1 Introducción

El embarazo temprano es una de las facetas más desafiantes y enigmáticas de la reproducción de los mamíferos. Comprende una fase preimplantacional precaria, en la que el embrión aún no ha desarrollado inserciones placentarias y la madre aún no ha establecido un soporte sistémico estable del estado de embarazo. El embrión temprano se basa en interacciones embrión-maternas localizadas para sobrevivir, incluida la señalización de su presencia al entorno materno y, a su vez, recibir apoyo metabólico a través de las secreciones endometriales. En las mujeres, la pérdida de embriones antes de la implantación se estima en un 10-40% y la pérdida total del embarazo desde la fertilización hasta el parto es de aproximadamente el 40-60% (1). El embarazo equino plantea desafíos similares, ya que se estima que entre el 20 y el 30% de las concepciones fracasan antes de la implantación (2, 3). El papel de la comunicación embrión-madre es particularmente pertinente en el caballo, ya que esta especie presenta un largo período (40-45 días) antes del desarrollo de la placentación definitiva (4), mientras que la señal que facilita el reconocimiento materno del embarazo (MRP) permanece sin descubrir (5). Junto con las proteínas y el miARN, se prevé que los lípidos desempeñen un papel clave tanto en la señalización entre el embrión y el endometrio, como en la nutrición y el apoyo al embrión temprano durante este período temprano (6). Si bien se ha comenzado a investigar la abundancia y función de algunos de estos compuestos en el entorno embrionario, los lípidos secretados que participan en la señalización embrio-materna aún no se han perfilado en ninguna especie de mamífero.

Para el estudio de la Tecnología de Reproducción Asistida (TRA), el caballo es un modelo adecuado para los procedimientos clínicos humanos. Tanto las mujeres como las yeguas son monoovulatorias y tienen una dinámica folicular y una cinética de desarrollo embrionario similares hasta la etapa de blastocisto (7). Además, ambas especies comparten problemas de infertilidad debido a la obesidad y el envejecimiento (8-12), que se cree que influyen en la composición lipídica del ovocito. En comparación con muchas otras especies, el contenido de lípidos de los ovocitos y embriones equinos es notablemente mayor (13, 14). Las gotas lipídicas citoplasmáticas embrionarias, en forma de triglicéridos, representan la fuente de energía más abundante y se acumulan durante el desarrollo embrionario (15). Además, los embriones de las especies equina y humana son particularmente sensibles tanto al ambiente como al ambiente (16-18). En los seres humanos, se ha sugerido que los husos de los microtúbulos son termosensibles (19), y que la integridad del huso puede verse alterada irreversiblemente por la temperatura (20). Esta sensibilidad al entorno de cultivo es particularmente pertinente para la yegua, donde la fertilización in vitro (FIV) efectiva ha demostrado ser un desafío importante y aún no está disponible comercialmente (21, 22). Como tal, la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) es actualmente el único método comercial para producir embriones equinos in vitro. El conocimiento recíproco puede obtenerse a través del estudio comparativo de las TRA equinas y humanas y los tratamientos de infertilidad, ayudando a definir los requisitos óptimos in vitro para la maduración de ovocitos y el cultivo de embriones.

Se espera que los lípidos desempeñen un papel en la señalización materna del embrión. Regulan la ciclicidad reproductiva y están intrínsecamente ligados al embarazo [revisado en Lawson et al. (14)]. Con la alta tasa metabólica del embrión temprano, funcionalmente, los lípidos sirven como fuente de energía primaria, pero también sirven como un andamio de membrana molecular que regula la señalización celular (23). Actuando principalmente a través de sus interacciones con las proteínas, muchas de las vías por las cuales los lípidos modulan estas proteínas aún no se comprenden completamente (24). Por lo tanto, la comprensión de la biosíntesis de lípidos y la estructura hormonal sentará las bases para comprender mejor los requisitos embrionarios y cómo esto puede influir en la señalización materna. En embriones equinos, los investigadores han identificado previamente proteínas secretadas por el embrión equino temprano (25-29), y han intentado identificar un factor MRP putativo secretado por el embrión (30, 31). En un estudio previo sobre el componente proteico del secretoma embrionario, se encontró que las proteínas involucradas en la función de las lipoproteínas y las lipídicas asociadas a los lípidos estaban constantemente sobrerrepresentadas (29). Se ha sugerido que los mediadores producidos por embriones, como el factor activador de plaquetas fosfolípido (PAF), tienen un efecto estimulante temprano (32, 33) y se ha postulado que precursores como el ácido araquidónico y el ácido docosahexaenoico, que son constituyentes esenciales de los lípidos de membrana en otras especies, desempeñan un papel crucial en el desarrollo embrionario equino (34). Estos hallazgos sugieren que los lípidos son potenciales reguladores de la respuesta de señalización embrionaria y, como tales, justifican la investigación del perfil lipidómico de los embriones equinos para las investigaciones sobre MRP. Esto lleva a la hipótesis de que los propios lípidos y las interacciones entre proteínas y lípidos tienen un papel importante en la señalización embrio-materna, así como en el desarrollo del embrión equino.

