La interleucina-7 mejora el desarrollo in vitro y la calidad de la blastocisto en embriones partenogenéticos porcinos
La interleucina-7 mejora el desarrollo in vitro y la calidad de la blastocisto en embriones partenogenéticos porcinos
Dongjin Oh1,2,
Hyerin Choi1,2,
Mirae Kim1,2,
Lian Cai1,2,3,
Joohyeong Lee1,2,
Ali Jawad1,2, Sohee Kim1,2, Haomiao Zheng1,2,
Gabsang Lee4, Yubyeol Jeon5* y
Sang-Hwan Hyun1,2,3*- 1Laboratorio de Embriología y Biotecnología Veterinaria (VETEMBIO), Centro Médico Veterinario y Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Chungbuk, Cheongju, Corea del Sur
- 2Instituto de Células Madre y Medicina Regenerativa (ISCRM), Universidad Nacional Chungbuk, Cheongju, Corea del Sur
- 3Escuela de posgrado de Bioseguridad y Protección Veterinaria, Universidad Nacional de Chungbuk, Cheongju, Corea del Sur
- 4Departamento de Neurología, Instituto de Ingeniería Celular, Facultad de Medicina, Johns Hopkins Medicine, Baltimore, ML, Estados Unidos
- 5Laboratorio de Teriogenología y Biotecnología Reproductiva, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional de Jeonbuk, Iksan, Corea del Sur
La interleucina-7 (IL-7), un factor vital que afecta al desarrollo, la proliferación y la supervivencia de las células, desempeña un papel importante en la maduración de los ovocitos. Sin embargo, su papel en el desarrollo embrionario sigue siendo desconocido. Por lo tanto, en este estudio, nuestro objetivo es investigar los efectos de la suplementación de IL-7 en el cultivo in vitro (IVC) de embriones porcinos después de la activación partenogenética (PA) en función de características como el escisión, la tasa de formación de blastocisto, el glutatión intracelular (GSH) y los niveles La inmunofluorescencia reveló que IL-7 y su receptor, IL-7Rα (IL-7R) se localizaron en el citoplasma de embriones parthenote porcinos. Al complementar el medio IVC (PZM5) con varias concentraciones de IL-7, se determinó una concentración óptima que mejoró el desarrollo embrionario, promovió la GSH intracelular y disminuyó los niveles de ROS en la etapa de escisión durante el EVC del embrión porcino. La investigación de los patrones de expresión del ARNm a través de qRT-PCR sugirió que IL-7 posiblemente regulaba el aclaramiento del ARNm materno y la activación del genoma zigótico. Además, la suplementación con IL-7 redujo la apoptosis de la blastocisto, mejoró la expresión del marcador de masa celular interna SOX2 y los niveles fosforilado de STAT5 en los blastocistos. Además, alteró los patrones de transcripción de los genes que regulan la apoptosis, la señalización de IL-7 y el desarrollo. Por lo tanto, demostramos la localización de IL-7 e IL-7R en embriones porcinos preimplantacional in vitro por primera vez. Además, sugerimos que la suplementación de IL-7 se puede emplear para mejorar el desarrollo embrionario y la calidad de la blastocisto basada en la activación de los transcripciones de los genes que participan en la competencia del desarrollo y la señalización de IL-7 durante el desarrollo del embrión porcino in vitro después de la AP.
Introducción
Las tecnologías reproductivas asistidas (TARC), como la fertilización in vitro (FIV) y la crioconservación embrionaria, facilitan la concepción en animales domésticos con problemas de fertilidad. La transferencia de embriones es el paso más crítico en la FIV, y su tasa de éxito depende de varios factores, incluida la calidad del embrión y la técnica utilizada (1). En la ganadería y la medicina veterinaria, la industria porcina es considerablemente importante, siendo la gestión de la productividad de los cerdos un aspecto clave en esta última categoría. Dado que la preservación de los recursos genéticos en los cerdos reproductores y el comercio internacional de embriones fertilizados se han vuelto activos, el uso de ART como el cultivo in vitro (IVC) y la crioconservación de embriones fertilizados derivados de cerdos reproductores ha aumentado rápidamente (2, 3).
Los cerdos sirven como modelos útiles en varias áreas de investigación, como la biotecnología reproductiva, la transgénesis y la biomedicina. También pueden servir como donantes de órganos adecuados en la medicina regenerativa y los modelos de enfermedades humanas debido a las similitudes genéticas, anatómicas y fisiológicas entre ellos y los humanos (4, 5). Por ejemplo, las células madre embrionarias (ESC) derivadas de blastocistos de cerdo son herramientas poderosas para estudios preliminares sobre enfermedades humanas (6), y para obtener ESC de blastocistos cultivados in vitro, la calidad de la blastocisto es un factor importante a tener en cuenta.
En varios estudios, se han añadido varios componentes, como antioxidantes, factores de crecimiento y hormonas, al medio de cultivo embrionario para aumentar la probabilidad de obtener embriones de alta calidad in vitro (7–9). Específicamente, las citocinas actúan como reguladores de la fisiología ovárica, creando un entorno embrionario inmuno-permissivo que fomenta la gametogénesis, la fertilización, el desarrollo embrionario temprano, la eclosión e implantación de blastocisto, y el crecimiento fetal (10-14). El papel reproductivo de las interleucinas (IL) como citocinas se ha demostrado en varios estudios. Por ejemplo, los IL como IL-1β, IL-6 e IL-8 interactúan con los ovocitos y sus células somáticas circundantes durante la folicuculogénesis (15). Aunque se han identificado varias familias de IL, sus funciones en el desarrollo embrionario aún no se han aclarado lo suficiente.
