densidad de población y otras especies bacterianas a través de autoinductores (IA) para regular funciones (7). Muchas bacterias Gram-negativas producen moléculas de señalización de N-acil homoserina lactona, y la mayoría de las bacterias Gram-positivas utilizan péptidos modificados como moléculas señalizadoras. Sin embargo, la enzima LuxS, que sintetiza la molécula de señalización, AI-2, es la única vía de detección de quórum tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas (8). Muchos patógenos utilizan LuxS para ejercer el control de AI-2 sobre importantes factores de virulencia y vías metabólicas esenciales en los patógenos, como la síntesis de metionina y la producción de furanona (7).
LuxS es una enzima importante en el ciclo de metilo activado, que es un medio para metilar componentes celulares y reciclar ciertos aminoácidos que contienen azufre en bacterias, arqueas y eucariotas. Un componente del ciclo de metilo activado, la S-adenosil-l-homocisteína, es desintoxicada a S-ribosil-homocisteína por la enzima Pfs, 5′-metiltioadenosina/s-adenosilhomocisteína nucleosidasa. La S-ribosil-homocisteína, un sustrato de LuxS, se cataboliza a homocisteína y 4,5-dihidroxi-2,3-pentanodiona (el precursor de AI-2) (9, 10). En S. typhimurium y E. coli, AI-2 es reconocida y unida por la proteína LsrB, y luego la AI-2 es fosforilada por LsrK (11, 12). La forma fosforilada de AI-2 induce la transcripción de lsr, y el proceso se lleva a cabo uniéndose a LsrR, el represor del operón lsr (13). El sistema de detección de quórum LuxS/AI-2 está presente en muchas cepas de Pasteurellaceae, y el sistema está asociado con biopelículas bacterianas, adhesión celular, motilidad y virulencia (14-17). Sin embargo, se desconoce el papel del LuxS en Av. paragallinarum.
La participación de LuxS tanto en el sistema de detección de quórum como en el ciclo de metilo activado implica que es importante estudiar la función de LuxS en la patogenicidad in vivo de Av. paragallinarum. Aquí, construimos un mutante de deleción luxS de Av. paragallinarum para investigar la actividad de LuxS/AI-2. También determinamos diferencias en la expresión de genes relacionados con la detección de quórum entre la cepa de tipo salvaje y la cepa mutante. Además, se evaluó la adherencia bacteriana y la invasión en el mutante knockout luxS. Finalmente, se realizó un análisis de patogenicidad de la cepa mutante luxS.
2 Materiales y métodos
2.1 Cepas bacterianas, cebadores y condiciones de cultivo
En 2018 se aisló en China un aislado clínico de la cepa 3005 de Av. paragallinarum (serogrupo C) (18). Las cepas silvestres, mutantes y complementarias se cultivaron en caldo de soja tríptico o medio de agar de soja tríptico suplementado con suero de pollo al 10% y nicotinamida dinucleótido de adenina (NAD) al 0,0025% a 37 °C, y las placas de agar se cultivaron bajo un 5% de dióxido de carbono. Las cepas BB170 y BB152 de Vibrio harveyi fueron suministradas por el profesor Han (Academia China de Ciencias Agrícolas, Shanghai, China) y cultivadas en un medio de bioensayo (AB) autoinductor modificado a 30 °C (19). Escherichia coli DH5α y BL21 (DE3) (Vazyme, Nanjing, China) se cultivaron de forma rutinaria en caldo Lennox o en un medio sólido que contenía agar al 1,5% a 37 °C. Todos los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1.
2.2 La expresión de LuxS y la producción de LuxS antisuero
Se utilizaron los cebadores pET32a-luxS-F/R y luxS-pET32a-F/R para amplificar el fragmento luxS de la cepa 3005 de Av. paragallinarum y el vector de expresión de pET-32a, respectivamente. Los productos de PCR se utilizaron para construir el plásmido de expresión pET32a-luxS utilizando el kit de clonación Hieff Clone® Plus One Step (Yeasen, Shanghái, China). Escherichia coli BL21 (DE3) transformado con el plásmido pET32a-luxS se utilizó para expresar la proteína LuxS recombinante (His-LuxS). His-LuxS se purificó utilizando un kit de purificación de proteínas marcado con His (CWbio, Jiangsu, China) y se analizó mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western blot (22).