Además de la señalización materna, en la etapa previa a la implantación del desarrollo, los embriones requieren la biosíntesis de lípidos, particularmente para el metabolismo energético, la construcción de la membrana celular y los eventos de señalización involucrados en la activación génica (34). Está bien establecido que hasta aproximadamente el día 22 después de la ovulación, el embrión equino está encerrado en una cápsula de glicoproteína (35), que cubre el blastocisto equino después de que pierde su zona pelúcida (36). Se cree que la cápsula desempeña un papel protector y participa en la comunicación de la interfaz fetal-materna (37). Es importante destacar que para el estudio de los lípidos, la investigación sugiere que los exosomas y otras vesículas extracelulares secretadas por las membranas del conceptus pueden desempeñar un papel importante en la comunicación equino-embriomaterno durante este período temprano (38). Sin embargo, a pesar de esto, los embriones de cápsula son capaces de producir y continuar secretando prostaglandina E2 y otras prostaglandinas, como PGF2α e IGP₂ (39-41). Más recientemente, se demostró que las enzimas de síntesis de prostaglandinas están involucradas en la motilidad del movimiento hacia adelante impulsado por el embrión, debido a su ubicación en el polo «periembrionario» (42). Las prostaglandinas son autacoides lipídicos derivados del ácido araquidónico por la acción de escisión de la fosfolipasa A2s (PLA2s). Se sabe que los PLA2 están funcionalmente involucrados en diversos eventos celulares, incluido el metabolismo de los fosfolípidos, las funciones inmunes y la transducción de señales, y sus acciones generan mediadores lipídicos bioactivos (43). Esta biosíntesis de novo de lípidos indica que los embriones equinos producen automáticamente su propio suministro de lípidos, contribuyendo directamente al entorno esteroide de la luz intrauterina (44). Tales hallazgos implican el papel de los lípidos y los complejos proteína-lípidos en el apoyo al embrión equino temprano, particularmente en la etapa previa a la implantación. Dado que el componente lipidómico de las secreciones embrionarias no se ha descrito bien, definir qué lípidos liberan los embriones ayudará a delinear las vías de señalización importantes para un embarazo exitoso. Por lo tanto, esta investigación buscó describir de manera integral el perfil de lípidos liberados por embriones equinos tempranos utilizando espectrometría de masas de alta resolución.

La lipidómica es un análisis y caracterización de lípidos a nivel de sistemas. Al igual que otras tecnologías ómicas, como la transcriptómica o la proteómica, la lipidómica es un perfil global de las especies lipídicas presentes en células, tejidos o fluidos corporales extraídos (45). Las aplicaciones de la tecnología lipidómica están evolucionando rápidamente y actualmente permite la detección de una amplia gama de clases y categorías de lípidos y la cuantificación de especies de lípidos. El enfoque también ha proporcionado información valiosa sobre los biomarcadores de la fisiopatología de la enfermedad y ha arrojado luz sobre las funciones biofisiológicas detalladas implicadas en la biología reproductiva (46). Actualmente, el sistema de clasificación LIPID MAPS® organiza los lípidos en ocho categorías: acilos grasos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, lípidos esteroles, lípidos prenol, sacarolípidos y policétidos. Cada categoría puede dividirse en numerosas clases con identidades lipídicas individuales (47). Los avances recientes en la tecnología lipidómica basada en espectrometría de masas han mejorado significativamente la detección de una amplia gama de lípidos (48). La tecnología permite la detección de fluctuaciones diminutas, pero biológicamente significativas, en los niveles de lípidos. Por ejemplo, recientemente se ha utilizado para perfilar el contenido de ácidos grasos de los espermatozoides de diferentes especies (49). Como tal, la precisión de la tecnología lipidómica ahora ofrece oportunidades para responder a muchas de las preguntas que quedan sin respuesta. Por lo tanto, en este estudio pretendemos perfilar los lípidos secretados por el embrión equino temprano en un entorno in vitro, y además, examinar el modelo de cultivo embrionario, mediante la realización de perfiles lipidómicos de los medios de cultivo embrionario.

2 Materiales y métodos

2.1 Inseminación artificial

Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron revisados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Newcastle y aprobados bajo el código australiano para el cuidado y uso de animales con fines científicos (número de aprobación A-2018-804). Las yeguas de raza estándar (n = 3) se alojaron en pastizales. Los ciclos reproductivos y las ovulaciones de las yeguas se controlaron mediante palpación transrectal y ecografía. Ante los signos de ovulación inminente, la ovulación se indujo con un análogo sintético de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), luego se inseminó con semen que contenía al menos 5 × 10⁸ espermatozoides móviles, obtenidos de uno de tres sementales fértiles, extendidos en SpermSafe (Universidad de Newcastle, Callaghan, Australia), y almacenados hasta por 3 días a 17 ° C. Todas las yeguas recibieron el mismo tratamiento rutinario post-cubrición que consistió en una infusión intrauterina con 1 L de solución salina seguida 8 h después por una administración intramuscular de oxitocina.

