1. Introducción

Las infecciones bacterianas en las aves de corral representan un problema esencial de la ganadería que afecta el bienestar, la salud y la productividad de los animales. Las infecciones debidas a bacterias en las aves de corral son una preocupación importante para la salud y la producción eficiente de las aves. Hasta ahora, los granjeros han utilizado antibióticos para controlar enfermedades que involucran infecciones bacterianas en las aves de corral. Los pollos también han sido alimentados con bajas concentraciones de antibióticos para mejorar la ganancia diaria de peso y la eficiencia alimenticia a través de alteraciones en la supresión de enfermedades (1). Debido al uso masivo de antibióticos, el aumento en el desarrollo y la propagación de bacterias resistentes a los antibióticos se ha convertido en una causa importante de preocupación. La resistencia a los antimicrobianos es un evento natural que tiene lugar cuando las bacterias ya no responden a los antibióticos a los que antes eran susceptibles y que antes estaban activas en el tratamiento de infecciones causadas por estos microorganismos (2). En las últimas décadas, no se han producido nuevos tipos importantes de antibióticos. Casi todos los antibióticos conocidos están perdiendo cada vez más su eficacia contra los microorganismos patógenos, especialmente los utilizados en la avicultura (3). Dado que la incidencia de la resistencia a los antibióticos se ha convertido en un problema grave, aumenta la presión sobre los productores para que reduzcan el uso de antibióticos en la industria avícola (2).

Con la disponibilidad reducida de antibióticos, los productores avícolas trabajan para reducir el uso de antibióticos y buscan aditivos alimentarios para estimular el sistema inmunológico de los pollos para resistir la infección microbiana (4). Además, ha aumentado el interés en los aditivos alimentarios «naturales» que pueden estimular el sistema inmunológico de las aves de corral. Además, un impulso significativo para producir aves de corral libres de antibióticos está ganando popularidad entre el público en general (5).

Varios estudios demuestran que los betaglucanos pueden desempeñar un papel en la sustitución de los antibióticos y estimular el sistema inmunitario (6). Los glucanos son carbohidratos hechos de polímeros complejos de glucosa que proporcionan la estructura primaria que se encuentra en la pared celular de levaduras, hongos, algas y granos de cereales como la avena y la cebada (7). Las estructuras de los glucanos varían en función de su fuente y del tipo de enlaces en los polímeros de glucosa (8). La naturaleza de estos enlaces afectará a la funcionalidad de las moléculas.

Los betaglucanos se transportan al intestino delgado, luego pasan a través de los parches de Peyer en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT) y, posteriormente, se transportan por todo el cuerpo (9). El efecto de los betaglucanos está mediado por su unión a receptores específicos. Estimula los macrófagos, la secreción de anticuerpos y aumenta la actividad de las células asesinas naturales. Al igual que los mamíferos, los macrófagos aviares sintetizan citocinas y quimiocinas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), la interleucina 4 (IL4), la interleucina 6 (IL6), la interleucina 8 (IL8), la interleucina 10 (IL10) y el interferón gamma (IFN-γ) (10, 11). Además de la estimulación directa de la inmunidad específica e inespecífica, los glucanos también pueden influir en la expresión de genes y proteínas relacionados con el sistema inmunitario. La estimulación en el funcionamiento inmunológico sirve para combatir los efectos adversos de la infección entérica o la inmunosupresión debido a condiciones de crianza de alto estrés (9).

Se informó que los betaglucanos son efectivos para promover el crecimiento de pollos de engorde y mejorar la calidad de su carne (12). Se ha demostrado que los betaglucanos mejoran la salud intestinal de las aves de corral sometidas a un desafío bacteriano y aumentan el flujo de nuevos inmunocitos hacia los distintos órganos linfoides (13). Los betaglucanos pueden aumentar la funcionalidad de los macrófagos (14), afectar la morfología intestinal y funcionar como inmunomoduladores antiinflamatorios (7). El extracto de levadura dietético de manano-oligosacárido (MOS) que contiene MOS y la suplementación con betaglucanos a pavitos de pavo puede aumentar el número de células caliciformes y regular la producción de mucina-2 de las células caliciformes (15), mejora la altura de las vellosidades y la profundidad de las criptas y su proporción en el duodeno y el íleon (16). Además, los consumidores pueden aceptar más fácilmente los piensos enriquecidos con betaglucanos con más confidencialidad que las aves de corral tratadas con antibióticos (5). Proponemos que cuando se utiliza una declaración, «los glucanos introducidos en la alimentación de las aves de corral» siempre se asociarán con «aves de corral libres de antibióticos», y esta información puede transferirse fácilmente a la conciencia del consumidor. Las mezclas de betaglucano pueden implementarse para obtener un rendimiento antiinflamatorio, inmunomodulador y de crecimiento óptimo y una morfología intestinal e histología optimizadas en aves de corral (17, 18).