IL-7, que es miembro de la superfamilia IL-2, desempeña un papel esencial en la supervivencia y el desarrollo de las células T y B del sistema inmunitario (16). Además, se señala uniándose al complejo de receptores IL-7, que comprende IL-7Rα (IL-7R) y la cadena común del receptor de citoquinas γ (IL-2RG) (17). También regula las señales antiapoptóticas y proliferativas a través del transductor de señal de la quinasa Janus y el activador de las vías de transcripción (JAK-STAT) y la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K). Además, modula a los miembros de la familia del linfoma de células B 2 (BCL2) (18). En el sistema reproductivo, la IL-7 se ha detectado tanto en el líquido folicular humano (19, 20) como en el porcino (FF) (21), y se ha informado de sus funciones funcionales en los ovocitos y las células somáticas circundantes en varias especies (22). Además, se ha observado que el tratamiento con IL-7 modula la fosforilación de las proteínas AKT y STAT5 e inhibe la apoptosis en las células granulosas de rata (23). Sin embargo, el papel funcional de la IL-7 en el desarrollo embrionario de los animales domésticos sigue siendo desconocido y requiere una investigación adicional.
En el presente estudio, para aclarar el papel funcional de la IL-7 durante la IVC embrionaria, primero investigamos la presencia de proteínas IL-7 e IL-7R en embriones porcinos preimplantación a través de inmunoteñimiento. A partir de entonces, exploramos los efectos de la suplementación con IL-7 durante la IVC en el desarrollo embrionario, los niveles de glutatión intracelular (GSH), los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la apoptosis en embriones parthenote porcino cultivados in vitro. Los niveles de expresión de ARNm de genes específicos en la escisión derivadas de la activación partenogenética (PA) y los blastocistos tratados con IL-7 se examinaron mediante la reacción cuantitativa de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (qRT-PCR). Finalmente, la expresión del marcador de masa celular interna (ICM) (SOX2) y el STAT5 fosforilado (pSTAT5), que están relacionados con la señalización IL-7, se confirmó mediante inmunoteñido. Creemos que nuestro estudio aporta información importante que se puede utilizar para mejorar la calidad de la blastocisto porcino durante la IVC.
Materiales y métodos
Productos químicos y reactivos
El IL-7 humano recombinante se compró a PeproTech (Londres, Reino Unido). A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos y reactivos utilizados en este estudio se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).
Recopilación de ovocitos y maduración in vitro
Los ovarios porcinos se recogieron de un matadero local y se transportaron al laboratorio en 1 h en una solución de NaCl al 0,9 % (v/v) a 37 °C. En el laboratorio, los ovarios se lavaron dos veces con una solución de NaCl al 0,9 % (v/v) y, a continuación, se recuperaron los complejos cumulus-oocyte (COC) de folículos de tamaño mediano (3–7 mm de diámetro) (24) utilizando un 18 -aguja de calibre y una jeringa desechable de 10 ml y se recogieron en tubos cónicos de 15 ml. Los AOC se lavaron con medio Tyrode tamponado con HEPES que contenía alcohol polivinílico (TLH-PVA) al 0,05 % (p/v). Luego, se cultivaron de 50 a 60 COC con capas compactas de células de cúmulo y citoplasma granulado uniformemente en una placa de cuatro pocillos (Nunc, Roskilde y Dinamarca) que contenía 500 μL de medio IVM, que consistía en TCM-199 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE. EE. UU.) suplementado con cisteína 0,6 mM, piruvato de sodio 0,91 mM, factor de crecimiento epidérmico 10 ng/mL, kanamicina 75 μg/mL, insulina 1 μg/mL y FF porcino al 10 % (v/v). El proceso de IVM se llevó a cabo durante un período de 42 h. A esto le siguió la incubación de los AOC con 10 UI/mL de gonadotropina coriónica equina y 10 UI/mL de gonadotropina coriónica humana a 39 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 primero durante 22 h, después de lo cual los AOC se transfirieron a un medio IVM libre de hormonas y luego se incuba durante las 20 h restantes.
Activación partenogenética y cultivo in vitro de embriones porcinos
La PA se realizó de acuerdo con un protocolo reportado anteriormente (25). Brevemente, después de la IVM, se obtuvieron ovocitos en fase metafase II (MII) canalización mecánicamente que encierra las células cúmulo en presencia de 0,1% de hialuronidasa durante 1 minuto. Después de lavar dos veces con la solución de activación (280 mM de solución de manitol que contiene 0,01 mM de CaCl2 y 0,05 mM de MgCl2), los ovocitos MII se activaron en 2 ml de la misma solución con dos pulsos eléctricos directos de 120 V/mm durante 60 μs, utilizando un generador de fusión celular (LF101; A partir de entonces, los ovocitos se cultivaron en el medio IVC (medio cigoto porcino 5; PZM5) (26) que contenía 5 μg/mL de citochalasina B durante 4 h en una atmósfera humidificada de 5% CO2, 5% O2 y 95% N2. Los embriones activados eléctricamente se lavaron tres veces en gotitas de medio IVC (30 μL) y se incubaron en las mismas gotitas (10 embriones por gota) cubiertas de aceite mineral. PA se llevó a cabo el día 0. Los embriones se trasladaron a gotitas frescas 48 (día 2) y 96 h (día 4) después de PA. En el día 2, las tasas de escisión de los embriones se analizaron en cinco categorías de embriones (1, 2-3, 4-5, 6-8 y embriones fragmentados). El día 7, el desarrollo embrionario se evaluó cuantitativamente determinando las tasas de escisión y formación de blastocisto en tres grupos, de acuerdo con la morfología de la blastocisto (temprano, expandida y incubada). Durante todo el período de IVC, se añadió IL-7 a los medios IVC a concentraciones de 0 (control), 0,1, 1, 10 y 100 ng/mL.