La proteína His-LuxS se mezcló con ‘QuickAntibody’, un adyuvante inmunitario soluble en agua (Biodragon, Pekín, China), para preparar antisuero para ratones. La proteína His-LuxS se diluyó a 1 mg/mL, y luego 50 μL de proteína se mezclaron rápidamente con el adyuvante inmune en una proporción de 1:1. Seis ratones machos BALB/c fueron inmunizados subcutáneamente con la mezcla a una dosis de 50 μg/ratón dos veces, con un intervalo de 14 días. Se extrajo sangre de la vena de la cola y se evaluaron los títulos de suero inmune mediante ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA). Los ratones con altos títulos de anticuerpos fueron sacrificados en jaulas con un 30% de CO2 y se recolectaron sus sueros.
2.3 Construcción de cepas mutantes y complementarias luxS
Un fragmento formado por el gen luxS y luxS aguas arriba y luxS aguas abajo se amplificó a partir de la cepa 3005 de Av. paragallinarum utilizando cebadores luxS-UF/luxS-UR y se clonó en el vector T pMD19 (Takara, Dalian, China). A continuación, el fragmento se insertó en el vector pGEM-T® Easy utilizando los sitios de la enzima de restricción HindIII y EcoRI. El gen luxS del vector pGEM-T® Easy obtenido se sustituyó por un casete de cloranfenicol para generar el plásmido recombinante. El plásmido recombinante fue introducido en Av. paragallinarum por electroporación (23). Brevemente, Av. paragallinarum de tipo silvestre se lavó tres veces con 9,3% (peso/vol) de sacarosa fría, y 65 μL de alícuotas se mezclaron con plásmido recombinante (0,5 μg) y se transfirieron a cubetas de electroporación preenfriadas (tamaño de espacio, 1 mm). Después de la electrotransformación, se seleccionó la cepa positiva en agar de soja tríptico que contenía 10 μg/mL de cloranfenicol.
La cepa complementada se construyó utilizando el vector pBBR1MCS-2 como se describe, con una modificación simple para la construcción del mutante luxS. El gen luxS se amplificó utilizando cebadores luxS-F/luxS-R y luego se clonó en el vector T pMD19. SalA continuación, se utilizaron enzimas de restricción I y XbaI en el vector T pMD19 y pBBR1MCS-2 para establecer el plásmido complementado. El plásmido se introdujo en la cepa mutante luxS por electrotransformación, y se utilizaron 50 μg/mL de kanamicina para seleccionar la cepa complementaria.
La complementación se verificó mediante el análisis de electroforesis en gel de agarosa del gen luxS utilizando cebadores luxS-F/R, el casete de cloranfenicol utilizando cebadores CM-F/R (20) y el fragmento total utilizando cebadores luxS-UF/luxS-UR. La deleción de la proteína LuxS se confirmó mediante el análisis de Western blot.
2.4 Ensayo de bioluminiscencia AI-2
El ensayo se realizó esencialmente como se describió anteriormente, con modificación (24). En resumen, la bacteria de prueba de Av. paragallinarum (cepa salvaje, mutante y cepa complementaria) se cultivó en placas de agar tríptico de soja y luego se lavó con el medio AB. El medio lavado y las cepas BB152 de Vibrio harveyi en la fase logarítmica de crecimiento se centrifugaron a 12.000 g durante 5 min, y los sobrenadantes se recogieron y filtraron a través de un filtro de 0,22 μm (Millipore, Billerica, USA). La cepa reportera V. harveyi BB170 se cultivó en un agitador orbital durante 16 h a 30°C. A continuación, la suspensión cultivada se diluyó 1:5.000 en medio AB fresco. En total, se mezclaron 20 μL de fluido filtrado con 180 μL de BB170 diluido en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (Corning, Nueva York, EE. UU.), seguido de agitación a 30 °C, 180 rpm durante 6 h. En particular, se utilizó un fluido filtrado de V. harveyi BB152 al 10% (v/v) como control positivo, y un 10% (v/v) de PBS estéril (0,01 M, pH = 7,4) como control negativo. La luminiscencia se midió cada hora utilizando un lector de microplacas Synergy H1 (BioTeK SYNERGY H1, Vermont, EE. UU.).