Se desconoce la actividad específica de cada subtipo de betaglucanos, y no se ha realizado una comparación directa de los betaglucanos derivados de diferentes fuentes en aves de corral. A pesar de los numerosos glucanos aislados de diversas fuentes, no se ha llegado a la decisión sobre los glucanos más activos en aves o en cualquier otro modelo animal, lo que a veces conduce a resultados contradictorios. Debido a que existe una amplia variación en la estructura de los betaglucanos en función de su origen, su eficacia en la modulación del sistema inmunitario puede variar (8). No obstante, generalmente se acepta que los 1,3 y 1,6-betaglucanos, derivados de la levadura y los hongos, se consideran la forma más efectiva disponible debido a su compleja red de ramificación de carbohidratos (19, 20). Por lo tanto, nos centramos en el uso de betaglucanos, procedentes de levaduras, hongos y algas, como supuestos inmunomoduladores en aves de corral. Nuestro objetivo fue encontrar el tipo y la concentración óptima de beta-glucano para ejercer el entrenamiento inmunológico óptimo y las adaptaciones sobre las actividades morfológicas intestinales en aves de corral utilizando configuraciones in vitro e in vivo. Los resultados de nuestro estudio pueden contribuir al objetivo general de reducir o incluso eliminar los antibióticos, lo que puede ser excepcionalmente beneficioso para los ganaderos para evitar pérdidas económicas y para los consumidores de pollo que buscan carne libre de antibióticos (21). Los resultados pueden aportar conocimientos comercialmente necesarios sobre este campo agrícola críticamente no explorado adecuadamente.

2. Materiales y métodos

2.1. Betaglucanos

(1) Un extracto de glucano de algas, utilizado en ensayos in vitro, fue amablemente proporcionado por Quegen Biotech (Corea del Sur). (2) Los glucanos de levadura (Saccharomyces cerevisiae) (Glucan #300) utilizados en ensayos in vivo fueron amablemente proporcionados por Transfer Point (Columbia, SC, EE. UU.). Para los ensayos in vitro se utilizaron betaglucanos de algas, ya que estos betaglucanos son fácilmente solubles en agua. Los glucanos de levadura (Saccharomyces cerevisiae) son completamente insolubles en agua o en cualquier otro disolvente, por lo que no pudimos utilizarlos en los ensayos in vitro. Además, el costo de los betaglucanos de algas es extremadamente alto, por lo que no es factible su uso con fines de alimentación, por lo que elegimos para los experimentos de alimentación el uso de glucanos de levadura (la proporción de alfa a beta glucanos en ambas preparaciones es similar) y beta glucanos de algas para los ensayos in vitro. Para los ensayos in vitro, los glucanos se disolvieron en agua bidestilada (DDW) hasta una concentración final de 50 mg/ml del extracto en un baño de agua durante 1 h a 80 °C. La solución se esterilizó en autoclave calentándola a 121 °C durante 30 min. A continuación, la solución se diluyó en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) hasta una concentración final de 5, 1, 0,5 y 0,05 mg/ml. (3) Los glucanos de hongos se extrajeron de los hongos ostra rey (amablemente proporcionados por Tekoa farms, Israel). Los hongos se molían hasta convertirlos en polvo fino en hielo seco. El polvo de hongos se disolvió en agua destilada, en una concentración de 1 g de polvo de hongos en 10 ml y se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 30 min. A continuación, la solución se peletizó a una velocidad de 13.000×g a 10 °C durante 15 min; La fase líquida se transfirió a etanol a una concentración final de 1:2. A continuación, la solución se almacenó a una temperatura de -20 °C durante la noche. Después de aproximadamente 24 h, se forma un flotador. El flotador se secó en una campana extractora durante 24 h. El flotador seco se congeló a -80 °C durante la noche y se liofilizó para obtener un polvo uniforme (22). Para los experimentos in vitro, los glucanos extraídos de los hongos se disolvieron en el disolvente dimetilsulfóxido (DMSO) hasta una concentración final de 5 mg/ml del extracto de beta glucano en un baño de agua durante 1 h a 90 °C y se diluyeron en DMEM a la concentración final de 5, 1, 0,5 y 0,05 mg/ml. α y β glucanos se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de beta-glucano Megazyme (Megazyme, Irlanda) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2.2. Cultivo celular

Las células de macrófagos HD11 de pollo fueron amablemente proporcionadas por la Dra. Elisabeth Kowenz-Leutz (Centro Max Delbrueck, Berlín, Alemania) y cultivadas en 75 mm² matraces con 18 ml de medio de crecimiento DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 8%, suero de pollo al 2%, penicilina al 1% y estreptomicina. A continuación, las células se incubaron a 37 °C y 5% de CO₂ hasta alcanzar el 95% de confluencia. Para el análisis de expresión génica y óxido nítrico, las células se cultivaron en placas de 6 pocillos (1 × 10⁶ células/ml). Después de 48 h, se retiró el medio y se retiró el medio DMEM fresco con lipopolisacárido (LPS) (de E. Coli, O111:B4; Se añadió Sigma L4130 (utilizado en concentraciones especificadas como se indica a continuación) o glucanos y se utilizaron como estimulante proinflamatorio. Las células se recolectaron para el ARN y los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -80 °C.

2.2.1. Expresión génica

El ARN se extrajo de las células HD11 utilizando NucleoSpin RNA, Mini kit (MN, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se cuantificó utilizando Nanodrop 2000 (ThermoFisher USA). Se utilizaron 2 μg de ARN para sintetizar ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc qScript (Quanta bio, EE. UU.).

