1 Introducción

La epilepsia es una enfermedad neurológica común en humanos y perros (1). Es comúnmente conocido que el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), el miedo y la ansiedad, así como la disfunción cognitiva son comorbilidades de la epilepsia en ambas especies con una supuesta relación bidireccional (2). Las comorbilidades neuroconductuales afectan la calidad de vida de los dueños y sus compañeros caninos, reflejando los desafíos que enfrenta la epilepsia humana (3-5). El manejo de las comorbilidades en la epilepsia humana y canina, a través de la nutrición, la medicación y las modificaciones conductuales, está aún en pañales (2). Por lo tanto, es necesaria la búsqueda de estrategias terapéuticas bien toleradas y efectivas para mitigar las comorbilidades conductuales y las disfunciones cognitivas.

La epilepsia suele tratarse con fármacos anticonvulsivos (TEA) (1), pero no todos los casos responden adecuadamente a los TEA. En los perros, la epilepsia resistente a los medicamentos (EDR) es definida por el Grupo de Trabajo Internacional de Epilepsia Veterinaria, de manera similar a la Liga Internacional contra la Epilepsia, como un fracaso de los ensayos adecuados de dos CIA bien tolerados y elegidos adecuadamente para lograr la ausencia sostenida de convulsiones (6). Con base en esta definición, dos tercios de los perros con epilepsia se clasifican como resistentes a los medicamentos (7). En esta población, las comorbilidades conductuales están presentes en mayor medida (8). Hasta la fecha, sin embargo, todavía no se ha dilucidado claramente, en toda su granularidad, cómo se desarrollan y progresan estas comorbilidades conductuales y disfunciones cognitivas en los pacientes afectados durante la epileptogénesis o progresión de la enfermedad y su tratamiento. Por el contrario, no está claro cómo se desarrolla la epilepsia en pacientes con estas comorbilidades (9).

Un vínculo prometedor entre las comorbilidades conductuales y la epilepsia podría ser el eje microbiota-intestino-cerebro (MGBA) (10). El MGBA se refiere a una comunicación bidireccional entre la microbiota gastrointestinal (GIM) y el cerebro. El término MGBA resume muchas vías, incluido el sistema nervioso entérico como parte del sistema nervioso autónomo, el eje hipotalámico hipofisario suprarrenal, la vía inflamatoria, el sistema inmunológico y neuroendocrino, así como los tractos neurales (10). El trasplante de microbiota fecal (TMF) se considera un procedimiento eficaz para recalibrar la GIM mediante la administración de material fecal de un donante no afectado a un paciente enfermo (11). En la última década, se ha informado que varios trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, los trastornos del espectro autista y la epilepsia, tienen alteraciones de GIM (10).

Estos hallazgos plantean la cuestión de si el TMF puede normalizar el GIM y, en consecuencia, mejorar los signos clínicos en estos pacientes. Basándose en el principio de la MGBA, múltiples estudios han demostrado que el comportamiento puede trasplantarse de animales afectados a no afectados e incluso a través de las barreras de las especies. Un estudio preclínico mostró que la depresión, la anhedonia y el comportamiento similar a la ansiedad de pacientes humanos podrían transferirse a ratas mediante TMF (12). Otro estudio demostró que los ratones receptores que recibieron material fecal de ratones con estrés crónico exhibieron un comportamiento similar a la ansiedad y la depresión similar al de los donantes (13).

En el presente estudio piloto, los objetivos fueron determinar los efectos del TMF en perros con ERD como un posible tratamiento novedoso sobre las comorbilidades conductuales y la disfunción cognitiva.

2 Materiales y métodos

2.1 Diseño del estudio

El estudio piloto prospectivo abierto de seis meses de duración incluyó un total de cinco visitas in situ (V). El TMF se realizó tres veces con 2 semanas de diferencia (V1-V3) y las citas de seguimiento se programaron a los 3 meses (V4) y a los 6 meses (V5) después del TMF (Figura 1). El estudio fue aprobado por la Oficina Estatal de Protección del Consumidor y Seguridad Alimentaria de Baja Sajonia, Alemania (LAVES; ID 33.8–42,502-05-20A539).