2.2 Recolección y cultivo de embriones

En la Figura 1 se presenta un resumen visual del procedimiento experimental, desde la recuperación de embriones hasta el análisis de lípidos por espectrometría de masas. Los embriones (n = 3) se obtuvieron mediante lavado uterino transcervical 8-9 días después de la ovulación confirmada, de yeguas de entre 10 y 11 años, según el método descrito por Swegen et al. (29). En resumen, se utilizó un catéter Foley de silicona de calibre francés de 34 pulgadas con un balón de 100 cc y un tubo en Y (MAI Animal Health, Elmwood, WI, Estados Unidos). Para la recolección de embriones, el medio de lavado Emcare Complete Ultra calentado (1000-2000 ml por lavado; ICPbio Reproduction, Auckland, Nueva Zelanda) y se recogió el contenido fluídico uterino a través de un filtro embrionario Em-Con (MAI Animal Health). El contenido del filtro se transfirió a placas de búsqueda y los embriones se recuperaron bajo un microscopio de disección antes de ser transferidos a los medios de transporte. Este medio de transporte consistía en DMEM/F12 tamponado con Hepes (11330-032; Gibco, Grand Island, NY, Estados Unidos) suplementado con albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos al 0,5% p/v (BSA; ICPbio), 10 unidades/mL de penicilina-G y 10 μg/mL de sulfato de estreptomicina. Después del transporte (<30 min) al laboratorio, cada embrión se evaluó morfológicamente y se enjuagó moviendo el embrión a través de placas de medio de cultivo que contenía BSA (DMEM/F12 11320-033 tamponado con bicarbonato; Gibco) con 0,5% p/v de BSA, 10 unidades/mL de penicilina-G y 10 μg/mL de sulfato de estreptomicina, depositado en una gota de 50 μL de medio de cultivo que contenía BSA bajo aceite, e incubado durante 2 a 3 h a 38,5°C en una atmósfera humidificada de 5%_O2, 6% CO₂ y 89%_N2. A continuación, los embriones se lavaron dos veces en un medio de cultivo libre de BSA (DMEM/F12 tamponado con bicarbonato con alcohol polivinílico al 0,1%, 10 unidades/mL de penicilina-G y 10 μg/mL de sulfato de estreptomicina). Finalmente, los embriones se transfirieron a una gota de 50 μL de medio de cultivo libre de BSA bajo aceite y se incubaron a 38,5 °C en una atmósfera humidificada de 5%_O2, 6%_CO2 y 89%_N2. Después de la incubación inicial en un medio que contiene proteínas (BSA), los embriones se cultivaron durante un total de 36 h en un medio libre de proteínas. Dentro de este período de cultivo, se recolectaron medios embrionarios condicionados cada 12 h. En cada punto de colecta, los embriones fueron fotografiados bajo un microscopio estereoscópico (SMZ1500; Nikon Corporation, Kawasaki, Kanagawa, Japón) y se midió su diámetro para verificar el desarrollo y la expansión continuos del blastocisto. A partir de entonces, los embriones se lavaron y se transfirieron a una gota de medio de cultivo fresco libre de BSA antes de ser medidos. El medio condicionado al embrión se centrifugó a 14000 × g durante 5 min para eliminar los desechos, y los sobrenadantes se transfirieron a crioviales, se colocaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta un análisis adicional. También se recopilaron controles de solo medio en cada punto de tiempo.

Figura 1. Resumen visual de los métodos utilizados para perfilar los lípidos liberados y agotados por los embriones equinos. Imagen creada con BioRender.

2.3 Productos químicos y materiales

Todos los disolventes utilizados eran de grado HPLC o superior. Se utilizaron pipetas y tubos de vidrio siempre que fue posible y se minimizó el uso de material plástico durante la extracción de lípidos para evitar la contaminación de las muestras. Los tubos de vidrio y las pipetas de transferencia de vidrio se compraron a Sigma y vWR. Los patrones internos de lípidos (ISTD) se compraron a Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, Estados Unidos). Entre ellos se encuentra la fosfatidilcolina (19:0_19:0), esfingomielina (18:0_12:0), fosfatidiletanolamina (17:0_17:0), fosfatidilglicerol (17:0_17:0), fosfatidilserina (17:0_17:0), ácido fosfatídico (17:0_17:0), ceramida (d18:1, 12:0), diglicérido (1,3 18:0 d5), éster de colesterol (19:0), monoglicérido (17:0), mezcla de triglicéridos d5 (Código Avanti LM-6000), mezcla de diglicéridos d5 (Código Avanti LM-6001), fosfatidilinositol (17:0 14:1), C12 GluCer, C12 sulfátido, C17 ceramida, C17 esfingosina, C17 S1P, C12 C1P, D3 ácido graso C20 y C12 LacCer. Los patrones internos de lípidos se prepararon como una mezcla a 10 pmol/μl en metil-terc-butil éter y metanol (MTBE:metanol, 1:1 v/v).

2.4 Extracción de lípidos

Los lípidos se extrajeron utilizando cloroformo, metanol e isopropanol (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos) y agua ultrapura (Millipore). La extracción lipídica del medio se basó en el método de Bligh y Dyer; brevemente, las muestras medianas se descongelaron en hielo y se transfirieron alícuotas de 80 μL a tubos de vidrio. Se añadieron metanol (600 μL), cloroformo (1.000 μL) y agua ultrapura (500 μL) secuencialmente con vórtice entre cada adición, seguido de un aumento con 10 μL de los patrones internos antes mencionados. A continuación, las muestras se centrifugaron a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente. La fase disolvente inferior se recogió y se transfirió a un nuevo tubo de vidrio utilizando una pipeta Pasteur de vidrio. Se añadió cloroformo (600 μL) a la fase superior, se vortexó y se centrifugó a 900 x g durante 10 min. La fase inferior se recogió y se transfirió al mismo tubo de vidrio y se secó bajo gas nitrógeno. Las muestras de lípidos secos se reconstituyeron en 100 μL de isopropanol/metanol (1:1) y se almacenaron a -80 °C en viales de vidrio LC-MS.

