1 Introducción

Los artiodáctilos silvestres y domésticos son sensibles a la fiebre aftosa, altamente contagiosa. En cuanto a sus posibles efectos socioeconómicos en caso de brote, se encuentra entre las enfermedades animales más importantes (1). El virus de la fiebre aftosa (virus de la fiebre aftosa), el agente etiológico de la fiebre aftosa, es un virus de ARN monocatenario positivo que pertenece al género Aphtovirus de la familia Picornaviridae (2).

La infección por el virus de la fiebre aftosa se caracteriza por la aparición de aftas en los epitelios, un estado de letargo y pérdida de apetito (3). El ganado doméstico, que se cree que es revelador, presenta los signos clínicos con bastante facilidad, mientras que la infección es menos grave en pequeños rumiantes, como cabras y ovejas, que actúan como diseminadores (4). Aunque la mortalidad en animales adultos suele ser baja, puede ser mayor en animales jóvenes, particularmente en lechones, corderos y terneros, debido a la miocarditis aguda (5).

Hasta el 50% de los rumiantes permanecen infectados después de la recuperación clínica. Independientemente de su estado inmunitario particular de la fiebre aftosa, se convierten en portadores asintomáticos (4, 6). Estos portadores sanos constituyen un obstáculo para el control de la fiebre aftosa, ya que representan una fuente potencial de nuevos recombinantes y una amenaza de transmisión del virus de la fiebre aftosa a animales susceptibles (5, 7–9). La persistencia del virus de la fiebre aftosa se define actualmente como la detección de un virus infeccioso después de 28 días después de la infección. Más de 50 años después de que se describiera por primera vez, los mecanismos que subyacen a la persistencia de la fiebre aftosa aún no se comprenden completamente (10). La persistencia diferencial de la fiebre aftosa constituye una de las lagunas de conocimiento que sigue sin resolverse, ya que actualmente no hay datos que expliquen por qué se ha informado de la persistencia de la fiebre aftosa en rumiantes pero no en cerdos (11, 12). En las últimas décadas se han identificado los sitios primarios y persistentes de infección por el virus de la fiebre aftosa y, en particular, el paladar blando dorsal y las amígdalas orofaríngeas en rumiantes (4).

La falta de modelos de estudio adecuados es un obstáculo para mejorar la comprensión de la persistencia del virus de la fiebre aftosa. Los estudios con animales son caros, implican preocupaciones éticas y requieren una gran infraestructura. Desde el desarrollo de métodos in vitro que permiten el crecimiento del virus, varias líneas celulares epiteliales han servido como modelos de estudio (13-17). Entre las líneas celulares estándar utilizadas, las células de lengua de cabra fetal (ZZ-R127) son las únicas establecidas a partir de tejido sensible a la fiebre aftosa. Con el fin de mejorar el estudio in vitro de la fiebre aftosa, Hägglund et al. han desarrollado un modelo celular multicapa derivado del paladar blando dorsal primario bovino (DSP), cultivado en la interfaz aire-líquido (ALI) (18). Se ha demostrado que este modelo in vitro DSP-ALI permitió el establecimiento de una infección persistente por el virus de la fiebre aftosa y contribuyó a una mejor comprensión de las respuestas transcripcionales a la infección por el virus de la fiebre aftosa (19). También se ha establecido un modelo similar desarrollado utilizando células DSP porcinas (20).

Dadas las oportunidades que ofrece este modelo y la falta de un modelo de células ovinas adecuado, aislamos células primarias de las amígdalas palatinas ovinas (PT) y del paladar blando dorsal para crear un modelo de cultivo multicapa en la interfaz aire-líquido. Para estudiar la infección aguda y a largo plazo por el virus de la fiebre aftosa en células ovinas relevantes, primero caracterizamos estas células y luego las infectamos como monocapas y luego como multicapas.

2 Materiales y métodos

2.1 Virus

El clon 2.2 del FMDV O/FRA/1/2001 (GenBank: OV121130.1) utilizado en este estudio es un clon viral purificado dos veces en placas derivado de la cepa O/FRA/1/2001 que se propagó posteriormente en células BHK-21 (14).

2.2 Aislamiento de células epiteliales de las amígdalas palatinas ovinas y del paladar blando dorsal

Se recolectó tejido epitelial del PT y del DSP inmediatamente después del sacrificio de cuatro ovejas. Las células derivadas de las cuatro ovejas se han tratado de forma independiente. Se realizó una disociación del epitelio superficial para eliminar la mayor cantidad posible de tejido conectivo y muscular. El tejido epitelial se diseccionó y se digirió a 4 °C durante la noche en un medio de incubación como se detalla en Hägglund et al. (18).