2.5 Detección de ARNm de genes de detección de quórum relacionados
El ARN total se extrajo de las bacterias utilizando un kit de purificación de ARN GenJET (Thermo, Waltham, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante y se confirmó mediante un espectrofotómetro NanoDrop1000 (NanoDrop Technologies Inc., Waltham, EE. UU.). Se utilizaron muestras de ARN con una relación de 260/280 nm entre 1,9 y 2,1 para sintetizar ADNc utilizando un kit EasyScript First-Strand, Synthesis cDNA SuperMix (Trans, Pekín, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de ADNc se almacenaron a -20 °C para su uso posterior.
La PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) se realizó utilizando la premezcla SYBR Green SuperReal plus (Tiangen, Pekín, China). Los volúmenes totales de muestra de 25 μL contenían 12,5 μL de mezcla PCR Master, 1 μL de ADN (o agua como control negativo), 0,5 μL de cebador directo/revés y 10,5 μL de agua. Cada reacción se realizó por triplicado. Para medir los genes de detección de quórum relacionados, incluidos pfs, lsrR, lsrB, lsrK y rpoB (como control de limpieza) (21), se realizaron RT-qPCR con un paso inicial de desnaturalización de 95 °C durante 15 min, seguido de 40 ciclos a 95 °C durante 10 s y 55 °C durante 30 s en un Bio-Rad IQ5 (Bio-Rad, Hercules, EE. UU.) (21, 25 de la Constitución).
2.6 Ensayos de adherencia e invasión bacteriana
Los efectos del gen Av. paragallinarum luxS sobre la adhesión e invasión celular se evaluaron en ensayos con células de macrófagos de pollo (HD11, este laboratorio) y fibroblastos de embrión de pollo (DF-1, este laboratorio) siguiendo un método descrito anteriormente (26). Brevemente, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 24 pocillos con una confluencia del 90%. Los pocillos se lavaron tres veces con PBS y se infectaron con Av. paragallinarum (1 × 107 UFC/pocillo) o su mutante luxS (1 × 107 UFC/pocillo) en medio DMEM/F12 que contenía 10% (v/v) de suero fetal bovino para cultivos HD11 y medio DMEM que contenía 10% (v/v) de suero fetal bovino para cultivos DF-1. Después de la incubación a 37 °C en CO2 al 5% durante 1 h, las células se lavaron rigurosamente con PBS tres veces para eliminar las bacterias no adherentes y luego se incubaron con 100 μL de tripsina al 0,25% / EDTA que contenía Triton X-100 al 0,5% durante 10 min. La suspensión celular resultante se diluyó en serie 10 veces con PBS y se dispersó en placas de agar de soja tríptica que contenían NAD y suero de pollo. Por último, se contó el número de bacterias adheridas.
Para evaluar el efecto del gen Av. paragallinarum luxS sobre la invasión celular, se realizaron cultivos celulares e infección como se describe para el ensayo de adherencia bacteriana. Las células infectadas se incubaron durante 3 h y 6 h. Después del lavado con PBS tres veces, se añadieron 100 μg/mL de cefalexina y 50 μg/mL de kanamicina a cada pocillo y se incubaron a 37 °C en 5% de CO2 durante 3 h para matar las bacterias extracelulares. A continuación, los pocillos se trataron con 100 μL de tripsina al 0,25%/EDTA que contenía Triton X-100 al 0,5% durante 10 min, y las bacterias invadidas se contaron en placas de agar tríptico de soja que contenían NAD y suero de pollo. Los ensayos se realizaron para todos los grupos de tratamiento por duplicado tres veces.