La qPCR en tiempo real se realizó utilizando una mezcla maestra verde SYBR rápida (ABI, EE. UU.) en la máquina Quant studio 1 (ABI, EE. UU.). Para la normalización de la expresión génica en todas las reacciones, se utilizó el gen GAPDH. En la Tabla 1 se presentan los cebadores para la expresión génica relativa. La normalización y cuantificación se realizó utilizando la curva std de diluciones seriadas 1:5 o el método ddCt (23).

2.2.2. Ensayo colorimétrico de óxido nítrico

Se utilizó un kit de ensayo colorimétrico de nitrato/nitrito (Cayman Chemical, EE. UU.) para cuantificar la cantidad de óxido nítrico liberado al medio. El proceso se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 200 μL de tampón de ensayo a 96 pocillos vacíos, seguidos de 80 μL del medio de muestra. Se añadieron 10 μL de cofactor enzimático a cada pocillo, seguido de 10 μL de mezcla de nitrato reductasa durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos se suplementaron con reactivo Griess durante 10 min de incubación y se transfirieron a un lector de placas para leer la absorbancia a 540 nm (BioTek synergy H1, Agilent technologies CA, EE. UU.).

2.2.3. Ensayo de fagocitosis

La actividad de la fagocitosis de los macrófagos se evaluó utilizando el kit pHrodo™ Red Zymosan BioParticles («Zymosan», Life Technologies, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células HD11 se cultivaron en placas de 96 pocillos (1 × 10⁶ células/ml) para todos los experimentos. Después de 48 h, se retiró el medio y se añadió un medio DMEM fresco con betaglucanos de algas (1 mg/ml), betaglucanos de hongos (1 mg/ml) o LPS (100 ng/ml, preparado en DDW esterilizado) y se utilizó como activador estimulante durante 1 h. Las BioPartículas proporcionadas por el kit se sometieron a vórtice y se resuspendieron homogéneamente en DMEM transparente (pH = 7,4) y luego se sonicaron durante 10 min (Bioruptor; Diagenode, Denville, NJ) con el fin de dispersar homogéneamente las partículas. A continuación, se retiró el medio de los cultivos, se sustituyó por las «partículas de Zymosan» dispersas a 100 μL/pocillo y se incubó a 37 °C con 5% de CO₂ durante otras 1-1,5 h. La actividad de fagocitosis en las células adheridas se midió utilizando un lector de placas utilizando una excitación de 560 nm y una emisión de 590 nm (BioTek synergy H1, Agilent technologies CA, EE. UU.).

2.3. Experimentos in vivo

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo bajo la aprobación del comité de ética de la Universidad Hebrea de Jerusalén. Se llevaron a cabo dos experimentos en la unidad avícola y en los laboratorios de investigación de la Facultad de Agricultura, Alimentación y Ciencias Ambientales de Israel. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo el cuidado y la supervisión del Prof. Israel Rozenboim. Uno de los experimentos in vivo probó los efectos del tratamiento con betaglucanos extraídos de levaduras en varias concentraciones; sobre el crecimiento y desarrollo de los pollos de engorde. El segundo experimento in vivo probó los efectos del tratamiento con dos tipos de betaglucanos aislados de levaduras y hongos, a diferentes concentraciones. Los experimentos probaron el crecimiento y desarrollo de los pollos de engorde y su salud intestinal. Brevemente, los pollos de engorde Fertile Ross 1 de 308 día de edad se asignaron aleatoriamente por sexo (macho y hembra) en un experimento completo de diseño de bloques aleatorios en un diseño factorial de 3 × 2 para un ensayo de alimentación de 5 semanas. Los pollos de engorde se sometieron a una dieta comercial estándar suplementada con diferentes niveles de betaglucanos: sin betaglucanos (control), betaglucanos en una proporción de 250 mg/kg y 1 g/kg de alimento se mezclaron con un alimento comercial estándar (alimento básico). El primer experimento in vivo fue en febrero de 2021 en el gallinero experimental de la Facultad de Agricultura en Rehovot, Israel. Se dividieron 150 pollos según el sexo (75 machos y 75 hembras) y se subdividieron en tres grupos de tratamiento. Control, 250 mg/kg de betaglucanos (Glucan #300, 89% betaglucanos), 1 g/kg de glucanos alimento. El segundo experimento in vivo se llevó a cabo en abril de 2022. Se dividieron 60 pollos según el sexo (30 machos y 30 hembras) y se subdividieron en tres grupos de tratamiento. (1) Controlar (2) 250 mg/kg de betaglucanos de levadura y hongos cultivados, en una proporción de 3:1 de levadura a hongo en el alimento; (3) 1 g/kg de betaglucanos de levadura y setas cultivadas en una proporción de 3:1 entre levaduras y setas en el pienso. Este régimen de alimentación se eligió en base a los resultados preliminares en un pequeño número de aves (no mostradas) que demostraron efectos positivos en los parámetros medidos para los betaglucanos de levadura. A la edad de 35 días se sacrificaron aves y se crearon portaobjetos de parafina como se describe a continuación. Durante todo el período del experimento, todas las aves tuvieron libre acceso a alimento y agua. Las aves se criaron en dos salas de cría en el suelo divididas en 15 corrales, cada uno con una densidad de 10 aves por corral para cada sexo. La temperatura ambiente se regulaba y ventilaba de forma centralizada. Todos los pollos de engorde fueron expuestos a un fotoperiodo de 23 L:1D. A los 35 días de edad, las aves fueron sacrificadas por CO₂ asfixia, y se le practicó la autopsia. Se obtuvieron segmentos del intestino delgado y se fijaron en una solución de formalina tamponada al 4%. Se cortaron secciones transversales seriadas de 4 μm del íleon y el yeyuno y se tiñeron para su evaluación morfológica (tinción H&E). La longitud de las vellosidades y el número de células caliciformes se midieron y contaron con el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, versión 1.53s).