2.5 Espectrometría de masas lipidómica

Los extractos lipídicos (10 μL) se analizaron utilizando un espectrómetro de masas Q-Exactive Plus acoplado a un sistema UPLC U3000 (ThermoFisher Scientific) según los métodos de Phan et al. y Castro-Pérez et al. (50, 51). La cromatografía se realizó a 60 °C en una columna de UHPLC CSH C18 de Waters de 2,1 × 100 mm, 1,8 μM con columna de protección VanGuard. El disolvente A fue acetonitrilo 6:4: agua y el disolvente B acetonitrilo:isopropanol 1:9, ambos con 10 mM de formiato de amonio y ácido fórmico al 0,1%. Brevemente, se realizó un gradiente de 30 min que va del 30 al 100% del solvente B, liberando los lípidos en orden de hidrofobicidad. El eluido de la columna se dirigió a la fuente de ionización por electrospray del espectrómetro de masas, donde se empleó una sonda HESI. Los parámetros de la fuente se optimizaron ampliamente en una variedad de estándares de lípidos antes del análisis. El espectrómetro de masas se ejecutó en modo de adquisición dependiente de datos. Un escaneo de sondeo en el rango de masas de 200 a 1.200 a una resolución de 70 K fue seguido por 10 escaneos MS/MS dependientes de los datos de los iones más intensos del sondeo a una resolución de 15 K. La exclusión dinámica se utilizó para mejorar el número de iones objetivo. El tiempo de ciclo fue de aproximadamente 1 s. Las muestras se analizaron en polaridades positivas y negativas. Las muestras se ejecutaron en un orden aleatorio (generadas con Microsoft Excel) para evitar efectos por lotes y replicados. Los datos se analizaron en el software LipidSearch 4.1.16. Los datos se realizaron en la base de datos estándar LipidSearch con todas las clases comunes de lípidos de mamíferos incluidas. A continuación, los resultados de la búsqueda se agruparon según el tipo de muestra y se alinearon para el análisis diferencial. Los datos alineados, que contenían la identidad de los lípidos, el tiempo de retención y el área máxima, se exportaron al software Excel (Microsoft Corporation, WA, Estados Unidos). La abundancia relativa de lípidos se obtuvo a partir de áreas pico normalizadas a estándares internos. Además, se obtuvieron las identidades derivadas de LipidSearch de la cadena de ácidos grasos (ácido graso, FA1, FA2, FA3), CalcMz, IonFormula, el tiempo de retención (RT) y la intensidad máxima tanto en medios condicionados por el embrión (Tabla Suplementaria S1) como en el experimento de solo medios (Tabla Suplementaria S2).

2.6 Análisis

Los picos de intensidad identificados se filtraron con el umbral m-Score (>5.0) y el filtro de calidad ID (A, B y C). Los aductos incluyeron +H, +NH₄, +Na y + H-H₂O en modo positivo, y -H, +HCOO, -2H y -CH3 en modo negativo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el módulo¹ del software MetaboAnalyst y Excel. Para las comparaciones entre los puntos de tiempo y los grupos de control, se aplicó una prueba t de Student de dos colas con significación estadística establecida en p < 0,05, además de los cambios de pliegue entre las muestras condicionadas por el embrión y las muestras de control solo por medios. Las representaciones gráficas de los datos se generaron utilizando MetaboAnalyst.

2.7 Muestras de solo medios

En un experimento posterior, se examinaron adicionalmente los diversos componentes de los medios de cultivo. Los diferentes componentes de los medios de cultivo se colocaron en una atmósfera humidificada de 5%_O2, 6% de_CO2 y 89% de_N2 durante 12 h a 37°C. Las muestras se incubaron bajo una capa de aceite mineral o sin una capa de aceite mineral e incluyeron DMEM/F12 tamponado con bicarbonato con y sin 10 unidades/mL de penicilina-G y 10 μg/mL de sulfato de estreptomicina. También se incubó aceite mineral puro. Se realizaron medios de incubación bajo aceite para determinar si la incubación bajo aceite afectaba la cuantificación de lípidos. Por lo tanto, se evaluaron un total de cinco componentes/variaciones del medio, además de un agua ultrapura (Millipore) por duplicado. Se analizaron los lípidos extraídos y los picos de intensidad según el medio condicionado por el embrión. Para las muestras de medios solamente, los picos de iones se compararon utilizando análisis unidireccionales para examinar si la incubación bajo aceite, DMEM/F12 o penicilina/estreptomicina influía en la presencia de cada lípido en el medio. La función de bloqueo se utilizó para tener en cuenta las posibles interacciones entre los factores influyentes; es decir, el análisis del efecto de la incubación bajo el aceite se «bloqueó» para detectar la presencia de DMEM/F12, mientras que los análisis para determinar el efecto de DMEM/F12 y la penicilina/estreptomicina se «bloquearon» para la incubación bajo el aceite a fin de eliminar el efecto de estos parámetros como factores de confusión. Finalmente, se compararon los picos de iones lipídicos en el aceite mineral con los de todas las muestras de medios acuosos (el bloqueo de la incubación bajo el aceite es un posible factor de confusión). Estos análisis se realizaron en JMP (SAS Corp., NC) y el valor de p para todos los efectos se estableció en p < 0,05.

3 Resultados

3.1 Experimento con embriones

Los embriones (n = 3) se cultivaron in vitro en un medio libre de proteínas durante un período de 36 h, con una expansión de cada embrión entre un 20 y un 30% de diámetro durante ese tiempo (30,17, 25,40, 20,42%). En los medios secretados recolectados, se registraron un total de 1.077 ID de lípidos en todas las muestras, con 222 ID de lípidos restantes después del filtrado para un alto nivel de confianza. Para este estudio, se examinaron más a fondo los lípidos que eran significativamente diferentes, en los medios condicionados por el embrión frente a las muestras de control solo (p < 0,05) durante al menos un punto de tiempo, y que también tenían un cambio de pliegue mayor que 2, que fueron un total de 79 iones lipídicos individuales (Tabla 1). De estos, se detectó que 55 lípidos individuales eran más abundantes en medios condicionados por embriones (en adelante, lípidos «secretados»), y 24 lípidos individuales se encontraron agotados en medios condicionados por embriones (en adelante, lípidos «agotados»). Los mapas de calor representados (Figura 2) muestran dos poblaciones distintas de lípidos: los que fueron secretados en el medio por los embriones durante el cultivo (Figura 2A) y los que se agotaron del medio durante el cultivo (Figura 2B). De las 55 identidades lipídicas encontradas elevadas en el medio condicionado embrionario (Tabla 1), 30 fueron triacilgliceroles (TGs) (54,5%), 13 fueron ceramidas (23,6%), 4 fueron diacilgliceroles (DGs) (7,3%) también se identificó el colesterol lipídico esterol junto con ubiquinona Co (Q9) y una sola esfingomielina. Los 24 lípidos que se encontraron agotados en el medio condicionado por el embrión fueron 17 DG (70,8 %), 4 TG (16,7 %) y 3 ceramidas (12,5 %). Obsérvese que estos son los números de especies lipídicas individuales identificadas y los porcentajes no representan las cantidades de lípidos secretadas o consumidas por los embriones.