2.7 Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Se utilizó TEM para visualizar la invasión in vitro de células por Av. paragallinarum de tipo salvaje y mutante luxS. Las células DF-1 y HD11 se cultivaron en placas de cultivo (10 cm de diámetro). El cultivo celular y la infección se realizaron como se describe para el ensayo de invasión bacteriana. Después de la infección por patógenos durante 6 h y el tratamiento antibiótico durante 3 h, las placas de cultivo se lavaron con PBS tres veces. A continuación, las células se rasparon del fondo de las placas con un raspador de células y se recogieron en tubos de centrífuga estériles de 1,5 ml. Las células colectadas se fijaron con 1 mL de solución fijadora (glutaraldehído al 2,5%) durante 48 h. A continuación, se hicieron cortes ultrafinos y se tiñeron con acetato de uranilo al 0,1% y citrato de plomo al 0,1% para microscopía electrónica de transmisión (Hitachi H-7500, Chiyoda, Japón).
2.8 Desafíos animales
Para evaluar los posibles cambios en la virulencia asociados con la alteración del gen luxS, se utilizaron ejemplares salvajes y mutantes de Av. paragallinarum en modelos de pollo (27). Llevamos a cabo los experimentos con animales en estricta conformidad con los requisitos de los Requisitos de Animales de Laboratorio del Medio Ambiente y las Instalaciones de Alojamiento (GB14925-2010, el Comité Técnico Nacional de Estandarización de Animales de Laboratorio) y las Regulaciones Chinas de las Directrices de Animales de Laboratorio (Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República Popular China). Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados y auditados por las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Academia de Ciencias Agrícolas y Forestales de Pekín [ID: SYXK (Jing) 2023–0005], que fueron aprobadas por el Comité de Bienestar Animal de la Academia de Ciencias Agrícolas y Forestales de Pekín (10 de enero de 2023). Los pollos White Leghorn machos de cinco semanas de edad libres de patógenos específicos se dividieron aleatoriamente en siete grupos experimentales (n = 6 por grupo). La cepa mutante luxS y la cepa silvestre infectaron a tres grupos de pollos con dosis de 1,5 × 105 UFC, 1,5 × 104 UFC y 1,5 ×10 3 UFC, respectivamente. Cada ave fue desafiada por la inoculación del seno infraorbitario con 0,2 mL de bacterias diluidas. El grupo control fue tratado solo con PBS. Los signos clínicos de secreción nasal e hinchazón facial en los pollos desafiados se utilizaron para evaluar la morbilidad de los pollos. De acuerdo con un sistema de puntuación descrito anteriormente (28), 0 no representa signos clínicos; 1 representa signos clínicos leves (ligera hinchazón facial); 2 representa signos clínicos moderados (hinchazón facial moderada y secreción nasal); y 3 representa signos clínicos graves (hinchazón facial severa, hinchazón nasal abundante, lagrimeo y ojo parcial o completamente cerrado).
3 Resultados
3.1 Preparación del antisuero anti-LuxS para ratones
Clonamos el gen luxS en pET32a y expresamos con éxito una proteína de fusión recombinante His-LuxS en E. coli BL21. La proteína purificada fue una banda distinta en el análisis SDS-PAGE (Figura 1A). Se utilizó el anticuerpo A His para confirmar la etiqueta His en la proteína purificada mediante análisis de Western blot (Figura 1B). Se evaluó un antisuero anti-LuxS de ratón diluido 10.000 veces mediante ELISA y el título de anticuerpos OD450 > 1,0.
3.2 Construcción y verificación de la cepa mutante LuxS
La deleción del gen luxS y la complementación del gen luxS se confirmaron mediante PCR (Figura 2A) utilizando cebadores luxS-F/R. El gen luxS fue reemplazado por un casete de cloranfenicol; por lo tanto, el casete de cloranfenicol en los mutantes luxS se identificó por PCR utilizando cebadores CM-F/R (Figura 2B). Para asegurarse de que el sitio de mutación era correcto, los fragmentos se amplificaron a partir de cepas de tipo salvaje y mutantes (Figura 2C). El tamaño previsto de la proteína LuxS es de 17 kDa. La deleción de la proteína LuxS se confirmó mediante Western blot, sin mostrar banda en 17 kDa de la cepa mutante (Figura 2D).