Medición de los niveles intracelulares de GSH y ROS
Los niveles intracelulares de GSH y ROS se midieron utilizando un método notificado previamente (27). Los embriones en etapa de 4 a 5 células de cada grupo se tomaron muestras el día 2 para realizar estas mediciones. CellTracker Blue 4-clorometil-6,8-difluoro-7-hidroxicoumarina (CMF2HC; Invitrogen) y 2’7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato (H2DCFDA; Invitrogen) se utilizaron para medir los niveles intracelulares de GSH (fluorescencia azul) y ROS (fluorescencia verde En resumen, los embriones se transfirieron al medio TLH-PVA que contenía 10 μM CMF2HC o H2DCFDA y se mancharon en la oscuridad durante 30 y 10 minutos, respectivamente. A partir de entonces, los embriones se lavaron tres veces con TLH-PVA y se transfirieron a gotas de 8 μL de TLH-PVA. Los niveles de GSH y ROS se imagenron utilizando un microscopio de fluorescencia (TE300; Nikon, Tokio, Japón) con filtros UV (370 nm para GSH y 460 nm para ROS). Finalmente, se utilizó Adobe Photoshop 2021 para analizar la intensidad de fluorescencia de cada embrión, que se normalizó a la del grupo de control.
Ensayo de etiquetado de terminales de dUTP dexnucleotidil transferasa terminal
Las blastocistos se tiñieron con TUNEL para determinar el número de células apoptóticas utilizando un kit de detección de muerte celular in situ (Roche, Mannheim, Alemania), de acuerdo con un método notificado anteriormente (28). En el día 7, las blastocistos derivadas del medio IVC se trataron con 0, 0,1, 1, 10 y 100 ng/mL de IL-7, se lavaron tres veces en 0,1% PBS-PVA (PVS) y se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 minutos a 25 °C (temperatura ambiente; RT). En el siguiente paso, los blastocistos se lavaron dos veces en 0,1% PVS con 0,1% Tween 20 y 0,01% Triton X-100 (v/v) y se permeabilizaron con 0,3% TritonX-100 en PBS durante 1 h a 37 °C. Finalmente, el ensayo TUNEL se realizó utilizando trifosfato de deosuridina conjugado con fluoresceína (dUTP) y desoxinucleotidil transferasa terminal (Roche, Mannheim, Alemania) durante 1 h y 30 minutos a 37 °C. Después de lavar dos veces en el 0,1% PVS, los blastocistos se teñieron con 5 μg/mL Hoechst-33342 durante 10 minutos en RT para visualizar los núcleos.
Reacción cuantitativa en cadena de la transcripción inversa-polimerasa
La expresión de mRNA se analizó utilizando qRT-PCR para 19 genes específicos asociados con diferentes funciones, como genes relacionados con apoptosis: BCL2 asociado X (BAX), BCL2 como 1 (BCL2L1), caspasa-3 (CASP3), leucemia de células mieloides-1 (MCL1); IL-7: subunidad reguladora de (ZAR1); genes relacionados con la activación del genoma zigótico (ZGA): familia portadora de solutos 34 miembro 2 (SLC34A2), pluripotencia del desarrollo asociada 2 (DPPA2) y factor de iniciación de la traducción eucariota 1A (EIF1A). Todas las secuencias de imprimación se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.
El día 2, los embriones y los blastocistos se lavaron tres veces con PVS y se tomaron muestras a -80 °C antes del experimento. La extracción de ARN se realizó utilizando el reactivo TRIzol (TaKaRa Bio, Inc., Otsu, Shiga, Japón), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Luego, el ARN extraído (1 μg de ARN total) se convirtió en ADN complementario (cDNA) usando SuperScript IV VILO Master Mix (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.). Finalmente, el cDNA sintetizado, 2× SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa Bio, Inc.) y 5 pmol de cebadores específicos (Macrogen, Inc., Seúl, República de Corea) se utilizaron para qRT-PCR. La expresión del ARNm se analizó utilizando el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Los parámetros de ciclo fueron los siguientes: 95 °C durante 5 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 56 °C durante 15 s y 72 °C durante 30 s. La cuantificación relativa se realizó comparando el ciclo umbral (Ct) a intensidad de fluorescencia constante. La expresión relativa de ARNm (R) se calculó utilizando la ecuación R = 2−[ΔCtsample−ΔCtcontrol] (29). Los valores de R se normalizaron a los de RN18S en las blastocistos de cada grupo.
Inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia se llevó a cabo de acuerdo con los métodos de Yoon et al. (8), con algunas modificaciones. En resumen, los ovocitos y embriones de MII se fijaron con un 4% de paraformaldehído en PBS durante 30 minutos en RT, permeabilizaron en 0,5 % Triton X-100 durante 1 h en RT y lavados dos veces con 0,1% PVS. Los o embriones de MII se trataron con Image-iTTM FX Signal Enhance (ab 180521, 1:100; Abcam), ratón anti-SOX2 (sc-365823, 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.) y ratón anti-fosfo-STAT5 (ab 106095, 1:25; Abcam). Al día siguiente, las muestras se lavaron tres veces durante 5 minutos con 0,1% Tween 20 y 0,01% de Triton X-100 en 0,1% PVS (TTVS) en RT y luego se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados: anti-ratón de cabra IgG (H + L) Alexa FluorTM 488 (A11029, 1:200; Invitrogen Corporation Las muestras teñidas se analizaron utilizando un microscopio de epifluorescencia (TE300; Nikon) con filtros UV. Las células SOX2 positivas se examinaron específicamente en blastocistos con más de 30 células el día 7.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). Los experimentos se realizaron al menos en triplicado, a menos que se indique lo contrario. Además, los resultados se presentaron como la media ± SEM. Los datos porcentuales (tasas de formación de escisión y blastocisto) y los datos promedio (niveles intracelulares de GSH y ROS en escisión, ensayo TUNEL en blastocistos, niveles de expresión génica relativa y análisis cuantitativo en inmunofluorescencia) se analizaron utilizando el análisis unidireccional de varianza o la prueba t de Student La significación estadística se estableció en p < 0,05.