2.3 Multicapas de interfaz aire-líquido

El cultivo celular en la interfase aire-líquido se realizó según lo descrito por Hägglund et al. (18). Las células del paladar blando dorsal ovino y las células de las amígdalas palatinas se descongelaron e inmediatamente se sembraron en las plantillas rehidratadas a una densidad de 1 x 10⁶ células por plantilla. Después de 4 semanas, cuando las células formaron una monocapa completa, el medio de cultivo se retiró del compartimento superior. El medio de cultivo contenido en el compartimento inferior se cambió cada 2 o 3 días durante 5 semanas.

2.4 Caracterización celular

Se analizó la expresión celular de marcadores epiteliales y mesenquimales como la citoqueratina y la vimentina, así como la de la integrina α_{Vβ 6}, el receptor específico del virus de la fiebre aftosa, tras cinco pasos celulares en matraces de cultivo, según lo descrito por Sarry et al. (20).

Las multicapas celulares se caracterizaron según lo descrito por Hägglund et al. (18).

2.5 Inoculación del virus de la fiebre aftosa de monocapas celulares

Las células ovinas DSP y PT se propagaron en matraces de cultivo durante cuatro pasajes antes de ser sembradas en placas de 48 pocillos a una densidad de 1 × 10⁵ células por pocillo en medio completo DMEM. Una vez que las células formaron una monocapa completa, se tripsinizaron dos pocillos para contar las células y ajustar la multiplicidad de infección (MOI). El inóculo viral del clon 2.2 de FMDV O/FRA/1/2001 se diluyó en MOI ^10-2, MOI ^10-4 y MOI ^10-6 en un medio completo DMEM libre de suero. El inóculo viral no se ha retirado de los insertos hasta la primera recolección de muestras. El seguimiento de la infección se realizó de la misma manera que se describe en Sarry et al. (20).

2.6 Inoculación del virus de la fiebre aftosa en células multicapa

Las células DSP ovinas se cultivaron en insertos durante 5 semanas y posteriormente se inocularon con FMDV O/FRA/1/2001 Clon 2.2 a MOI 10⁻⁴ o se incubaron con medio acondicionado. El seguimiento de la infección se realizó de la misma manera descrita en Sarry et al. (20).

2.7 Análisis del sobrenadante del cultivo

Los sobrenadantes de cultivo recolectados durante la infección se analizaron para la detección de virus infecciosos, antígeno^pol 3D del virus FMDV y ARN^pol 3D, como se describe en Hägglund et al. (18).

3 Resultados

3.1 Las células DSP y PT ovinas son células epiteliales cultivables in vitro

Las células primarias derivadas de DSP y PT ovinas se aislaron en placas de cultivo y luego se propagaron. Las células DSP fueron bastante más fáciles de separar durante la etapa de tripsinización que las células PT y parecen desarrollarse un poco más rápido. La morfología de las células PT y DSP se examinó bajo un microscopio de campo claro (Figura 1A). Observamos células que tenían una forma parecida a las células epiteliales, con morfologías poligonales o de adoquín y contornos bastante irregulares (21).

Figura 1. Caracterización de células DSP y PT ovinas. (A) Observación morfológica de DSP y PT. Las células DSP y PT se cultivaron en monocapas y se observaron bajo microscopía de campo claro (×100). (B) Tinción de citoqueratina. DSP y PT se cultivaron en monocapas en portaobjetos de cámara High ibiTreat Ibidi. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst (azul) y las células se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio DMi8. Tinción con anticuerpo específico contra la citoqueratina del ratón y una cabra anti-ratón Alexa 488 (verde). La tinción de DSP se comparó con la línea celular epitelial ZZ-R127 que se sabe que expresa fuertemente citoqueratina y la línea celular endotelial BUcEC que se sabe que no expresa citoqueratina. (C) Tinción de vimentina. Las DSP se tiñeron con un anticuerpo específico de vimentina de ratón y una Alexa 488 (verde) anti-ratón de cabra. La tinción DSP se comparó con la línea celular epitelial ZZ-R127. (D) Tinción de integrinas_{α V}β₆. Las DSP se tiñeron con un anticuerpo específico de citoqueratina de ratón y una Alexa 488 (verde) anti-ratón de cabra.