2.3.1. Ácido peryódico azul alcián: tinción de Schiff (AB-PAS)

La tinción con AB-PAS de las secciones incluidas en parafina y de los portaobjetos fijados en formol se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante [Kit de tinción de ácido peryódico-Schiff (PAS) (Laboratorios Scytek)]. Brevemente, se añadió una solución de ácido acético al 3% gota a gota sobre las secciones de tejido, seguida de 5-10 gotas de solución de azul alcián (pH 2,5). Los portaobjetos se tiñeron durante 25-30 minutos y luego se añadieron 5-10 gotas de la solución de ácido peryódico durante 5 minutos. Los portaobjetos se enjuagaron y se añadieron con la solución de Schiff durante 20 min, seguido de la tinción con hematoxilina. Las secciones se montaron y visualizaron bajo el microscopio y las células caliciformes se contaron manualmente.

3. Estadísticas

Todas las estadísticas se realizaron en JMP pro 14 (SAS Institute Inc., Cary, Carolina del Norte, 1989-2019); Los datos se expresan como media ± EE. La comparación entre medias de más de dos grupos se analizó mediante ANOVA de medias y HSD de Tukey.

4. Resultados

4.1. Incubación de macrófagos HD11 con algas β-glucanos

De los 11 genes analizados, 6 mostraron expresión diferencial en respuesta a la exposición a LPS. La expresión se probó en diferentes momentos. TNFα, IL4, IL6, INFγ, Citocromo C y BAX expresaron su máxima expresión después de 4 h de incubación con 100 ng/ml de LPS (Figura suplementaria 1). La IL8 mostró una expresión máxima a las 8 h con 100 ng/ml de LPS (Figura suplementaria 1D), la citocina antiinflamatoria IL10 alcanzó su punto máximo después de 2 h con 200 ng/ml de LPS (Figura suplementaria 2A), BCL-2 alcanzó su punto máximo después de 24 con 200 ng/ml de LPS y la caspasa 9 después de 4 h con 200 ng/ml también (Figuras suplementarias 3A, B). iNOS₂ aumentó significativamente después de 8 h y 50 ng/ml de LPS (Figura suplementaria 3C).

Los betaglucanos de algas estimularon la expresión génica dependiente de la dosis de TNFα e IL4. La expresión máxima obtenida para TNF-α (Figura 1A) se detectó a 5 mg/ml después de 8 h de incubación y a 1 y 5 mg/ml durante 24 h de incubación. Para IL4, la expresión más alta se alcanzó a 5 mg/ml durante 8 h, seguida de 1 y 5 mg/ml durante 24 h (Figura 1B).

Se mostró un patrón de expresión similar para IL6 e IL10 (Figuras 2A, B), donde la expresión alcanzó su punto máximo a las 8 h y 5 mg/ml, mientras que para IL8 e iNOS₂ los niveles más altos se detectaron a las 24 h (Figuras 2C, D). Los resultados indican una regulación positiva de la expresión génica de citoquinas resultante de la incubación con betaglucanos de algas.

4.1.1. Liberación de óxido nítrico

El óxido nítrico es una molécula importante relacionada con los efectos antimicrobianos de los macrófagos y es un indicador químico de la respuesta inflamatoria. La liberación de NO fue significativamente diferente de los niveles de control después de la exposición a 1 mg/ml de betaglucanos de algas durante 24 h. La liberación de NO después del estímulo con LPS a una concentración de 100 ng/ml durante 4 h de estimulación no mostró diferencias significativas con respecto al control; sin embargo, después de 8 h fue significativamente diferente del control. La liberación de NO al medio después de la exposición a betaglucanos de algas a una concentración de 1 mg/ml durante 24 h fue significativamente mayor que incluso después de la exposición a LPS durante 4 h y durante 8 h (Figura 3).

4.2. Comparación de los betaglucanos extraídos de algas y setas

El análisis del contenido de glucanos reveló que los extractos de algas consistían en un 59,4% de betaglucanos, mientras que los extractos de hongos contenían un 8,5% de betaglucanos. Los macrófagos HD11 se incubaron con 1 mg/mL de cada extracto durante 24 h.