Resultados
Localización de las proteínas IL-7 e IL-7R en embriones porcinos preimplantacionales
Para identificar las ubicaciones de IL-7 e IL-7R en ovocitos y embriones porcinos en cada etapa, recogimos ovocitos de MII después de IVM, y probamos embriones y blastocistos de 2, 4 y 8 células a las 24, 48, 72 y 168 horas después de PA, respectivamente. La localización de las proteínas IL-7 e IL-7R durante el desarrollo previo a la implantación se investigó mediante inmunofluorescencia. Tanto IL-7 como IL-7R se expresaron en ovocitos MII (Figura 1A). Además, estas proteínas se observaron en los embriones de 2, 4 y 8 células (Figuras 1B–D). También se encontró que IL-7 y su receptor estaban localizados en el citoplasma hasta la etapa de la blastocisto (Figura 1E).
Figura 1. Localización de IL-7 e IL-7R en embriones porcinos preimplantación. Los ovocitos porcinos en la fase metafase II (MII) (A) y los embriones en las etapas de 2- (B), 4- (C), 8 células (D) y blastocisto (E) recogidos a las 0, 24, 48, 72 y 168 h después de PA, respectivamente, se mancharon con anticuerpos contra IL-7 e IL-7R. Barra de escala: 100 μm.
Efectos de la suplementación de IL-7 durante la IVC en el desarrollo embrionario porcino después de la PA
Añadimos IL-7 en varias concentraciones durante el IVC para determinar su concentración óptima para el desarrollo embrionario porcino después de la PA. Las tasas de escisión aumentaron significativamente (p < 0,05) en los grupos tratados con IL-7 de 10 y 100 ng/ml en comparación con el grupo de control (Tabla 1 y Figura 2). Además, las tasas de formación de blastocisto fueron significativamente más altas (p < 0,05) en el grupo tratado con 10 ng/mL IL-7 que en el grupo de control. Los patrones de escisión en el día 2 también revelaron que las tasas de embriones fragmentados fueron significativamente más bajas (p < 0,05) en los grupos tratados con IL-7 de 1 y 10 ng/mL que en el grupo de control (Figura 2B).
Tabla 1. Efecto de la suplementación con IL-7 durante la IVC en el desarrollo embrionario después de la PA.
Figura 2. Efecto de la suplementación de IL-7 durante IVC en los patrones de formación de escisión y blastocisto de embriones de PA. (A) Imagen representativa de la morfología de los embriones clidos y los blastocistos de cada grupo después de PA. Asterisco, embrión escindida; Triángulo, blastocisto. Barra de escala: 200 μm. El patrón de escisión (B) y la tasa de formación de blastocistos (C) de los embriones de PA. Dentro de cada punto final, las barras con diferentes letras (a, b) indican diferencias significativas (p < 0,05) en varias concentraciones de IL-7. Frag, fragmentación; CL, escisión; BL, blastocisto. Las tasas de formación de escisión y blastocisto se evaluaron los días 2 y 7 después de PA, respectivamente. Para todos los gráficos, los valores representan la media ± SEM. El experimento se repitió cuatro veces.
Efectos de la suplementación con IL-7 durante la IVC en los niveles intracelulares de GSH y ROS en embriones clidos
Para examinar el efecto de IL-7 en el estrés oxidativo, analizamos los niveles intracelulares de GSH y ROS en embriones de 4 células el día 2 después de la PA (Figura 3). Los grupos de tratamiento de 1 y 10 ng/mL IL-7 mostraron niveles de GSH intracelular significativamente más altos (p < 0,05) que el grupo de control. Además, los embriones en el grupo de tratamiento de 10 ng/mL IL-7 mostraron niveles de ROS intracelulares significativamente más bajos (p < 0,05) que los del grupo de control.
Figura 3. Fotomicrografías de epifluorescencia de embriones de 4 células derivados de PA con varias concentraciones de suplementación de IL-7 durante IVC durante 2 días. (A) Los embriones se mancharon con Cell Tracker Blue (a-e) y H2DCFDA (f-j) para detectar niveles intracelulares de glutatión (GSH) y especies reactivas de oxígeno (ROS), respectivamente. Barra de escala: 100 μm. (B) Los niveles relativos de los niveles intracelulares de GSH y ROS dentro de embriones porcinos cultivados in vitro tratados con IL-7 durante la IVC. El número de embriones examinados en cada grupo experimental se muestra entre paréntesis. Dentro de cada punto final, las barras con letras diferentes (a, b) son significativamente diferentes (p < 0,05) para cada grupo. Para todos los gráficos, los valores representan la media ± SEM. El experimento se repitió cuatro veces.
Efectos de la suplementación con IL-7 durante la IVC en el número total de células y la apoptosis en los blastocistos
El número total de células y núcleos apoptóticos se contaron para investigar la calidad de los blastocistos porcinos tratados con IL-7. La complementación de los medios IVC con IL-7 no influyó en el número total de núcleos en comparación con el del grupo de control (Figuras 4A,B). Sin embargo, el número de núcleos apoptóticos y el índice apoptótico se redujeron significativamente (p < 0,05) en los blastocistos tratados con 1 y 10 ng/mL IL-7 en comparación con los del control (Figuras 4A,C,D).