Después de cinco pasajes, las células se caracterizaron por IF. La inmunotinción con anticitoqueratina dio lugar a una señal positiva inferior a la asociada con el control positivo basado en células ZZ-R127. Si bien se demostró que casi todas las células ZZ-R127 expresan citoqueratina, solo el 30% de las células DSP y el 40% de las células PT parecen expresar este marcador de proteína epitelial. La tinción realizada con células endoteliales bovinas derivadas de cordón umbilical (BUcEC), consideradas como un control negativo para la detección de citoqueratina, no se asoció con ninguna señal como se muestra en la Figura 1B. El anticuerpo secundario por sí solo no generó fluorescencia en condiciones similares a las de la microscopía fluorescente (datos no mostrados).

La inmunotinción con anti-vimentina de la DSP ovina indica que un mayor porcentaje de células expresaban vimentina que citoqueratina (Figura 1C). Además, se encontró una distribución más difusa de vimentina en la línea celular epitelial ZZ-R127. El anticuerpo secundario por sí solo no generó fluorescencia en condiciones similares a las de la microscopía fluorescente (datos no mostrados).

Con el fin de asegurarse de que las células DSP expresan la integrina α_Vβ₆, el receptor FMDV particular necesario para iniciar una infección, se utilizó un anticuerpo específico de proteína para marcar las células DSP, antes de la infección. Con la ayuda de este marcaje, pudimos detectar una señal que indicaba que la integrina_{α V}β₆ se expresaba significativamente en nuestras células, como se ve en la Figura 1D. El anticuerpo secundario por sí solo no generó fluorescencia en condiciones similares a las de la microscopía fluorescente (datos no mostrados).

3.2 Las monocapas ovinas de DSP y PT son susceptibles a la infección por el virus de la fiebre aftosa de tipo O

De acuerdo con la observación en microscopía óptica, la infección del clon 2.2 del clon 2.2 de FMDV O/FRA/1/2001 de las monocapas ovinas de DSP y PT dio lugar a una lisis celular variable en función del MOI utilizado durante la infección y de la población de células infectadas (Figuras 2A, B). Las células de DSP parecían ser más sensibles a la infección temprana, ya que el efecto citopático (CPE) en estas células fue casi completo después de solo 3 días después de la infección en MOI ^10-2, mientras que tomó 6 días para las células PT. El efecto citopático también apareció más rápido en los DSP infectados con MOI ^10-4 (65% CPE después de 3 días) que en PT (50% CPE después de 3 días). Sin embargo, en este MOI CPE observado en DSP ha alcanzado una fase de estancamiento a los 6 dpi, mientras que el CPE observado en PT seguía aumentando después de 6 dpi. Además, mientras que el MOI ^10-6 parecía ser suficiente para infectar eficazmente el DSP, no fue el caso del PT que mostró solo un CPE extremadamente limitado que desapareció dentro de los primeros 6 días después de la infección. A pesar de algunas fases de recuperación del crecimiento celular (datos no mostrados), no se observó una reconstitución completa de la monocapa después de su destrucción. A lo largo del experimento, no se detectó ningún CPE para las muestras DSP o PT MOCK.

Figura 2. Seguimiento de la infección por el virus de la fiebre aftosa en ovinos DSP y PT cultivados en monocapas. Los ovinos DSP y PT se cultivaron en monocapas y se infectaron con FMDV O Cl2.2 en MOI ^10-2, ^10-4, ^10-6 o en un medio condicionado con placebo. El inóculo viral no se ha retirado de los insertos hasta la primera recolección de muestras. (A) Observación CPE a 48 hpi. (B) Evolución del CPE durante los primeros siete ppp. La CPE se estimó visualmente mediante microscopía de campo claro. C) Detección del virus infeccioso de la fiebre aftosa mediante aislamiento viral. El aislamiento viral en células sensibles a IBRS-2 se realizó utilizando sobrenadantes recolectados para detectar el virus infeccioso de la fiebre aftosa. Se estimó visualmente la ECP en IBRS-2 después de una incubación de 48 h con sobrenadantes. Los resultados presentados aquí se refieren a los sobrenadantes de cultivo recolectados durante los primeros 23 dpi. (D) Detección de antígeno^pol 3D del FMDV por inmunofluorescencia. Las placas IBSR-2 de 96 pocillos utilizadas para el aislamiento viral se fijaron con paraformaldehído al 4% y luego se permeabilizaron con Triton X-100 antes de ser teñidas con un anticuerpo^pol 3D específico de ratón y una Alexa 488 (verde) anti-ratón de cabra. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst (azul) y las células se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio DMi8. Los resultados se clasificaron arbitrariamente según un índice que osciló entre 0 y 3. 0 indica que no hay fluorescencia, 1 una pequeña cantidad de células fluorescentes, 2 una mayoría de células fluorescentes y 3 indica que casi todas las células son fluorescentes. Evolución de los niveles de fluorescencia estimados después de 48h de incubación de IBRS-2 con sobrenadantes de cultivo recolectados hasta 23 dpi. Los resultados presentados aquí son el promedio de dos muestras. (E) Detección de ARN^pol 3D de FMDV por rtRT-PCR. Se realizó una rtRT-PCR dúplex dirigida al ARN 3D^pol FMDV, así como al gen de mantenimiento de β-actina. Los resultados que se presentan aquí se refieren a los resultados de los sobrenadantes de cultivo recolectados durante 23 dpi.