4.2.1. Expresión génica

La expresión de TNFα fue significativamente mayor que la del control después de la exposición a betaglucanos de algas, pero no se midió la expresión significativa cuando se expuso a betaglucanos extraídos de hongos (Figura 4A). La expresión de IL4, IL6 e IL8 fue significativamente diferente de la del control después de 24 h de exposición a betaglucanos de algas y betaglucanos de hongos (Figuras 4B-D). La expresión de IL10 fue significativamente diferente de la del control después de la exposición a los betaglucanos de los hongos, pero no se midió la expresión significativa cuando se expuso a los betaglucanos de las algas (Figura 4E). Las iNOS, de manera similar a IL4, IL6 e IL8, se expresaron significativamente en el control después de 24 h de exposición a betaglucanos de algas y hongos (Figura 4F).

4.2.2. Creación con óxido nítrico

La liberación de NO al medio después de la exposición a betaglucanos de hongos o algas durante 24 h, y 1 mg/ml de betaglucanos, fue significativamente mayor en comparación con el grupo control. Los betaglucanos de algas indujeron una liberación de más NO que los grupos expuestos a LPS durante 4 u 8 h. Estos resultados son consistentes con nuestros resultados previos relacionados con la expresión génica del NO. Por el contrario, la cantidad de NO liberada después de la exposición a los betaglucanos de hongos fue significativamente diferente del grupo expuesto a 4 h de LPS, pero no del expuesto a 8 h de LPS (Figura 5).

4.2.3. Fagocitosis

Para examinar la actividad de la fagocitosis, las células HD11 se incubaron durante 1 h con 1 mg/ml de betaglucanos de hongos o algas o 100 ng/ml de LPS. La fagocitosis se midió utilizando pHrodo™ Red Zymosan BioParticles («Zymosan», Life Technologies, EE. UU.) después de 60 minutos (Figura 6). Los betaglucanos de algas y hongos aumentaron significativamente la actividad de fagocitosis en comparación con el control en ambos momentos. El LPS aumentó significativamente la actividad de fagocitosis del control solo después de 60 min (Figura 6).

4.2.4. Tamaño de Vili

El aumento de la altura de las vellosidades afecta directamente a la capacidad de absorción de nutrientes en el intestino, ya que aumentaría la absorción y la superficie (24). La altura de las vellosidades se definió como la distancia desde la punta de las vellosidades hasta la unión de la cripta. Las mediciones de las vellosidades tomadas del íleon femenino no mostraron diferencias entre el tratamiento con glucano #300 betaglucanos para el control (Figura 7A, Figura suplementaria 4). La longitud de las vellosidades masculinas del íleon fue significativamente mayor en ambos grupos de tratamiento en comparación con el control (Figura 7B). Las mediciones de las vellosidades femeninas y masculinas del yeyuno mostraron diferencias significativas entre el tratamiento con glucano #300 betaglucanos al control (Figuras 7C, D).

4.2.5. Recuento de células caliciformes

El número de células caliciformes del íleon y el yeyuno de las hembras mostró diferencias significativas entre ambos tratamientos, 1 g/kg y 250 mg/kg, con betaglucanos a control (Figuras 8A, C, Figura suplementaria 5). Estos resultados también fueron evidentes en el grupo masculino (Figuras 8B, D).

4.3. Efecto de una combinación de glucanos de levadura y mushroon

Las mediciones de las vellosidades tomadas del yeyuno femenino mostraron diferencias significativas entre el tratamiento con betaglucanos y el control. La longitud de las vellosidades femeninas y masculinas del yeyuno fue significativamente mayor en ambos grupos de tratamiento en comparación con el control (Figuras 9A, B). El número de células caliciformes encontradas en el yeyuno de las hembras mostró diferencias significativas entre ambos tratamientos, 1 g/kg y 250 mg/kg de betaglucanos en comparación con el control (Figura 9C). Estos resultados también se observaron en el grupo masculino (Figura 9D). Se obtuvieron resultados similares para las mediciones de la longitud del íleon y el número de células caliciformes (no se muestran).

5. Discusión

Las infecciones bacterianas en las aves de corral son una preocupación esencial tanto para la salud animal como para la productividad. El tratamiento actual en la avicultura depende en gran medida de los antibióticos para prevenir los brotes de enfermedades (2). Se sabe que más del 60% de todos los antibióticos producidos en todo el mundo se utilizan en la producción animal con fines terapéuticos y no terapéuticos (25). El uso masivo de antibióticos condujo a un mayor riesgo de resistencia a patógenos. El resultado ha sido la retirada de varios antibióticos de la caja de herramientas disponible para los productores avícolas (9). El riesgo potencial de resistencia a los antibióticos dio lugar a la prohibición de algunos antibióticos como aditivos alimentarios por parte de la Unión Europea a partir del 1 de enero de 2006. Desgraciadamente, esta prohibición ha dado lugar a un deterioro de la sanidad animal y a una mayor variabilidad de las enfermedades (26).