Figura 4. Número de células totales y núcleos apoptóticos en blastocistos derivados de PA expuestos a diversas concentraciones de suplementación con IL-7 durante IVC durante 7 días. (A) Imágenes representativas de microscopía confocal de escaneo láser (200×) de blastocistos de PA porcinos etiquetados con Hoechst 33342 (núcleos totales, azul) y TUNEL (núcleos apoptóticos, verdes) después de IVC. Barra de escala: 100 μm.( B-D) Cuantificación de los números de células totales y apoptóticas, e índice apoptótico en los grupos indicados. El número de embriones examinados en cada grupo experimental se muestra entre paréntesis. Dentro de cada punto final, las barras con diferentes letras (a-c) son significativamente diferentes (p < 0,05) para cada grupo. Para todos los gráficos, los valores representan la media ± SEM. El experimento se repitió cuatro veces.
Efectos de la suplementación con IL-7 durante la IVC en los niveles de expresión génica en embriones eclásticas y blastocistos
Después de determinar la concentración óptima de suplementación de IL-7 durante el período de IVC a 10 ng/mL, realizamos experimentos posteriores de IVC usando 10 ng/mL IL-7. Para determinar el mecanismo del aumento observado en la eficiencia del desarrollo embrionario tras la suplementación con IL-7, se analizaron los niveles de transcripción en embriones y blastocistos del día 2 a través de qRT-PCR. Por lo tanto, observamos que en el grupo tratado con IL-7 en relación con el grupo de control, el nivel de ARNm del gen proapoptótico, BAX, disminuyó significativamente (p < 0,001), mientras que el del gen antiapoptótico, MCL1 aumentó significativamente (p < 0,05) (Figura 5A). Los niveles de expresión de los genes asociados con la señalización de IL-7, incluidos PIK3R1, AKT1 y ERK1, no fueron significativamente diferentes entre los grupos de suplementación y control de IL-7. Sin embargo, los niveles de ERK2 fueron significativamente más altos (p < 0,05) para el grupo suplementarido con IL-7 en relación con el grupo de control (Figura 5B). Además, los embriones tratados con IL-7 mostraron niveles de transcripción de NANOG significativamente más altos (p < 0,05) que los embriones de control (Figura 5C).
Figura 5. Niveles relativos de expresión de ARNm de genes asociados con apoptosis, señalización de IL-7, desarrollo, genes de efecto materno (MEG) y activación del genoma cigótico (ZGA) en embriones tratados con IL-7 segundo día. Los niveles de expresión de ARNm de (A) genes relacionados con la apoptosis (BAX, BCL2L1, CASP3 y MCL1), (B) genes relacionados con la señalización IL-7 (PIK3R1, AKT1, ERK1 y ERK2), (C) genes relacionados con el desarrollo (PCNA, OCT4 y NANO Los datos se normalizaron al gen RN18S. Los asteriscos indican significación estadística (*p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001). Para todos los gráficos, el valor representa la media ± SEM. Los experimentos se replicaron tres o cuatro veces.
Un estudio anterior reveló que la ZGA porcina se produce en la etapa de 4 células (30). También se ha informado de que durante la transición de madre a cigota (MZT), la perturbación en la degradación de los ARN maternos y la ZGA puede conducir a la detención embrionaria, lo que indica la importancia de estos procesos (31). Por lo tanto, investigamos si IL-7 está involucrado en el aclaramiento de ARNm materno y ZGA mediante la detección de los niveles de ARNm de MEG (Filia, NPM2 y ZAR1) y los genes relacionados con ZGA (SLC34A2, DPPA2 y EIF1A). En comparación con el grupo de control, los niveles de transcripción de Filia y NPM2 fueron significativamente más bajos (p < 0,01) después del tratamiento con IL-7 (Figura 5D). Por el contrario, los niveles de expresión de ARNm de DPPA2 y EIF1A aumentaron significativamente (p < 0,05) el día 2 después de que los embriones fueran tratados con IL-7 (Figura 5E).
Además, las blastocistos tratadas con IL-7 mostraron niveles significativamente (p < 0,05) más altos de MCL1 y más bajos de BAX que los embriones de control (Figura 6A). Además, entre los genes relacionados con la señalización IL-7, los niveles de expresión de PI3KR1, AKT1 yERK2 aumentaron significativamente en los blastocistos tratados con IL-7 en comparación con los del grupo de control (Figura 6B). También observamos que los niveles de expresión de los genes relacionados con el desarrollo embrionario, OCT4 y NANOG, aumentaron significativamente (p < 0,01 y p < 0,05, respectivamente), mientras que los de CDX2, GATA6 y PCNA no mostraron ninguna diferencia significativa entre el grupo de tratamiento de control y IL-7 (Figura 6C).
Figura 6. Niveles relativos de expresión de ARNm de genes asociados con apoptosis, señalización de IL-7 y desarrollo en blastocistos tratados con IL-7. Los niveles de expresión de ARNm de (A) genes relacionados con la apoptosis (BAX, BCL2L1, CASP3 y MCL1), (B) genes relacionados con la señalización IL-7 (PIK3R1, AKT1, ERK1 y ERK2) y (C) genes relacionados con el desarrollo (PCNA, OCT4, Los datos se normalizaron a la expresión del gen RN18S. Los asteriscos indican significación estadística (*p < 0,05 y **p < 0,01). Para todos los gráficos, el valor representa la media ± SEM. Los experimentos se replicaron tres o cuatro veces.