3.3 No se detectó ningún virus infeccioso de la fiebre aftosa más allá de los 17 días posteriores a la infección en monocapas de DSP ovinas

Los sobrenadantes de cultivo celular recogidos durante todo el experimento se analizaron para detectar la presencia de virus infecciosos mediante inoculación en células IBRS-2 sensibles a la fiebre aftosa. La CPE inducida por FMDV en IBRS-2 se estimó mediante observación microscópica (Figura 2C). Las muestras MOCK no mostraron ningún CPE. De nuevo, los resultados dependen tanto de la población de células infectadas como del MOI utilizado para la infección. De hecho, se detectó una CPE que indicaba la presencia de partículas infecciosas de FMDV en sobrenadantes recogidos de 6 a 17 dpi para DSP infectados en los tres MOI diferentes, con un porcentaje de CPE asociado correlacionado con la concentración de inóculo. En cuanto al análisis del sobrenadante de PT, se observó CPE en las células IBRS-2 desde el día 6 hasta el día 10 cuando los PT se infectaron en MOI ^10-2, y solo desde el día 8 hasta el día 10 para MOI ^10-4. No se detectó ningún virus infeccioso en los sobrenadantes PT infectados con MOI ^10-4 recogidos entre 6 y 23 dpi.

A continuación, las células IBRS-2 utilizadas para el aislamiento viral se fijaron y tiñeron para detectar antígenos^pol 3D del FMDV mediante FI (Figura 2D). No hubo fluorescencia discernible asociada con las muestras MOCK. Una vez más, los resultados están ampliamente influenciados por el MOI aplicado, así como por la población de células infectadas. Se detectaron antígenos^pol 3D en IBRS-2 incubado con sobrenadantes DSP recolectados hasta 17 dpi para MOI 10⁻², 10⁻⁴ y 10⁻⁶. De manera similar a lo que se ha observado para la detección de virus infecciosos, parece que la proporción de células positivas para antígeno^pol 3D se correlaciona con la concentración del inóculo utilizado. Con respecto a IBRS-2 incubado con sobrenadantes obtenidos de la infección por FMDV de células PT, se detectaron antígenos^pol 3D solo para MOI ^10-2 y ^10-4, hasta 13 dpi. A nivel mundial, la proporción de células positivas para el antígeno^pol 3D es mayor después de la incubación con sobrenadantes de la infección por DSP que después de la incubación con sobrenadantes de la infección por PT.

A lo largo del experimento, se analizaron los sobrenadantes de cultivo celular de la infección por DSP y PT para detectar la presencia de ARN viral mediante rtRT-PCR dirigida a la región codificante de la proteína^pol 3D de la FMDV. La β-actina de control del gen de mantenimiento se detectó a valores de Ct entre 29 y 37 para DSP y de 29 a 39 para PT. No se detectó^pol 3D de FMDV en el sobrenadante de cultivo celular antes de la infección, así como en muestras MOCK, pero se detectó a los 6 días después de la infección en MOI ^10-2, ^10-4, y 10⁻⁶ para ambas poblaciones celulares (Figura 2E). El ARN^pol 3D del virus de la fiebre aftosa se detectó mediante rtRT-PCR en sobrenadantes DSP recogidos entre 6 y 23 ppp para las células DSP infectadas, independientemente del MOI. Los valores de Ct del ARN^pol 3D oscilaron entre 23 y 30 Ct en sobrenadantes de DSP infectados en MOI ^10-2, entre 24 y 28 Ct en sobrenadantes de DSP infectados en MOI ^10-4 y de 22 a 29 Ct para MOI ^10-6. En cuanto a los sobrenadantes PT, el ARN^pol 3D se detectó de 6 a 23 dpi cuando se infectó en MOI ^10-2 y ^10-4, con valores de Ct que oscilaron entre 23 y 29 Ct. En cambio, cuando se infectó en MOI ^10-6, la detección de ARN^pol 3D solo fue posible en el sobrenadante a partir del día 6 postinfección. No se detectó ARN en las otras muestras.