Los betaglucanos son polímeros de glucosa que pueden derivarse de las paredes celulares de levaduras, bacterias, hongos y cereales (27). Existe una variación considerable en la estructura de los betaglucanos de estas diferentes fuentes, lo que en última instancia da lugar a diferencias en sus funciones fisiológicas (28). Los efectos de los betaglucanos como inmunomoduladores biológicamente activos han sido bien observados en especies de mamíferos; Si bien los sistemas inmunológicos de los mamíferos y las aves son similares, son lo suficientemente diferentes como para que sea difícil extrapolar la investigación en mamíferos a las aves de corral. Investigaciones recientes muestran que los betaglucanos pueden desempeñar un papel en la sustitución de los antibióticos y en la estimulación del sistema inmunitario en la industria avícola (16).

La suplementación dietética de betaglucanos de la pared celular de la levadura indujo un aumento de peso moderado en el bazo y la bolsa de Fabricio (12). Por el contrario, Cox et al. (16) no encontraron diferencias significativas en el peso corporal total y en la ganancia de peso corporal entre los grupos de tratamiento con betaglucanos. Estos resultados inconsistentes podrían atribuirse a varias razones, como las diferencias en la fuente del betaglucano, la presencia y el tipo de desafío utilizado, o ambos. Como tal, enfatiza la importancia de una mayor investigación para determinar la dosis óptima de suplementación con beta-glucano para obtener resultados consistentemente favorables en las aves de corral.

Los resultados del presente estudio sugieren que la incorporación de betaglucanos en la dieta de los pollos mejora significativamente la salud intestinal al preparar la función de los macrófagos intestinales y, por lo tanto, afectar la morfología y función intestinal, lo que resulta en inmunomoduladores antiinflamatorios efectivos. La suplementación con betaglucano beneficia el número de células caliciformes y la altura de las vellosidades tanto en el yeyuno como en el íleon. Además, la suplementación con betaglucanos aumentó la función fagocítica de los macrófagos y mejoró la respuesta inmunitaria al alterar los perfiles de citoquinas de los pollos. Como se ha mencionado anteriormente, durante la ingestión los betaglucanos llegan al intestino y de su paso a través de los parches de Peyer al GALT, y posteriormente, son transportados por todo el cuerpo (9). De esta manera, los betaglucanos de los alimentos pueden estimular directamente a los macrófagos y afectar su secreción de moléculas relacionadas con el sistema inmunológico.

Los macrófagos de pollo son las células presentadoras de antígenos más potentes capaces de resistir a microorganismos patógenos exógenos (14). Se ha demostrado que la suplementación dietética con betaglucanos a las aves de corral estimula la fagocitosis, lo que finalmente suprime la invasión del patógeno en los órganos (29). Además, la suplementación con betaglucano aumentó la función fagocítica de los macrófagos, como mostramos aquí y como se ha publicado anteriormente (30).

Los macrófagos han sido ampliamente estudiados en varias especies de mamíferos, pero se ha prestado poca atención al estudio de los macrófagos aviares. Nuestro experimento in vitro se llevó a cabo utilizando macrófagos originados a partir de una línea celular de macrófagos de pollo transformada, HD-11. Hasta donde sabemos, no se realizó ninguna investigación previa utilizando la línea celular de macrófagos HD-11 para probar el efecto de los betaglucanos. Se analizaron otras líneas celulares para determinar el efecto de los betaglucanos, principalmente células de macrófagos MQ-NCSU de pollo (30).

Para comprender el efecto inmunomodulador de los betaglucanos se utilizó la línea celular de macrófagos de pollo HD-11. Medimos la expresión de 6 genes en diferentes momentos y concentraciones. Se midió la expresión significativa del control con los 6 genes (TNFα, IL4, IL6, IL8, IL10 e iNOS₂). Para estimular la respuesta máxima de secreción, se opta por utilizar una concentración de 1 g/ml de betaglucanos durante 24 h de incubación (Figuras 1, 2). Al comparar los betaglucanos de levadura con los β-glucanos de hongos, la expresión de IL4, IL6, IL8 e iNOS fue significativamente mayor que la del control después de 24 h de exposición a betaglucanos de algas y hongos (Figura 4). La expresión de IL10 fue significativamente diferente de la del control después de la exposición a los betaglucanos de los hongos, pero no se midió la expresión significativa cuando se expuso a los betaglucanos de las algas (Figura 4F). Zhang et al. (31) observaron un aumento cuadrático en los niveles de citoquinas de TNFα e IFN-γ en el suero sanguíneo de los pollos después de ser alimentados con 50 o 75 mg/kg/alimento de betaglucanos. La suplementación con betaglucano durante 7 días después de la eclosión reguló la expresión de IL4 en el duodeno, el yeyuno y el íleon. Para el día 14, la expresión de IL4 estaba regulada al alza en el duodeno y el íleon (16). Queiroz et al. (32) informaron que una concentración de 50 mg/kg/beta-glucano alimentado de hongos aumentó el nivel de IL10 concomitantemente con una reducción de IFN-γ, en pollos de aves de corral.