Efectos de la suplementación de IL-7 durante IVC sobre la expresión de pSTAT5 y la relación ICM de los blastocistos
IL-7 activa la vía JAK/STAT, que cuando se estimula conduce a la fosforilación STAT5 en timocitos y células granulosas (32, 33). Por lo tanto, para determinar si la suplementación con IL-7 durante IVC estimuló la vía JAK/STAT en la etapa de la blastocisto porcina, examinamos la expresión de la proteína pSTAT5 a través de la inmunofluorescencia. El nivel de proteína pSTAT5 aumentó significativamente (p < 0,01) en las blastocistos tratadas con IL-7 en comparación con el control (Figura 7).
Figura 7. Efecto de la suplementación de IL-7 durante IVC en la expresión fosforilada de STAT5 (pSTAT5) de blastocistos después de PA.( A) Imágenes representativas de inmunofluorescencia (200×) de blastocistos parthenote porcinas etiquetadas con Hoechst 33342 (núcleos totales, azul) y pSTAT5 (verde) después de IVC. NC, control negativo. Barra de escala: 100 μm.( B) Cuantificación de la intensidad relativa de pSTAT5 en los grupos indicados. El número de blastocistos examinados en cada grupo experimental se muestra entre paréntesis. Los asteriscos indican significación estadística (**p < 0,01). Para el gráfico, los valores representan la media ± SEM. El experimento se repitió cuatro veces.
Basado en qRT-PCR, las blastocistos tratadas con IL-7 mostraron niveles significativamente mayores para el marcador de epiblastos, NANOG, pero no para el marcador de trophectodermo, CDX2. Además, planteamos la hipótesis de que la suplementación de IL-7 afecta el desarrollo de ICM durante la segregación del linaje en los blastocistos porcinos. Por lo tanto, se mancharon las blastocistos para SOX2, un fiel marcador de ICM (34), para determinar el efecto de IL-7 en el número de células de ICM (Figura 8). La suplementación con IL-7 durante el período de IVC no afectó al número total de células (Figura 8B). Sin embargo, los embriones tratados con IL-7 se desarrollaron en blastocistos con un aumento significativo (p < 0,001) del número de células SOX2+ en comparación con el control (4 células en IL-7 frente a células 2,4 en los controles) (Figura 8C). La relación ICM también se mejoró significativamente (p < 0,001) en ~ 1,7 veces en los blastocistos porcinos tratados con IL-7 (10,3% en IL-7 frente al 5,9 % en el control) (Figura 8D).
Figura 8. Efectos de la suplementación de IL-7 durante la IVC en la especificación de la masa celular interna (ICM) de los blastocistos después de PA. (A) Imágenes representativas de inmunofluorescencia (200×) de blastocistos parthenote porcinos etiquetados con Hoechst 33342 (núcleos totales, azul) y SOX2 (marcador ICM, verde) después de IVC. NC, control negativo. Barra de escala: 100 μm.( B-D) Cuantificación del total, números de células positivas SOX2 y la relación ICM en los grupos indicados. El número de embriones examinados en cada grupo experimental se muestra entre paréntesis. Los asteriscos indican significación estadística (***p < 0,001). Para todos los gráficos, los valores representan la media ± SEM. El experimento se repitió cuatro veces.
Discusión
En este estudio, examinamos la expresión de la proteína IL-7, así como la de su receptor, IL-7R, en embriones porcinos preimplantacionales. Además, demostramos la concentración óptima de IL-7 en un experimento de cultivo embrionario in vitro, que aumentó la tasa de escisión y formación de blastocistos regulando la apoptosis, la señalización de IL-7 y los genes relacionados con el desarrollo. Además, demostramos que la suplementación de IL-7 redujo los niveles de ROS, así como los niveles de transcripción de los genes relacionados con MEG. También mejoró los niveles de GSH y los niveles de expresión de ARNm de los genes relacionados con ZGA en embriones clidos. Además, la suplementación con IL-7 también mejoró la expresión de la proteína pSTAT5 y el marcador ICM, SOX2, lo que sugiere que este es un mecanismo por el cual la señalización IL-7 modula el desarrollo de embriones porcinos vitro.
Se cree que el desarrollo embrionario temprano en animales domésticos ocurre en el útero después de la implantación de la blastocisto después de la fertilización (35). Varios estudios también han demostrado que las citocinas, como las IL, los factores estimulantes de colonias, los factores de crecimiento transformador y los factores de necrosis tumoral, son importantes para el desarrollo y la implantación embrionarias tempranas (14, 36, 37). Aunque existen varios tipos de IL, hay información limitada sobre el papel de IL-7 en el desarrollo embrionario previo a la implantación. En un estudio de ratón, la expresión de ARNm de IL-7 supuestamente varió en diferentes etapas del desarrollo embrionario (38). Recientemente, también se informó de que IL-7 e IL-15, que pertenecen a la misma superfamilia IL-2, muestran una expresión génica muy aumentada en los tejidos reproductivos porcinos en comparación con otras citocinas de tipo IL (39). De acuerdo con este hallazgo reportado anteriormente, detectamos IL-7 y su receptor IL-7R en embriones porcinos preimplantacional. Por lo tanto, IL-7 probablemente desempeñe un papel importante en el desarrollo embrionario porcino.