3.4 Las células DSP ovinas primarias crecieron en múltiples capas en la interfaz aire-líquido

Con el fin de estudiar la cooperación que puede existir entre las capas que forman un epitelio, DSP y PT se cultivaron en multicapas cultivadas en el ALI para imitar un epitelio natural. Las células DSP lograron desarrollarse correctamente en la membrana recubierta de colágeno, pero no fue el caso de las células PT. Después de 5 semanas de cultivo en el ALI, las DSP se organizaron en bicapas delgadas salpicadas de grupos formados por capas más numerosas de células, como lo muestra la tinción HES de los insertos (Figura 3). La detección inmunohistoquímica de citoqueratina realizada en los insertos indica que las células que crecen en los insertos aún expresan este marcador epitelial (Figura 3). Por lo tanto, solo se infectaron las células DSP multicapa. La infección se controló como se hacía anteriormente con las monocapas.

Figura 3. Caracterización de células DSP multicapa. Las DSP se cultivaron en multicapas en la interfaz aire-líquido durante 6 semanas. Algunos insertos fueron sacrificados para una mayor investigación. Tinción de HES. Para ello, los insertos se fijaron en formol y luego se tiñeron con HES. Los insertos teñidos se observaron mediante microscopía para estimar el número de capas celulares. Tinción de citoqueratina. También se realizó la caracterización de IHQ para evaluar la expresión de citoqueratina en células DSP cultivadas en la interfase aire-líquido.

3.5 Virus infeccioso de la fiebre aftosa detectado más allá de 28 ppp en multicapas DSP ovinas

De acuerdo con las observaciones de microscopía óptica, la infección por el clon 2.2 del clon 2.2 del FMDV O/FRA/1/2001 de DSP en MOI ^10-4 dio lugar a un CPE gradual. Por lo tanto, se pudieron observar relativamente pocas diferencias entre las muestras infectadas y las simuladas durante los primeros días después de la infección, y luego las capas de insertos infectados se degradaron progresivamente hasta casi destruirse después de 29 dpi. No se ha observado evidencia de recuperación celular hasta el final del seguimiento de la infección (Figura 4A).

Figura 4. Monitorización de la infección por FMDV de DSP ovinos cultivados en multicapas en la interfaz aire-líquido. Las DSP se cultivaron en multicapas en la interfaz aire-líquido durante 5 semanas antes de ser infectadas con FMDV O Cl2.2 en MOI ^10-4, o en un medio condicionado con placebo. Los EPC se estimaron visualmente casi diariamente durante las primeras 2 semanas después de la infección. (A) Evolución del CPE en multicapa DSP. La observación microscópica de la ECP se observó justo antes de la infección, a los 24 hpi, 48 hpi, 7 dpi y 14 dpi para la infección y el simulacro. (B) Detección de virus infecciosos de la fiebre aftosa por aislamiento viral. El aislamiento viral en células sensibles a IBRS-2 se llevó a cabo utilizando sobrenadantes superiores recolectados para detectar el virus infeccioso de la fiebre aftosa. Se estimó visualmente la ECP en IBRS-2 después de una incubación de 48 h con sobrenadantes pasados una vez en IBRS-2. Los resultados presentados aquí se refieren a los sobrenadantes de cultivo recolectados durante 35 dpi. (C) Detección de antígeno^pol 3D del FMDV por inmunofluorescencia. Las placas IBRS-2 de 96 pocillos utilizadas para el aislamiento viral se fijaron con paraformaldehído al 4% y luego se permeabilizaron con Triton X-100 antes de ser teñidas con un anticuerpo^pol 3D específico de ratón y una Alexa 488 anti-ratón de cabra. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst y las células se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio DMi8. Los resultados se clasificaron arbitrariamente según un índice que osciló entre 0 y 3. 0 indica que no hay fluorescencia, 1 una pequeña cantidad de células fluorescentes, 2 una mayoría de células fluorescentes y 3 indica que casi todas las células son fluorescentes. Se presenta la evolución de los niveles de fluorescencia estimados después de 48 h de incubación de IBRS-2 con sobrenadantes de cultivo. Los resultados presentados aquí se refieren a los sobrenadantes de cultivo recolectados durante 35 dpi. (D) Detección de ARN^pol 3D del virus de la fiebre aftosa mediante rtRT-PCR. Se realizó una rtRT-PCR dúplex dirigida al ARN 3D^pol FMDV, así como al gen de mantenimiento de β-actina. Los resultados presentados aquí se refieren a los sobrenadantes de cultivo recolectados durante 35 dpi.