Tabla 1. Especies lipídicas individuales secretadas y agotadas en medios condicionados por embriones según la categoría de lípidos.

Figura 2. Visualización del mapa de calor de la abundancia de lípidos identificados (intensidad máxima media), que representa los picos de lípidos identificados. Los secretados (A) en el medio de cultivo embrionario, y los que se agotan (B) en el medio. Cada columna representa la lectura de un embrión individual, y cada fila representa una identidad lipídica diferente. Los medios se intercambiaron cada 12 h y las muestras condicionadas por el embrión se compararon con los medios de control no condicionados (libres de embriones). La escala de colores del mapa de calor denota la concentración relativa de cada masa lipídica en relación con el mínimo y el máximo de ese lípido para todos los grupos y se muestra en el lado derecho de la figura. Los valores se miden por distancia euclidiana con un algoritmo de agrupamiento de Ward (n = 3 por grupo). *p < 0,05 para cada comparación con un cambio de pliegue mayor que 2.

Además, se llevó a cabo un análisis de parcelas volcánicas para determinar el cambio diferencial de los lípidos individuales entre los grupos, con un punto de corte para aquellos lípidos que tenían un cambio de pliegue >2 y un valor de p <0,1. Esto se hizo para cada punto de tiempo individual, 12 h, 24 h y 36 h. En el grupo de embriones secretados, las ceramidas y las TG fueron las clases predominantes que aumentaron en comparación con el control. Del grupo de lípidos empobrecidos, se observó que los DG eran la clase dominante (Figura 3). En total, las clases de lípidos procedían de 5 categorías de lípidos, incluyendo glicerolípidos, esfingolípidos, glicerofosfolípidos, lípidos de esteroles y lípidos de prenol (Figura 4), observándose una mayor diversidad de clases en los lípidos secretados en comparación con los lípidos empobrecidos. En la Figura 5 se detallan las comparaciones de varios lípidos individuales relevantes, que fueron significativos y tuvieron un cambio de pliegue >2 en el medio condicionado con embriones.

Figura 3. Parcela volcánica de identificaciones de lípidos del medio embrionado secretado (rojo) y agotado (azul). En el eje Y se muestran los lípidos con p < 0,1, con el cambio de pliegue (FC) >2 representado en el eje X y la significación en el eje Y

 

Figura 4. Gráfico circular de las categorías de lípidos secretados (A) y agotados (B) en medios condicionados por embriones.

Figura 5. Lípidos identificados individualmente secretados (A) y agotados (B) en medios condicionados por embriones. Representaciones de los picos de intensidad para especies individuales con diagramas de caja y bigotes. Cada lípido individual es significativamente diferente entre puntos de tiempo y tiene un cambio de pliegue >2. Eje Y: Se muestran las intensidades máximas normalizadas (áreas).

3.2 Experimento de solo medios de cultivo

Se habían utilizado reactivos sin lípidos para preparar medios para experimentos con lipidoma embrionario, por lo que la detección de lípidos agotados después del cultivo de embriones fue inesperada. Por lo tanto, realizamos un análisis de seguimiento varios meses después para validar la presencia de lípidos en medios no acondicionados (control) y sus componentes individuales. Para el experimento de solo medios, se identificaron un total de 137 especies de lípidos presentes en las 5 muestras de medios (DMEM/F12 con y sin 10 unidades/mL de penicilina-G y 10 μg/mL de sulfato de estreptomicina, ambos bajo una capa de aceite mineral o sin una capa de aceite mineral y, por último, aceite mineral puro). Estos pertenecen predominantemente a la categoría de glicerolípidos. De estos, 109 iones lipídicos fueron significativamente diferentes entre los grupos. Una mayor abundancia de 18 lípidos (15 TGs, 2 DGs, 1 PS) se asoció con la inclusión de DMEM/F12 en la formulación (predominantemente glicerolípidos; 94%). La inclusión de penicilina-G/sulfato de estreptomicina en el medio DMEM/F12 no influyó en la abundancia de ninguno de los lípidos detectados. La incubación bajo aceite incrementó la abundancia de 44 especies lipídicas en los medios (90% glicerolípidos; 34 TGs y 5 DGs). En el aceite mineral puro, se detectaron 47 especies de lípidos (es decir, mostraron p < 0,05 frente al control solo con agua). De estos, el 91% eran glicerolípidos (28 TGs y 15 DGs), y el 6% (3) ceramidas. De las 24 DG que originalmente se encontró que estaban agotadas en medios condicionados por embriones, de manera prometedora, solo se detectaron 5 individuos en el análisis de medios de seguimiento. De estos, dos lípidos se detectaron solo en el aceite mineral y fueron influenciados por la incubación bajo aceite mineral [DG (18:0_17:0) + NH4 y DG(18:0_18:1) + NH4]; se detectó un lípido en el aceite mineral, pero no se vio afectado por la incubación bajo el aceite [DG(40:0) + NH4].

4 Discusión

Este estudio utilizó lipidómica basada en espectrometría de masas de alta resolución para examinar los cambios en los perfiles lipídicos de los medios después del cultivo de embriones equinos. Se encontró que un total de 55 especies de lípidos aumentaron significativamente en el medio condicionado por el embrión, en comparación con el control, y por lo tanto se presumió que el embrión las liberó o secretó con el tiempo. Además, se identificó que 24 lípidos estaban significativamente disminuidos en los medios acondicionados por el embrión después de la incubación del embrión en comparación con los controles sin embriones. Se presumía que estos lípidos eran absorbidos o agotados de los medios por los embriones. Una vez identificada esta población de lípidos empobrecidos, se llevó a cabo un análisis más exhaustivo de los medios sin embriones. Esto se llevó a cabo para aclarar qué lípidos o categorías de lípidos eran detectables en los medios de cultivo y, a su vez, de qué componentes del entorno de cultivo provenían. En este estudio posterior encontramos que 109 lípidos fueron aportados por los diversos componentes del medio, siendo la mayoría de ellos glicerolípidos.