Además, otro estudio anterior mostró que la expresión de IL-7, un factor secreto de ovocitos que media las señales de ovocitos a células somáticas, se activó considerablemente por la progresión meiótica. IL-7 también se identificó como un candidato potencial para las pruebas de detección de calidad de los ovocitos (22). Recientemente también, se demostró que la IL-7 mejora la maduración de los ovocitos y el potencial de desarrollo a través de la regulación de los genes relacionados con la apoptosis cuando se administra dentro de un sistema IVM para ovejas (40) y cerdos (21). Por lo tanto, especulamos que la IL-7 posiblemente desempeña un papel similar en la IVC porcina, y en este sentido, nuestros resultados demostraron que el tratamiento con IL-7 favoreció el desarrollo in vitro de embriones de preimplantación porcino después de la PA, y redujo la fragmentación en los embriones del día 2. Además, el número de células apoptóticas se redujo y los niveles de proteína pSTAT5 aumentaron en los blastocistos tratados con IL-7. Según se informa, el STAT5 fosforilado inducido por IL-7 se transloca al núcleo, donde regula la expresión de varios genes involucrados en la prevención de la apoptosis (41-43). Además, en el desarrollo linfoide, la IL-7 mejoró la supervivencia de los timocitos inmaduros y las células T maduras al aumentar el nivel de la proteína antiapoptótica MCL1, inhibiendo así la activación de BAX y BAK (44). Constantemente, nuestros resultados mostraron que los niveles de expresión del ARNm de MCL1 aumentaron significativamente, mientras que los de BAX disminuyeron tanto en embriones del día 2 tratados con IL-7 como en los blastocistos, lo que sugiere que IL-7 mejora el desarrollo in vitro de embriones porcinos al evitar que se sometan a apoptosis. Sin embargo, se necesitan más estudios para evaluar los niveles de proteínas de estos genes relacionados con la apoptosis y la vía IL-7/STAT5 en el IVC porcino.
El desarrollo embrionario temprano de los animales domésticos está regulado principalmente por el ARNm y las proteínas maternos. Posteriormente, las transcripciones depositadas por la madre se degradan progresivamente durante el MZT, y esto va acompañado de ZGA (45). También se observó que los defectos de ZGA conducen a la eliminación anormal de los ARNm maternos durante el proceso de MZT humano, retrasando así el desarrollo embrionario (46). Por lo tanto, la ZGA desempeña un papel importante en el desarrollo embrionario temprano (47). Los resultados de los análisis qRT-PCR en este estudio mostraron que los embriones del día 2 tratados con IL-7 mostraron un aumento de la degradación del ARNm materno (Filia y NPM2), mientras que los niveles de expresión de ARNm de los genes relacionados con ZGA (DPPA2 y EIF1A) se mejoraron. Además, los niveles de transcripción de NANOG fueron significativamente más altos en los embriones del día 2 tratados con IL-7 que en el grupo de control. Los resultados de un estudio anterior mostraron que Nanog y Pou5f1 (OCT4) regulan la expresión de ZGA en el pez cebra (48). Esta observación indicó que la IL-7 desempeña un papel importante en el desarrollo embrionario porcino al modular el aclaramiento materno del ARNm y la ZGA.
En los animales domésticos, el estrés oxidativo durante el desarrollo previo a la implantación puede provocar la detención del desarrollo en el momento de la ZGA o la apoptosis de la blastocisto (49). De hecho, el estrés oxidativo exógeno y endógeno durante la manipulación embrionaria in vitro contribuye a detener el desarrollo (50). Aunque la liberación de ROS debido al estrés oxidativo se considera un producto oxidativo no deseado, se pueden utilizar pequeñas cantidades de ROS en vías de señalización fisiológica en embriones (51). También se ha observado que una concentración moderada de IL-7 durante la IVM aumenta los niveles de ROS en los ovocitos ovinos (40). En uno de nuestros estudios anteriores, realizamos un experimento utilizando un sistema IVM porcino para determinar si el tratamiento con IL-7 regula el estrés oxidativo (21). De acuerdo con los resultados del presente estudio, observamos que la suplementación de IL-7 durante el IVC porcino aumentó los niveles de GSH intracelular y redujo los niveles de ROS en embriones de 4 células, provocando ZGA. En embriones de mamíferos, se han observado niveles aumentados de ROS en ZGA, que es sensible al estrés oxidativo durante el desarrollo embrionario (49, 52). Además, este pico en el nivel de ROS durante la ZGA indicó que las defensas oxidantes pueden agotarse en el MZT y deben reponerse mediante la expresión génica zigótica (53). Colectivamente, nuestros resultados en este estudio sugirieron que la IL-7 reduce el estrés oxidativo al regular los genes relacionados con ZGA durante el MZT porcino.
En los animales domésticos, dos eventos importantes resultan en la segregación del linaje durante el desarrollo previo a la implantación. Primero, durante la etapa de morula compactada, se forma el trophectodermo. Esto a su vez está involucrado en la formación de la placenta y la ICM, que se convierte en la estructura definitiva del feto y puede producir ESC. En segundo lugar, el ICM se divide en el epiblasto y el endodermo primitivo (54). Los avances recientes en la transcriptómica de elastómero único han facilitado la aclaración de las vías de señalización involucradas en la especificación del linaje de embriones preimplantacional en mamíferos (30, 55-58). Según se informa, el CDX2 es un marcador trofetódermo en ratones, humanos y cerdos (54, 59), y OCT4, un gen de pluripotencia central, se expresa en todos los embriones preimplantacionales. Además, el marcador epiblasto, NANOG, y el marcador hipoblasto, GATA6, se expresan conjuntamente en el ICM de las blastocistos tempranas porcinas (55, 56). En el presente estudio, mostramos que en los blastocistos, la suplementación con IL-7 mejoró significativamente la expresión del ARNm OCT4 y NANOG, pero no del ARNm CDX2 o GATA6. Estos genes relacionados con la pluripotencia se regulan a través de una vía indirecta que involucra a otras citocinas de tipo IL (60, 61). Sin embargo, no hay informes que demuestren que IL-7 regula los genes de pluripotencia. Por lo tanto, se necesitan más estudios para verificar estos hallazgos.