A lo largo de todo el proceso, se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular y se examinaron para detectar la presencia de virus infecciosos en las células IBRS-2. Después de 48 hpi, no se encontró CPE en IBRS-2 incubado con los sobrenadantes MOCK. Como se muestra en la Figura 4B, se observó CPE en IBRS-2 cultivado en presencia de sobrenadantes superiores recolectados desde el día 1 hasta el día 35 después de la infección. El porcentaje promedio de CPE se estimó en alrededor del 10% cuando los IBSR-2 se incubaron durante 48 h con sobrenadantes desde el día 2 después de la infección y del 45% para los de 10 dpi. Se visualizó un CPE cercano al 100% cuando se cultivaron células IBRS-2 en presencia de sobrenadantes recolectados de 15 dpi a 31 dpi. Se asoció un 70% de CPE después del aislamiento viral en sobrenadantes recolectados a 35 dpi.

Después del aislamiento viral, las células IBRS-2 se fijaron y tiñeron para detectar antígenos^pol 3D. No hubo fluorescencia discernible relacionada con las muestras MOCK. Las IBRS-2 incubadas con sobrenadantes superiores recolectados durante los primeros 2 días después de la infección mostraron una pequeña proporción de células positivas para antígeno^pol 3D (entre el 10% y el 50%), clasificadas como índice 1 o 2 (Figura 4C). Alrededor de la mitad de las células IBRS-2 incubadas con sobrenadantes obtenidos a 6 dpi fueron positivas para el antígeno^pol 3D (índice 2). Los sobrenadantes recolectados de 15 dpi a 35 dpi se incubaron durante 48 h, y los pocillos bajo observación mostraron una gran mayoría de células marcadas (índice 2,5-3).

Los sobrenadantes superiores de los insertos también se examinaron para detectar la presencia de ARN viral mediante rtRT-PCR dirigida a la región codificante de la proteína^pol 3D del FMDV. El gen de control β-actina se encontró en valores de Ct que oscilaron entre 29 y 33. No se detectó ARN del virus de la fiebre aftosa en el sobrenadante superior del inserto recolectado antes de la infección ni en las muestras simuladas. Se detectó ARN^pol 3D en los sobrenadantes de los insertos infectados recogidos a lo largo del experimento, es decir, hasta 35 dpi, como se muestra en la Figura 4D. Los valores de Ct medidos oscilaron entre 21 y 27, sin que se produjera una disminución real de la cantidad de ARN^pol 3D detectado a lo largo del tiempo.

4 Discusión

Las lagunas de conocimiento existentes sobre la persistencia de la fiebre aftosa pueden explicarse en parte por la falta de modelos celulares adecuados. Si bien las células tiroideas bovinas primarias (BTY) han sido consideradas durante mucho tiempo como la mejor herramienta disponible para el aislamiento del virus de la fiebre aftosa, las dificultades asociadas de suministro y cultivo han promovido el uso de líneas celulares derivadas principalmente del epitelio renal, tejidos de relevancia limitada con respecto a la fisiopatología de la fiebre aftosa (22). Dado que se desarrollaron modelos bovinos y porcinos especialmente adecuados para los estudios de la fiebre aftosa (18, 20), utilizando células primarias del paladar blando dorsal, consideramos pertinente desarrollar un modelo similar a partir de los sitios anatómicamente relevantes en ovejas, a saber, el PT y el DSP.

Por lo tanto, se aislaron y cultivaron células epiteliales primarias de PT y DSP ovinas. Se cultivaron con éxito células de ambos sitios de replicación primaria del virus de la fiebre aftosa en esta especie. A continuación, estas células se mantuvieron en cultivo y se probaron en ensayos de resistencia a la congelación-descongelación. El carácter epitelial de las células DSP y PT cultivadas se confirmó mediante observaciones morfológicas y la detección por inmunofluorescencia de marcadores epiteliales seleccionados. Así, hemos demostrado que DSP y PT se parecen a las células epiteliales, y que expresan citoqueratina, una proteína constitutiva de filamentos intermedios (23, 24). La leve expresión de citoqueratina en las células DSP es consistente con su expresión de vimentina, proteína característica de las células fibroblásticas, pero que también se puede encontrar en las células epiteliales, y potencialmente relacionada con la supervivencia al virus de la fiebre aftosa (25). La síntesis de vimentina se ha relacionado típicamente con la transición epitelio-mesenquimal (EMT) (21, 26, 27). No es de extrañar que la vimentina se encontrara en mayor medida que la citoqueratina porque estas marcas se llevaron a cabo después de numerosos pasajes; De hecho, se sabe que esta transición afecta a las células epiteliales primarias a través de los conductos (28).