3.3 Detección de la actividad de AI-2 y expresión de genes de detección de quórum relacionados
Se midieron los sobrenadantes de prueba de los lavados medios AB de las placas de césped de Av. paragallinarum (cepa silvestre, mutante y cepa complementada), y hubo una caída significativa de la actividad de AI-2 en el mutante luxS, y la actividad se recuperó con éxito en la cepa complementada (Figura 3). Los resultados indicaron que LuxS es necesario para la producción de AI-2 en Av. paragallinarum.
Además, la qPCR en tiempo real no mostró diferencias significativas en los niveles de ARNm de los genes de detección de quórum relacionados, lsrR, lsrB y lsrK, entre la cepa de tipo salvaje, la cepa mutante y la cepa complementaria. Sin embargo, el nivel de ARNm del gen pfs aumentó notablemente en la cepa mutante luxS en comparación con el tipo salvaje, y el nivel de ARNm de la cepa complementada se recuperó a un nivel similar al del tipo salvaje (Figura 4). Estos resultados indican que Av. paragallinarum LuxS es una enzima importante en el ciclo de metilo activado, pero puede no estar involucrada en el sistema convencional de detección de quórum LuxS/AI-2.
3.4 Patogenicidad de la cepa mutante LuxS
No hubo diferencias claras en la adherencia a las células HD11 y DF-1 entre el tipo salvaje y el mutante. Sin embargo, la deleción del gen luxS redujo significativamente la capacidad de invadir las células HD11 y DF-1 (Figura 5A). La invasión de Av. paragallinarum de las células DF-1 y HD11 por el tipo salvaje y el mutante se visualizó mediante TEM (Figura 5B).
Para evaluar el impacto del gen luxS en la virulencia de Av. paragallinarum in vivo, utilizamos una dosis de desafío relativamente baja para garantizar que se pudiera observar la virulencia de un nivel bajo de la cepa mutante. Los signos clínicos de coriza infecciosa se registraron entre los días 1 y 7 después de la infección. Los pollos infectados con cepas de tipo salvaje y mutantes a dosis de 1,5 × 105 UFC o 1,5 ×10 4 UFC mostraron secreción facial y nasal grave el día 1. Sin embargo, hubo algunas diferencias menores cuando la dosis de provocación fue de 1,5 × 103 UFC. Los pollos infectados con la cepa mutante mostraron síntomas clínicos el día 3 después del desafío, mientras que la cepa silvestre mostró síntomas el día 1 (Figura 6A). En comparación con la infección por cepas silvestres, los pollos infectados con la cepa mutante de la dosis más baja (1,5 × 103 UFC) mostraron manifestaciones clínicas más leves. Un pollo mostró una secreción nasal más leve, un pollo mostró hinchazón facial moderada y cuatro de cada seis pollos mostraron hinchazón facial y secreción nasal graves, los mismos signos clínicos que la cepa silvestre (Figura 6B). Estas pequeñas diferencias indican que el gen luxS no desempeña un papel esencial en la patogénesis de Avibacterium paragallinarum.
4 Discusión
LuxS está ampliamente distribuido entre las bacterias. Está involucrado en la producción de autoinductor (AI-2) y es un componente integral del ciclo de metilo activado en las bacterias (29). Un gran número de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas están universalmente presentes en el LuxS, y AI-2 se considera una señal de detección de quórum entre especies (30). La detección de quórum es un método de comunicación entre bacterias (30). En el mismo entorno, intercambian información compleja y precisa liberando y recibiendo diminutas moléculas químicas como señales. En el estudio anterior, LuxS se asoció con muchas características de virulencia, incluida la formación de biopelículas, la producción de toxinas, la adherencia, la motilidad y la respuesta al estrés, además de estar involucrado en metabolismos como el metabolismo del hierro, el azufre y el carbono (7). La familia de cepas de Pasteurellaceae Glaesserella parasuis, Haemophilus influenzae, Mannheimia haemolytica y Actinobacillus pleuropneumoniae existen en el sistema LuxS/AI-2, y el mutante luxS afectó la fisiología y virulencia de las cepas (14, 17, 31, 32). Como miembro de la familia Pasteurellaceae, el papel del LuxS en Av. paragallinarum sigue sin estar claro. Por lo tanto, el enfoque principal de este estudio es investigar si el LuxS afecta la patogenicidad de Av. paragallinarum, así como su impacto en la adhesión e invasión celular, y la regulación de otras moléculas relacionadas. Generamos la cepa mutante luxS y evaluamos su adhesión e invasión de células HD11 y DF-1, al tiempo que evaluamos su virulencia en pollos. Al igual que los estudios anteriores que mostraron que LuxS se asocia con la virulencia de patógenos, este estudio mostró síntomas clínicos tardíos y más leves entre los animales desafiados con la mutación de luxS Av. paragallinarum. Estos resultados indican que el LuxS puede no desempeñar un papel esencial en la infección por Av. paragallinarum.