Según se informa, IL-7 activa las vías JAK/STAT, PI3K/Akt y la proteína quinasa activada por mitógenos/kinasa regulada por señal extracelular (MAPK/ERK; MEK) en células T normales y células de leucemia linfoblástica aguda de células T (33, 62–64). De acuerdo con estos estudios anteriores, nuestros resultados también mostraron un aumento de la expresión de la proteína pSTAT5, así como la regulación ascendente de los genes relacionados con la vía PI3K/Akt y ERK2 en los blastocistos tratados con IL-7. La vía PI3K/Akt desempeña un papel funcional en los embriones preimplantacionales, y su inhibición influye en el desarrollo de la etapa de blastocisto en embriones murinos, bovinos y porcinos (65-67). Además, la activación de la señalización ERK juega un papel esencial en la diferenciación de la ICM en los blastocistos murinos (68). La función de estas vías se mejora en la ICM de los blastocistos porcinos y puede afectar el número de células de ICM cuando se interrumpen por inhibidores de la vía específicos (55, 56). Del mismo modo, nuestros resultados mostraron que el tratamiento con IL-7 mejoró el número de células ICM y la relación ICM de los blastocistos, lo que sugiere que IL-7 mejora la calidad del blastocisto al activar la señalización IL-7 durante el desarrollo embrionario porcino. De acuerdo con los resultados reportados anteriormente, se observó un aumento en el número de células de ICM cuando también se administraron otros tipos de IL durante el período de IVC (69-72). No obstante, se requieren más estudios para determinar el papel exacto de IL-7 en el desarrollo de ICM porcino.
Conclusión
En este estudio, demostramos, por primera vez, la localización de IL-7 e IL-7R en embriones porcinos preimplantacionales. Específicamente, nuestros resultados mostraron que el IL-7 y su receptor están involucrados en el desarrollo embrionario porcino y que la suplementación de IL-7 en IVC porcino mejora el desarrollo de embriones parthenote porcinos a través de la regulación del efecto antiapoptótico, el aclaramiento de ARNm materno y la ZGA. Además, observamos que la suplementación con IL-7 mejoró la calidad de la blastocisto al modular la transcripción de los genes relacionados con la señalización del desarrollo y la IL-7 y al aumentar el número de células SOX2+ y la relación ICM durante el desarrollo del embrión de PA porcino in vitro. En este estudio, nos centramos en el efecto de IL-7 en el desarrollo embrionario porcino utilizando solo embriones de PA, excluyendo los factores de contraparte masculina que pueden causar problemas, como la polispermia. Sin embargo, dado que en realidad hay muchas diferencias mecanicistas entre la AP y los embriones derivados de la FIV, se requieren más estudios utilizando la FIV o embriones derivados de transferencia nuclear de células somáticas. Nuestros hallazgos, principalmente, proporcionan nuevos conocimientos sobre los efectos de la IL-7 en el desarrollo embrionario y pueden contribuir a la mejora de los sistemas de IVC porcino y las tecnologías relacionadas.
Declaración de disponibilidad de datos
Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo/material suplementario, se pueden dirigir más consultas a los autores correspondientes.
Contribuciones del autor
DO, YJ y S-HH: conceptualización, validación, redacción, preparación del borrador original y redacción-revisión y edición. DO, HC, MK, LC, JL, GL y YJ: metodología. DO, HC, MK, LC, JL, AJ, SK y HZ: investigación. DO, HC, MK, LC, JL y GL: análisis formal. S-HH: adquisición de fondos. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
Financiación
Este trabajo fue apoyado, en parte, por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) de Corea Subvención financiada por el Gobierno coreano (Número de subvención 2020R1A2C2008276) el Instituto Corea de Planificación y Evaluación de Tecnología en Alimentación, Agricultura, Silvicultura y Pesca (IPET) a través del Programa de Desarrollo Tecnológico de la industria agro-Bio ( Número 2017K1A4A3014959), y el Programa de Laboratorio de Investigación Básica (Número de Concesión 2022R1A4A1025557) a través de la NRF de Corea, financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC de la República de Corea.
Agradecimientos
Los autores están agradecidos a Suin Lee y Eun-Jeong Kim por su apoyo técnico, incluso en el muestreo de ovarios.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Nota del editor
Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.
Material complementario
El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2022.1052856/full#supplementary-material
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Palabras clave: interleucina-7, cerdo, desarrollo embrionario, cultivo in vitro, activación partenogenética
Cita: Oh D, Choi H, Kim M, Cai L, Lee J, Jawad A, Kim S, Zheng H, Lee G, Jeon Y y Hyun S-H (2022) La interleucina-7 mejora el desarrollo in vitro y la calidad de la blastocisto en embriones partenogenéticos porcinos. Frente. Veterinario. Ciencia. 9:1052856. doi: 10.3389/fvets.2022.1052856
Recibido: 24 de septiembre de 2022; Aceptado: 24 de noviembre de 2022;
Publicado: 08 de diciembre de 2022.
Editado por:
Sebastián Demyda-Peyrás, Universidad Nacional de La Plata, Argentina
Revisado por:
Rolando Pasquariello, Universidad de Milán, Italia
Xiaoyun He, Instituto de Ciencias Animales (CAAS), China
Copyright © 2022 Oh, Choi, Kim, Cai, Lee, Jawad, Kim, Zheng, Lee, Jeon y Hyun. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons (CC BY).
*Correspondencia: Yubyeol Jeon, ybjeon@jbnu.ac.kr; Sang-Hwan Hyun, shhyun@cbu.ac.kr
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