La tinción con antiintegrina αVβ6 de células DSP ovinas mostró que estas células expresan significativamente el receptor preferencial para el virus de la fiebre aftosa, lo que indica su probable susceptibilidad a la infección por este virus (29). Se evaluó la susceptibilidad de las células DSP y PT a la infección por el virus de la fiebre aftosa tipo O en monocapas. De este modo, pudimos infectar con éxito estas dos poblaciones celulares, que parecen ser casi tan susceptibles como la DSP bovina cultivada por Hägglund et al. (18). Por lo tanto, mientras que el DSP bovino infectado en MOI ^10-2 mostró un CPE casi completo a 24 hpi, el CPE observado a 24 hpi es cercano al 90% para el DSP ovino y se considera completo después de solo 3 dpi. Sin embargo, este experimento también mostró que los TP eran ligeramente menos susceptibles a la infección temprana por FMDV que los DSP, ya que se necesitaban más de 3 ppp para observar un CPE superior al 90%. Además, parecía que la infección de TP en el MOI más bajo (MOI ^10-6) se interrumpía muy rápidamente y solo inducía un CPE extremadamente limitado. Independientemente del MOI utilizado para infectar PT y DSP, pudimos detectar el virus infeccioso de la fiebre aftosa en los sobrenadantes del cultivo mediante el aislamiento viral en células IBRS-2 susceptibles. De acuerdo con lo observado en términos de virus infeccioso, la infección en MOI ^10-6 condujo a la detección de antígenos virales en los sobrenadantes recolectados hasta 17 dpi para DSP, pero no en los sobrenadantes de las células PT. En cuanto a la detección de ARN viral, pudimos demostrar la presencia de ARN^pol 3D de hasta 35 ppp en los sobrenadantes de cultivo de las células DSP, con variaciones muy débiles en los valores de Ct entre los tres MOI. Una observación similar se hizo con respecto a la detección de ARN^pol en 3D en los sobrenadantes de cultivo de células PT infectadas en MOI ^10-2 y ^10-4. Por el contrario, la infección de estas células a ^10-6 MOI reveló ARN viral solo hasta 5 dpi. Por lo tanto, la infección de las células DSP en MOI ^10-2, ^10-4 y ^10-6 y de las células PT en MOI ^10-2 y ^10-4 con el virus de la fiebre aftosa dio lugar a la detección de virus infecciosos, así como de antígenos virales y ARN viral en los sobrenadantes de cultivo cosechados por encima de 28 ppp, límite en el que se define ahora la persistencia del virus de la fiebre aftosa. Sin embargo, dado que la persistencia del virus de la fiebre aftosa es un fenómeno que implica un cierto equilibrio entre la presencia del virus y la supervivencia de su huésped, es difícil afirmar que hemos desarrollado un modelo celular ovino que permita el estudio de la infección persistente, ya que los cultivos celulares fueron destruidos por el virus durante la infección y no se observó ningún signo de reconstitución.

De acuerdo con los hallazgos de los cultivos monocapa, las células DSP son ligeramente más susceptibles a la infección por FMDV que las células PT, por lo que elegimos centrar nuestra investigación exclusivamente en las células DSP. Para establecer un epitelio estratificado, estas células se cultivaron en la interfase aire-líquido. La caracterización histológica de nuestros cultivos multicapa apoya el desarrollo de un epitelio estratificado. La caracterización de las citoqueratinas por inmunohistoquímica realizada en multicapas de DSP confirmó su naturaleza epitelial. Después de la infección por el virus de la fiebre aftosa en el MOI ^10-4, las multicapas de células DSP mostraron una CPE progresiva, que fue menos grave que la observada en las monocapas, pero que aún así resultó en una destrucción casi completa de las células a los 29 dpi. La CPE observada pareció más fuerte que la CPE limitada observada cuando el modelo bovino estaba infectado en MOI ^10-2 (18). Si bien el monitoreo de la infección del modelo bovino permitió observar una reconstitución completa de la capa celular a lo largo del tiempo, este no fue el caso del modelo ovino. De hecho, a pesar de algunas fases de reconstrucción de fragmentos de la capa celular, el virus la degradó continuamente. El análisis de los sobrenadantes de cultivo superior recolectados durante la infección multicapa de DSP reveló la presencia de virus infecciosos, antígeno viral y ARN viral hasta 35 dpi. Por lo tanto, parece que la presencia de virus infecciosos es más duradera en el modelo multicapa que en el monocapa. En cuanto a la CPE moderada en las multicapas, parece que la cooperación entre las diferentes capas celulares podría retrasar la infección de las capas inferiores y promover el establecimiento de una infección a largo plazo (19). Sin embargo, también es difícil afirmar aquí que el modelo desarrollado en este estudio permite establecer una infección persistente por el virus de la fiebre aftosa, ya que, como observamos durante la infección de células ovinas primarias en monocapas, la capa celular se destruye casi por completo. Dado que estos intentos de establecer una infección persistente se llevaron a cabo utilizando células DSP de un solo animal, parecería apropiado intentarlo de nuevo utilizando tejidos recolectados de otros individuos. También se debe intentar establecer una infección de este tipo en las células de las amígdalas palatinas, las estructuras más propensas a estar infectadas de forma persistente.