Por el contrario, en comparación con los controles no suplementados, se demostró que los pollos de engorde que recibieron betaglucano de levadura regulaban a la baja la IL8. La regulación a la baja del gen IL8 con la suplementación con beta-glucano sugiere que el beta-glucano funciona como un inmunomodulador antiinflamatorio (16). Qureshi et al. (30) informaron que no se observó bioactividad detectable de IL6 en sobrenadantes de cultivo de macrófagos con o sin exposición a beta-glucano. Este resultado puede explicarse porque su experimento se llevó a cabo utilizando la línea celular de macrófagos MQ-NCSU, que se deriva del bazo y puede no expresar IL6, en contraste con HD11, que se deriva de la médula ósea de pollo y expresa IL6. Sugerimos que se tenga cuidado con los diferentes datos publicados con respecto a los diversos efectos causados por los betaglucanos. Dado que muchos productos pueden denominarse betaglucanos, es probable que la composición y la conformación analítica difieran de una fuente a otra, lo que puede influir en la gran variedad de respuestas observadas.

El NO es una molécula importante en los efectos antiinflamatorios y antimicrobianos de los macrófagos y es un indicador químico de inflamación y enfermedades inflamatorias. La iNOS se induce en los tejidos inflamados y genera cantidades relativamente grandes de NO (33).

Cuando se exponen a antígenos o agentes quimiotácticos, los macrófagos comenzarán a expresar iNOS. Esta enzima conduce a la producción de NO, que posteriormente reaccionará con aniones superóxido para generar derivados tóxicos, lo que permite a los macrófagos matar de manera competente varios tipos de patógenos (34). La regulación positiva en iNOS implica una mayor capacidad de los macrófagos para matar patógenos invasores, lo que permite al huésped eliminar las amenazas infecciosas de manera más eficiente (16). La exposición a beta-glucanos aumentó la liberación de NO en la fracción sobrenadante del cultivo de macrófagos de pollos de engorde, lo que sugiere que los beta-glucanos pueden inducir una actividad de óxido nítrico sintasa similar a la de otros activadores de macrófagos conocidos, como el LPS (35). Se midió la liberación de NO al medio después de la exposición a 1 mg/ml de betaglucanos de hongos o algas durante 24 h o 100 ng/ml de LPS durante 4 y 8 h. Los resultados mostraron una liberación de NO significativamente mayor para todos los grupos de tratamiento que la cantidad liberada del grupo de control no tratado. La exposición a betaglucanos de algas indujo la liberación de más NO que los grupos expuestos a LPS durante 4 u 8 h (Figura 3). Estos resultados fueron consistentes cuando se comparó la liberación de beta-glucano NO de algas y hongos (Figura 5) y la expresión significativa del gen de la óxido nítrico sintasa (iNOS) después de la exposición a beta-glucanos durante 24 h (Figuras 2D, 4F).

Los macrófagos son una de las células inmunitarias innatas de primera respuesta ante una nueva infección, como se ve en los modelos de infección que muestran que la infección causa un rápido aumento en el número de macrófagos (36). Pueden fagocitar bacterias y, posteriormente, producir compuestos multifuncionales, incluidas especies reactivas de oxígeno (ROS), óxido nítrico (NO) y citoquinas, para matar los microorganismos infecciosos y enviar señales a otras células inmunitarias para establecer una respuesta adecuada a la infección (37). Además, los macrófagos activados pueden producir NO, que desempeña un papel importante en la defensa del huésped contra la infección microbiana, y actuar como moléculas efectoras para matar patógenos invasores (38). La liberación de NO al medio después de la exposición a los betaglucanos se observó en nuestra investigación y puede explicarse por el aumento de la actividad de la fagocitosis. Se han descrito muchos estudios sobre la actividad fagocítica de los macrófagos de los mamíferos, pero los datos disponibles para los macrófagos de los pollos son limitados.

Además de la eliminación intracelular de patógenos, los fagocitos profesionales desempeñan un papel importante en la modulación de la respuesta inmunitaria mediante la expresión de citoquinas y quimiocinas. Por ejemplo, indujo citoquinas proinflamatorias IL8 así como citoquinas inflamatorias IL6 (38), que también se observó en nuestra investigación. La fagocitosis es un proceso complejo que involucra un conjunto diverso de receptores que pueden estimular la fagocitosis. Las células se incubaron durante 1 h con 1 mg/ml de betaglucanos de hongos o algas o 100 ng/ml de LPS. Los betaglucanos de algas y hongos aumentaron significativamente la actividad de fagocitosis del control (Figura 6). A partir de los siguientes datos, se puede concluir que los β-glucanos tanto de algas como de hongos pueden provocar una respuesta proinflamatoria en macrófagos aviares HD-11. Esta leve respuesta proinflamatoria puede preparar a los macrófagos para que sean activos para infecciones putativas posteriores.