En este estudio, se utilizaron diferentes cepas de Av. paragallinarum para construir el mutante luxS, incluidas las cepas estándar 221, 0222 y Modesto y el aislado 3005. Sin embargo, solo se obtuvieron 3005-ΔluxS. Anteriormente, se encontró la misma situación al construir el mutante HutZ de Av. paragallinarum, que está involucrado en la homeostasis del hierro en Av. paragallinarum (20). Parece que las diferentes cepas tenían diferentes probabilidades de mutación. Se utilizaron dos aislados y se construyeron los mutantes capsulares de Av. paragallinarum mediante la inactivación del gen hctA utilizando el sistema de knockout del gen TargeTronH (33). Además, para verificar la conservación del gen luxS en Av. paragallinarum, se seleccionaron varias secuencias del gen luxS de Av. paragallinarum y otras cepas de Pasteurellaceae de la base de datos del NCBI, y se realizó un análisis de homología. Un análisis filogenético muestra las relaciones genéticas entre Av. paragallinarum y otras cepas de Pasteurellaceae. La homología del gen luxS entre las cepas de referencia y los aislados locales de Av. paragallinarum es superior al 99% y oscila entre el 69 y el 78% con otras cepas de Pasteurellaceae (Figura suplementaria 1). Este análisis muestra que la secuencia del gen luxS está altamente conservada entre Av. paragallinarum. Por lo tanto, utilizamos la cepa 3,005 como representante para estudiar la función de LuxS. En el futuro, se utilizarán más cepas para verificar la diferencia en la tasa de mutación entre las cepas estándar y las cepas aisladas.
Las moléculas similares a AI-2 pueden ser detectadas en muchas especies bacterianas por la cepa reportera, V. harveyi BB170 (32, 34, 35). Ciertos componentes del caldo de soja tríptico pueden interferir con la actividad de AI-2 (19); por lo tanto, se utilizaron sobrenadantes de lavado medio AB de placas de césped de Av. paragallinarum en la detección de AI-2. El ensayo de detección de AI-2 mostró que el sistema LuxS/AI-2 existe en Av. paragallinarum y que LuxS es un gen clave en la síntesis de AI-2 porque el valor de luminiscencia del grupo de deleción de luxS era casi el mismo que el del control negativo. Además, algunos genes regulados están asociados con el reconocimiento y la modificación de AI-2; por lo tanto, evaluamos el efecto del mutante luxS en la transcripción de lsrB (el gen de la proteína de unión a AI-2) (11), lsrK (que codifica una quinasa responsable de la fosforilación de AI-2) (12) y lsrR (que codifica un represor para el operón lsr regulado por luxS) (13). Sin embargo, no hubo diferencias obvias en la transcripción de lsrB, lsrK y lsrR entre el tipo salvaje y el mutante luxS, lo que indica que los genes reportados para relacionarse con el reconocimiento y la modificación de moléculas de AI-2 pueden no ser aplicables a Av. paragallinarum. Además, dado que LuxS y Pfs son las dos únicas enzimas esenciales en la vía biosintética para AI-2 (9), el aumento significativo de la transcripción de pfs en el mutante luxS indica que LuxS puede desempeñar un papel importante en la vía del ciclo de metilo activado de Av. paragallinarum. En conjunto, estos hallazgos indican que LuxS desempeña un papel esencial en la producción de AI-2 en Av. paragallinarum y también puede estar involucrado en la vía del ciclo de metilo activado en Av. paragallinarum.