A pesar de esto, en este estudio establecimos dos poblaciones celulares primarias, de las amígdalas palatinas y del paladar blando dorsal de ovejas, que son susceptibles a la infección aguda y a largo plazo por el virus de la fiebre aftosa (4, 11). El establecimiento de un modelo multicapa cultivado entre interfase aire-líquido a partir de DSP ovino permite reproducir las condiciones naturales imitando un epitelio estratificado sensible a la infección por el virus de la fiebre aftosa. Como resultado, se puede utilizar en combinación con el modelo bovino establecido por Hägglund et al. (18) y un modelo porcino basado en células DSP (20) para explorar más a fondo la persistencia diferencial del FMDV, con especial énfasis en cómo se conservan las respuestas inmunes innatas epiteliales de una especie a otra durante la infección. El uso de estos modelos multicapa ayudará a reducir el número de estudios con animales, ya que permitirá evaluar hipótesis en modelos biológicos más apropiados que las monocapas de células de linaje no específico.

Dado el escaso número de modelos in vitro disponibles en la actualidad para estudiar la infección por el virus de la fiebre aftosa en ovejas, podría ser interesante inmortalizar estas células para producir la primera línea celular derivada de tejido ovino de interés para el estudio del virus de la fiebre aftosa. Siempre que sean sensibles a los demás serotipos del virus de la fiebre aftosa y capaces de inducir una respuesta inmunitaria completa, esta línea celular puede utilizarse para la investigación o el diagnóstico del virus de la fiebre aftosa.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración de ética

No se requirió aprobación ética para el estudio con animales de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales porque se realizó el muestreo de animales muertos utilizados para otro experimento para el cual se otorgó aprobación ética.

Contribuciones de los autores

MS: Conceptualización, Investigación, Metodología, Escritura – borrador original. EL: Conceptualización, Investigación, Metodología, Escritura – revisión y edición. ARe: Investigación, Escritura – revisión y edición. ARo: Investigación, Escritura – revisión y edición. CB-C: Investigación, Escritura – revisión y edición. A-LS: Investigación, Escritura – revisión y edición. HH: Investigación, Escritura – revisión y edición. SH: Conceptualización, Investigación, Metodología, Escritura – Revisión y Edición. J-FV: Conceptualización, Investigación, Metodología, Escritura – revisión y edición. LB: Conceptualización, Supervisión, Redacción – revisión y edición. SB-B: Conceptualización, Investigación, Metodología, Supervisión, Redacción – revisión y edición.

Financiación

El/los autor/es declara(n) haber recibido apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Este trabajo de estudio original fue financiado por fondos propios del Laboratorio de Salud Animal de ANSES, así como por la Escuela de Veterinaria de Alfort (beca del proyecto EpithelOv 2019).

Reconocimientos

Los autores agradecen a Benoît Lécuelle (Plateforme de Recherche Biomédicale d’Alfort, Francia), Yves Millemann (Hospitalisation Grands Animaux Alfort, Francia) y Lövsta Kött, Uppsala, Suecia por proporcionar tejidos de oveja. Delphine Leroux y Sophie Chateau (Biopole Alfort) son reconocidas por su asesoramiento en el cultivo y la caracterización celular. Eva Chatonnat es reconocida por su asistencia. Gracias a Santina Grazioli y Emiliana Brocchi por proporcionar el anticuerpo^{anti-3D pol}.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda hacer su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Referencias