Las vellosidades intestinales más largas indican una mejor capacidad para absorber nutrientes en el intestino y pueden explicar el aumento del peso corporal (39). Las criptas de las vellosidades contienen varias células especializadas, incluidas las células absorbentes, las células caliciformes y las células regenerativas, que son responsables de la producción de moco y el reemplazo de las células viejas (15). La evaluación de la morfología de las vellosidades intestinales es importante ya que el intestino delgado es el sitio principal para la asimilación de nutrientes y, por lo tanto, es sensible a los cambios en la dieta (40). Las mediciones de las vellosidades tomadas del íleon femenino no mostraron diferencias entre el tratamiento con betaglucanos y el control (Figura 7A). La longitud de las vellosidades masculinas del íleon fue significativamente mayor en comparación con el control (Figura 7B). Las mediciones de las vellosidades femeninas y masculinas del yeyuno mostraron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento a control (Figuras 7C, D, 9A, B). En correlación con nuestros hallazgos, varios estudios también han observado que la administración de beta-glucano de levadura en la dieta a los pollos resultó en una mayor altura de las vellosidades en el yeyuno en comparación con los pollos alimentados sin beta-glucano (40-42). Confirmando nuestros estudios, Solís de Los Santos et al. (15) encontraron que la altura de las vellosidades del íleon, el área superficial, el grosor de la lámina propia, la profundidad de la cripta y la densidad de las células caliciformes se vieron aumentados debido al consumo de betaglucanos de extracto de levadura como suplemento dietético.

El revestimiento intestinal proporciona la barrera de defensa innata contra la mayoría de los patógenos intestinales. Las células caliciformes de la mucosa intestinal secretan moco que proporciona la primera línea de defensa contra las lesiones intestinales (9). La capa de moco protege la superficie intestinal de la invasión de bacterias entéricas, toxinas bacterianas y ambientales, y algunos componentes de la dieta que pueden dañar la mucosa (15, 42, 43). Cuando se altera la capa de moco, la adhesión de los microbios a la superficie epitelial intestinal puede aumentar la permeabilidad epitelial y reducir la absorción de nutrientes (44, 45). En este trabajo se midió si el número de células caliciformes se vio afectado por el tratamiento con betaglucano. El número de células caliciformes del íleon y el yeyuno de los machos y hembras mostró diferencias significativas entre los tratamientos con betaglucanos para el control (Figuras 8A-D, 9C, D). La administración de betaglucano en la dieta aumentó significativamente el número de células caliciformes en el yeyuno y el íleon. Las células caliciformes son un tipo de células epiteliales de la mucosa intestinal cuya función principal es sintetizar y secretar moco. La producción y secreción de mucina son importantes para mantener la barrera mucosa. Se ha demostrado que una amplia gama de factores, como la alimentación, los microbios, los productos microbianos, las toxinas y las citocinas, regulan estos procesos, afectando así a la barrera mucosa (44-46). En correlación con nuestros hallazgos, estudios anteriores también encontraron que la suplementación con beta-glucano aumentó significativamente el número de células caliciformes en el yeyuno de los pollos (15, 41). Esto sugiere que la suplementación con betaglucano de los piensos para aves de corral desempeña un papel importante en la mejora de su salud intestinal durante un desafío bacteriano.

6. Conclusiones

Acumulativamente, nuestros resultados indican que los betaglucanos pueden influir en los perfiles de expresión de citoquinas, lo que indica que los macrófagos aviares pueden expresar receptores de beta-glucanos. Concluimos que los betaglucanos de algas y hongos modulan de manera diferente la expresión de citoquinas asociadas con la respuesta inmune, lo que sugiere que el uso de los dos tipos de betaglucanos puede resultar en una respuesta inmune más amplia.

Nuestros hallazgos son importantes ya que un intestino más sano indica una mejor digestión y absorción de nutrientes y, por lo tanto, un sistema inmunológico que funciona de manera saludable. De manera similar, extrapolando nuestros hallazgos a configuraciones humanas, la justificación del uso de adyuvantes en las formulaciones de vacunas para mejorar la eficacia de la inmunidad adaptativa es ampliamente aceptada, sin embargo, se ha prestado poca atención a los efectos directos de los adyuvantes sobre la inmunidad innata y la protección temprana contra la infección (15, 44). Como tales, los betaglucanos pueden mejorar la resistencia a las infecciones humanas agudas o crónicas y reducir el uso generalizado de antibióticos.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional: «El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité de ética de la Universidad Hebrea de Jerusalén. El experimento se llevó a cabo en la unidad avícola y en los laboratorios de investigación de la Facultad de Agricultura, Alimentación y Ciencias Ambientales de Israel. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo el cuidado y la supervisión del Prof. Israel Rozenboim. Código de protocolo AG-20-16348-4, número de aprobación de los NIH OPRR-A01-5011, fecha de aprobación, 28/10/2020.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración ética

El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Hebrea de Jerusalén. El experimento se llevó a cabo en la unidad avícola y en los laboratorios de investigación de la Facultad de Agricultura, Alimentación y Ciencias Ambientales de Israel. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo el cuidado y la supervisión del Prof. Israel Rozenboim. Código de protocolo AG-20-16348-4, número de aprobación de los NIH OPRR-A01-5011, fecha de aprobación, 28/10/2020.

Contribuciones de los autores

Conceptualización: BS, IR y VV. Metodología: HB-D, OG y NC. Redacción y preparación del borrador original: OG, HB-D y BS. Redacción-revisión y edición, supervisión y obtención de fondos: BS e IR. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Financiación

Este estudio contó con el apoyo de una beca del BARD (FONDO BINACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO AGROPECUARIO) No. IS-5241-20 a BS, IR y VV.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2022.1092812/full#supplementary-material

Referencias