En el caso de los lípidos encontrados en los medios embrionados, las categorías de lípidos dominantes identificadas fueron los glicerolípidos (66%) seguidos de los esfingolípidos (23%); las clases de lípidos dominantes fueron los TG (56,6%) y las ceramidas (20,8%). Los que se agotaron de los medios en presencia de embriones tendieron a ser glicerolípidos (88%), y la clase principal de estos resultó ser DG (70,8%). Los grupos lipídicos agotados pueden contribuir a satisfacer las demandas energéticas del embrión, mientras que los grupos lipídicos secretados probablemente estén involucrados en la señalización materna o se liberen en respuesta al estrés o al aumento de la fluidez de la bicapa. Los TG son ésteres que consisten en una columna vertebral de glicerol y tres ácidos grasos; Representan la principal forma de almacenamiento de lípidos en el tejido adiposo y las gotas de lípidos. Los TG se sintetizan en momentos de exceso de energía o se hidrolizan a DG y ácidos grasos para ser utilizados en la generación de ATP en momentos de necesidad energética. Así, desde una perspectiva metabólica, la liberación de TGs por parte de los embriones equinos indica que las reservas de energía pueden ser adecuadas o excesivas. Un examen más detallado de las identidades exactas de los TG que se secretan será importante para dilucidar sus posibles funciones en la señalización embrio-materna. La mayoría de los TG secretados que se identificaron contienen ácidos grasos de cadena media. Se ha demostrado que los ácidos grasos de cadena media aumentan la síntesis de progesterona y mejoran la implantación embrionaria en ratas, aunque a través de un mecanismo de suplementación dietética de ácidos grasos a la madre (52). Vale la pena investigar los efectos directos de los TG de ácidos grasos de cadena media en el endometrio y si su secreción por el embrión es capaz de influir en las vías anteriores a la luteinización y el mantenimiento lúteo, como la reducción de la síntesis de PGF2a. El producto de la hidrólisis TG, DG, consiste en un glicerol unido covalentemente a dos cadenas de ácidos grasos. Por lo general, se encuentran tanto en grasas vegetales como animales, y a menudo se utilizan como emulsionantes (53). Los DG no son solo sustratos metabólicos, sino que pueden activar ciertos receptores sensibles a los lípidos. Las DG celulares pueden unirse a miembros de la familia de las proteínas quinasas C (PKC), lo que conduce a su activación y translocación a la membrana plasmática y la posterior fosforilación de las proteínas que interactúan (54). Se han identificado PKC en embriones en desarrollo, y la inhibición de PKC detiene el desarrollo embrionario más allá de la etapa de ocho a 16 células en embriones bovinos (55). Teniendo en cuenta estas observaciones, es plausible que las DG en los medios de cultivo de embriones o en el líquido uterino de la yegua tengan la capacidad de apoyar el desarrollo del embrión como fuente de energía y como sistema mensajero que activa los procesos de desarrollo a través de la activación del receptor. Como las DG son metabolizadas por la vía de la lipasa para la síntesis de prostaglandinas, se sospecha que las prostaglandinas estimulan las contracciones del miometrio que impulsan el embrión a través de la luz uterina durante los días 10-16 después de la ovulación (39, 56). Si los embriones equinos realmente agotan activamente las DG de su entorno directo, esto puede estar relacionado con su capacidad conocida para producir y continuar secretando prostaglandina E2 y otras prostaglandinas (39).

En este estudio, lo más importante es que varios lípidos individuales aumentaron significativamente y tuvieron un cambio de pliegue de al menos 2 en el medio condicionado por el embrión (Figura 6). El colesterol lipídico de esteroles aumentó en todos los puntos temporales, incluido un aumento aproximado de 8 veces a las 12 h. En la reproducción, el papel del colesterol es esencial en el desarrollo temprano del concebio, ya que mantiene la integridad/fluidez de las membranas celulares y desempeña un papel importante en la señalización celular (57). El lípido modera importantes receptores nucleares, como el factor de transcripción de la fetoproteína, y por lo tanto está involucrado en las vías de señalización más fundamentales durante el desarrollo embrionario (58). El colesterol es también el precursor de todas las hormonas esteroides (59) a partir de las cuales se sintetizan tanto la progesterona como el estradiol a través del esteroide precursor, la pregnenolona. Como tal, la detección de colesterol es particularmente pertinente, ya que la producción de estradiol por parte del embrión equino temprano se considera muy importante para el establecimiento del embarazo (60) con cantidades sustanciales de estrógenos que se sabe que se producen en el día 12 (61, 62). Otro lípido individual, la ubiquinona Co(Q9), que se clasifica como un lípido de prenol (63), se elevó significativamente en los medios en todos los puntos temporales (Figura 6). El Co(Q9) es un componente esencial de la cadena de transferencia de electrones mitocondrial y, por lo tanto, es necesario para la síntesis de ATP. La presencia de estos lípidos y su posterior aumento con el tiempo es alentadora, ya que indica que los embriones están produciendo un perfil lipídico relevante para la bioactividad. La cascada de eventos que ocurren alrededor del momento de la MRP indica que los lípidos, como el colesterol, pueden desempeñar un papel más importante en el establecimiento del embarazo, tanto en términos de lo que el embrión está sintetizando como de cómo el endometrio materno está cambiando en respuesta a dichos precursores.

Figura 6. Identificaciones de lípidos cuya detección se vio influida por la inclusión de DMEM/F12 o por incubación bajo aceite mineral, y aquellos detectados en aceite mineral. Cer, ceramida; CL: Cardiolipina; DG, Diacilglicerol; PS: fosfatidilserina; TG: Triacilgliceroles. Todos los lípidos mostrados son aquellos con una contribución de p < 0,05 de los componentes del medio indicados (según lo determinado por análisis de una vía).