La deficiencia de luxS puede reducir la capacidad de algunas bacterias para sobrevivir en los macrófagos, lo que indica que luxS juega un papel importante en la evasión inmunológica después de la invasión (36, 37). Por lo tanto, evaluamos la capacidad de Av. paragallinarum de tipo salvaje y mutante luxS para invadir células HD11 y DF-1. Observamos que la deleción de luxS resultó en una disminución significativa de la invasión celular. Esto demostró que la ausencia de luxS puede disminuir la capacidad de Av. paragallinarum para sobrevivir en los macrófagos y que la deficiencia de luxS tiene un efecto adverso sobre la invasión del patógeno. La invasión bacteriana es un factor esencial en la infección bacteriana y la patogenicidad, sin embargo, el mecanismo por el cual LuxS afecta la invasión de Av. paragallinarum no está claro y se justifican estudios adicionales.
En conclusión, este estudio demostró que LuxS no solo puede estar asociado con el ciclo de metilo activado, sino que también está involucrado en la vía de detección de quórum AI-2 en Av. paragallinarum. Además, el mutante luxS muestra una capacidad invasiva significativamente disminuida, pero no es esencial para la virulencia de Av. paragallinarum. Investigaciones adicionales sobre el sistema de detección de quórum de patógenos pueden proporcionar nuevas estrategias terapéuticas para prevenir y controlar Av. paragallinarum en aves de corral.
Declaración de disponibilidad de datos
Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres de los repositorios y los números de acceso se pueden encontrar en el artículo/material complementario.
Declaración ética
El estudio en animales fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Academia de Ciencias Agrícolas y Forestales de Beijing. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales.
Contribuciones de los autores
DL: Curación de datos, Análisis formal, Metodología, Redacción – borrador original. CH: Curación de datos, Análisis formal, Obtención de fondos, Redacción – revisión y edición. GL: Investigación, Recursos, Redacción – borrador original. MZ: Investigación, Recursos, Escritura – borrador original. FX: Recursos, Escritura – borrador original. JQ: Conceptualización, Obtención de fondos, Supervisión, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. HS: Conceptualización, Obtención de fondos, Metodología, Supervisión, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición.
Financiación
El/los autor/es declara(n) haber recibido apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Esta investigación fue financiada por el Proyecto de Reforma y Desarrollo de la Academia de Ciencias Agrícolas y Forestales de Beijing (XMS202409), la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (6182010), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32102619) y el Fondo Asignado para el Equipo de Innovación de Pollos de Engorde de Hebei del Sistema de Investigación de Tecnología Agroindustrial Moderna (HBCT2018150101 y HBCT2018150207).
Reconocimientos
Los autores agradecen al Dr. Xiangan Han por proporcionar las cepas BB170 y BB152 de Vibrio harveyi.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Nota del editor
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Material complementario
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Palabras clave: detección de quórum, LuxS, autoinductor-2, Avibacterium paragallinarum, virulencia
Cita: Li D, Huo C, Li G, Zhu M, Xu F, Qiao J y Sun H (2024) La ausencia de luxS reduce la invasión de Avibacterium paragallinarum pero no es esencial para la virulencia. Frente. Vet. Sci. 11:1427966. doi: 10.3389/fvets.2024.1427966
Editado por:
Xiaorong Zhang, Universidad de Yangzhou, China
Revisado por:
Shaohui Wang, Academia China de Ciencias Agrícolas, China
Tang Fang, Universidad Agrícola de Nanjing, China
Patrick Blackall, Universidad de Queensland, Australia
Derechos de autor © 2024 Li, Huo, Li, Zhu, Xu, Qiao y Sun. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons Atribución (CC BY).
*Correspondencia: Sol de Huiling, sunhuiling01@163.com
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