Para las investigaciones sobre la MRP de yegua, los estudios han examinado los cambios en la expresión génica endometrial en respuesta a la presencia de un conceptus durante la MRP (64-68). Se encontró que los genes involucrados en el metabolismo de los lípidos y aquellos que sirven a un proceso biosintético de lípidos están regulados al alza y sobrerrepresentados en el epitelio luminal de yeguas preñadas tempranas (69). El gen transportador de prostaglandinas SLCO2A1, cambia cíclicamente durante el ciclo menstrual en el endometrio humano. En el embrión temprano bovino (70) y en el embrión temprano porcino (71, 72), se ha reportado un aumento. También se encontró que este gen estaba regulado al alza dentro del epitelio luminal de la yegua embarazada (73), lo que destaca la importancia de la expresión génica asociada a lípidos en el momento de la MRP. Curiosamente, muchos de los genes regulados al alza en el epitelio endometrial están involucrados en el metabolismo y la señalización de los esfingolípidos. Se sabe que la ceramida esfingolípida está implicada en la regulación de la proliferación a través de su papel señalizador (74), por lo que las ceramidas secretadas por el embrión, como las encontradas en este estudio, podrían formar parte del mecanismo de señalización embrio-materno que estimula o regula la proliferación de las glándulas endometriales, que apoyan las demandas nutricionales del embrión. Curiosamente, las ceramidas pueden imitar las acciones de la progesterona en la inducción de la maduración de los ovocitos de anfibios in vitro, a través del receptor de progesterona no clásico (membrana) (75). Dado el papel central que desempeña la progesterona en el apoyo al embarazo temprano, la influencia de las ceramidas durante el cultivo in vitro requiere más atención.

Si bien inicialmente nos propusimos perfilar los lípidos aumentados en el medio por la presencia de embriones equinos, los resultados de este estudio demuestran que el medio «libre de lípidos» contenía cantidades consistentemente detectables de lípidos. La detección de picos de lípidos residuales en las muestras de medios de control fue un hallazgo inesperado; Algunos de ellos fueron significativamente más bajos en los medios condicionados por el embrión que en los medios control. El análisis adicional del medio no condicionado confirmó la presencia de numerosos glicerolípidos en los medios de cultivo libres de embriones, la mayoría de los cuales eran DG y TG. Además, los picos de lípidos en el medio no acondicionado aumentaron en respuesta al cultivo bajo aceite mineral, mientras que el propio aceite mineral evidentemente contenía ceramidas, DG y TG, estos fueron hallazgos sorprendentes. Hasta donde sabemos, la alteración de la composición lipídica del medio de cultivo por la superposición de aceite mineral no ha sido descrita anteriormente. Dada la influencia de los lípidos en el desarrollo embrionario preimplantacional, el efecto del cultivo de embriones en medio con y sin una capa de aceite justifica una investigación adicional. Dado que este es el primer estudio lipidómico del secretoma embrionario en mamíferos, la identificación de la posible absorción de glicerolípidos por parte de los embriones es relevante para todos los embriones de mamíferos cultivados in vitro. El origen definitivo de estos lípidos sigue siendo incierto, pero no se puede descartar el DMEM/F12 y el aceite mineral como fuente potencial. Otros posibles orígenes incluyen, entre otros, puntas de pipeta, placas de Petri, crioviales, estreptomicina o la posibilidad siempre presente de contaminación de la muestra durante la manipulación. Proponemos que la fuente predominante de lípidos desconocidos en nuestros medios fue la transferencia del aceite mineral fresco. Además, la identificación de esta población lipídica pone de manifiesto la capacidad de la tecnología para detectar e identificar cantidades diminutas de lípidos en muestras.

Como se ha informado en modelos animales, la composición lipídica del medio de cultivo puede alterar el metabolismo embrionario y la expresión génica y tener consecuencias sobre el desarrollo preimplantacional y la salud de la descendencia resultante después de la transferencia embrionaria (76, 77). La presencia y absorción de una población no especificada de lípidos puede, de hecho, influir en el desarrollo futuro. Dado que las necesidades embrionarias de lípidos durante el cultivo in vitro no se conocen bien, esta área de investigación ha ganado cada vez más atención en la última década. Los estudios en los que los medios de cultivo se suplementaron con diferentes cantidades y/o diferentes tipos de lípidos han demostrado una serie de efectos sobre el desarrollo embrionario en varias especies (78). Cabe destacar que la yegua ha ganado recientemente terreno como un modelo particularmente adecuado para las investigaciones de la fertilidad humana y el embarazo, dado que es un mamífero monoovulatorio con una gestación de una duración similar, así como similitudes pertinentes en la trayectoria de desarrollo embrionario y los mecanismos de pérdida del embarazo (7, 79, 80). En los seres humanos, se ha informado que diferentes medios comerciales de cultivo de embriones alteran la calidad del embrión e influyen en el peso al nacer, y un estudio encontró que complementar los medios de cultivo de embriones con albúmina sérica humana (HSA) que contenían altos niveles de lípidos residuales se correlacionó con peores resultados de embarazo y feto (81). El tipo de lípido es de gran importancia, como lo ilustra la suplementación de los medios de cultivo de embriones con ácidos grasos saturados, que se asoció con estrés metabólico, retrasos en el desarrollo, aumento de la producción de ROS y reducción de las tasas de implantación (81, 82). Además, en el contexto de la comunicación materna, la capacidad de las vesículas extracelulares (VE) para transferir carga molecular, como los lípidos, de una célula a otra ha generado un interés creciente (83), y es relevante para nuestros hallazgos. Se ha señalado que las VE derivadas de embriones son moduladoras de la comunicación embrionaria in vitro (84), y se ha confirmado que los embriones cultivados in vitro secretan VE en su entorno inmediato (84, 85). Dicha investigación sugiere que los lípidos y las moléculas que contienen lípidos, como los liposomas, también pueden ser secretados en forma de EV por los embriones equinos y, por lo tanto, el papel de los EV y la transferencia de lípidos a través de los medios justifica una mayor investigación.

Al reconocer las limitaciones de este estudio, se debe tener en cuenta el pequeño tamaño de la muestra, junto con el potencial del entorno in vitro para inducir una respuesta al estrés. Las condiciones de cultivo in vitro apoyaron el crecimiento continuo del embrión y la supervivencia en este estudio, pero aún así sería prudente suponer que el cambio en el entorno provocó cierto estrés en los embriones. Por lo tanto, no sabemos si la secreción de ceramida que se observa aquí es fisiológica o una respuesta al estrés del cultivo in vitro. En las células del hígado, el músculo esquelético, el corazón, el riñón y el β pancreático, se ha observado una secreción elevada de ceramidas en respuesta al estrés celular y la lipotoxicidad, lo que conduce a la apoptosis (86-88). Los experimentos que examinan los efectos directos de las ceramidas en el endometrio ayudarán a determinar si estas moléculas desempeñan un papel en la señalización embrionario-materna. La lipotoxicidad parece ser una causa poco probable para la liberación de ceramidas en el presente estudio, ya que el medio utilizado para el cultivo de embriones estaba esencialmente libre de lípidos, aunque se detectaron niveles residuales de lípidos en los controles de solo medio. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los embriones tempranos pueden ser muy sensibles al entorno lipídico y es necesario comprender mejor los requisitos y sensibilidades precisos del embrión de mamífero, especialmente en lo que respecta a los lípidos en el entorno embrionario inmediato. Cabe destacar que las fitoceramidas (tCer) son mucho menos abundantes en las células de mamíferos que en las levaduras (89) y se recuperan predominantemente en plantas (90), algunas de las cuales se identificaron en los datos actuales por LipidSearch, utilizando iones de fragmentos de diagnóstico (con todas las clases de lípidos comunes de mamíferos incluidas). Por lo tanto, aunque las células de mamíferos contienen fitoceramidas (91, 92), la localización subcelular de su síntesis sigue siendo objeto de debate. Al igual que con cualquier tecnología emergente, el campo de la lipidómica aún se está perfeccionando. Sería útil realizar un trabajo confirmatorio adicional con análisis de LC-MS específicos utilizando estándares auténticos para confirmar si se trata de fitoceramidas secretadas o mal etiquetadas por el software. Por lo tanto, a pesar de no ser abundante en mamíferos, la identificación de tCers justifica tanto la inclusión en estos hallazgos como la investigación más profunda en el futuro.

En resumen, este estudio presenta el primer perfil lipidómico de alta resolución del secretoma embrionario preimplantacional en cualquier especie de mamífero. Los embriones equinos tempranos liberaron sistemáticamente glicerolípidos, y en particular triglicéridos, en su entorno de cultivo. Si bien las funciones precisas de los lípidos definidos aún no se han investigado, muchos de los lípidos identificados en este estudio tienen roles documentados en la señalización celular, el metabolismo y el desarrollo embrionario. Mientras tanto, una cohorte de lípidos se agotaron de los medios durante el cultivo, predominantemente diglicéridos. Dado que los diglicéridos tienen una capacidad documentada para regular los procesos de desarrollo embrionario, estos hallazgos enfatizan la importancia de un medio de cultivo embrionario definido y la necesidad de identificar con precisión los requerimientos lipídicos del embrión. También destacamos que los medios de cultivo formulados como «libres de lípidos» contienen cantidades detectables de una amplia gama de especies lipídicas, muchas de las cuales son absorbidas por el embrión temprano. Los perfiles descritos aportan nuevos conocimientos sobre el metabolismo y la producción temprana de lípidos embrionarios durante un período crítico del desarrollo preimplantacional, lo que contribuirá a nuestra comprensión del embarazo equino temprano. Una investigación más profunda de los iones lipídicos específicos identificados en este estudio puede aclarar sus roles funcionales en el embarazo equino temprano, así como la absorción de lípidos presentes en el entorno de cultivo de embriones.

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio están incluidas en el artículo/Material complementario, las consultas posteriores pueden dirigirse al autor o autores correspondientes.

Declaración ética

El estudio en animales fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Newcastle. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales.

Contribuciones de los autores

EL: Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Metodología, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. RP: Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Metodología, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. RA: Conceptualización, Supervisión, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. ZG: Conceptualización, Obtención de fondos, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Supervisión, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. CG: Conceptualización, Investigación, Metodología, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. AS: Conceptualización, Curación de datos, Adquisición de fondos, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Supervisión, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición.

Financiación

El/los autor/es declara(n) que se recibió apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Este trabajo contó con el apoyo del Consejo Australiano de Investigación (LP160100824) y el Programa de Caballos Pura Sangre de AgriFutures Australia (PRJ-011748). El salario de Swegen fue respaldado por la financiación del Premio Discovery Early Career Researcher (DE220100121) del Consejo Australiano de Investigación y el salario de Gibb fue respaldado por la financiación de la Beca del Futuro (FT220100557) del Consejo Australiano de Investigación.

Reconocimientos

Los autores agradecen a José Cuenca por proporcionar asesoramiento experto en el análisis estadístico de nuestros conjuntos de datos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda hacer su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2024.1439550/full#supplementary-material

Cuadro complementario S1 | Conjunto de datos completo de iones lipídicos detectados en medios de cultivo condicionados con embriones.

Cuadro complementario S2 | Conjunto de datos completo de iones lipídicos detectados en un experimento de «solo medios».

Notas

Referencias