2.2 Perros

En la fase prospectiva del estudio se reclutaron perros con un nivel de confianza de nivel II de epilepsia idiopática (EI) resistente a los medicamentos (14) y al menos una comorbilidad conductual, como TDAH o comportamiento similar al miedo y la ansiedad (incluida la ansiedad por separación, la agresión por miedo, el miedo a los ruidos fuertes, a otros perros, a los extraños y a los movimientos bruscos). El DRE se define como la incapacidad de lograr una ausencia sostenida de convulsiones a pesar de someterse a ensayos suficientes de dos regímenes farmacológicos antiepilépticos tolerados, adecuadamente seleccionados y administrados adecuadamente (6). Los criterios se muestran en la Tabla 1. Se exigió a los propietarios que no cambiaran las dietas y golosinas de sus perros a lo largo del estudio y que proporcionaran un consentimiento informado por escrito para participar.

2.3 Material fecal

Los candidatos a donantes de TMF con IE bien controlada de nivel de confianza de nivel II (14) y comportamiento poco destacable se examinaron con base en los criterios presentados en la Tabla 1. Sus muestras fecales se enviaron al Laboratorio Gastrointestinal de la Universidad de Texas A&M, Texas, Estados Unidos, para la evaluación del Índice de Disbiosis (ID) y el examen de enteropatógenos. El cribado de endoparásitos fue realizado por el Instituto de Parasitología de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Hannover, Alemania. Estas pruebas se llevaron a cabo para evaluar el GIM y descartar cualquier posibilidad de transferencia de patógenos infecciosos. Solo un perro que pasó todas las pruebas fue seleccionado como donante fecal para minimizar los factores de confusión.

2.4 Preparación de la materia fecal

Se recolectó material fecal fresco del donante y se preparó para su almacenamiento a largo plazo. Para la preparación, se mezclaron 25 g de materia fecal con 22 mL de solución salina normal y 3 mL de glicerol en tubos de plástico de 50 mL (Sarstedt^®, Nümbrecht, Alemania) y se almacenaron a -20 ^°C durante un máximo de 2 meses. El día del TMF, los materiales se descongelaron a temperatura ambiente durante 2-3 h y se mezclaron para lograr una consistencia suave. A continuación, los materiales mezclados se extrajeron con jeringas de 50 ml (Dispomed^®, Dispomed WITT oHG, Gelnhausen, Alemania).

2.5 Trasplante de microbiota fecal

La dosis fecal fue de 2,5 a 5 g de heces por kg de peso corporal (15) para cada una de las tres sesiones de TMF, con 2 semanas de diferencia. Los perros no fueron defecados en ayunas ni inducidos antes del trasplante. Sin embargo, se eliminaron las heces que permanecían al alcance del dedo en el recto. Para cada TMF, se lubricó con aceite de parafina un catéter rectal (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemania), de 40 cm CH 25, y se conectó a una jeringa preparada que contenía la materia fecal mezclada. El material fecal se inyectó previamente en el catéter para desairear y evitar el trasplante de aire. Al menos dos tercios de la longitud del catéter se insertaron a través del recto hasta el colon, dependiendo del tamaño del cuerpo y de qué tan bien se toleró el procedimiento. Las jeringas preparadas se conectaron al catéter y los materiales de mezcla se inyectaron en el colon. Durante el procedimiento de TMF, no se requirió sedación ni anestesia. A los perros se les permitió irse a casa directamente después del TMF. Se recomendó la restricción de la alimentación y la actividad durante 4-6 h después del TMF para reducir el riesgo de defecación (15).

2.6 Cuestionarios

Los cuestionarios en línea se enviaron a los propietarios en V1, V4 y V5 (véase la Figura 1). Estos paquetes de cuestionarios contenían el cuestionario de evaluación e investigación del comportamiento canino (cBARQ) (16), el cuestionario de trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) (17), la escala de calificación de disfunción cognitiva canina (CCDR) (18) y el cuestionario de calidad de vida epiléptica (EpiQoL) (4) para evaluar las posibles comorbilidades de los perros, incluido el miedo, la ansiedad y el comportamiento similar al TDAH, así como la disfunción cognitiva y la calidad de vida relacionada con las convulsiones de los perros, incluidos el donante y sus dueños. Los paquetes también incluían un cuestionario de semiología de las convulsiones (Archivo complementario 1). Dos semanas después del último TMF (V3), los propietarios respondieron a un cuestionario en línea sobre los efectos del TMF y los efectos secundarios (QS) (Archivo complementario 2).

2.7 Evaluación conductual

Las pruebas conductuales, incluidas las pruebas de ansiedad y cognición, se realizaron a los pacientes en V1 antes del primer TMF, así como en V4 y V5 después de la intervención. Los perros no fueron evaluados en la fase postictal. La última convulsión había ocurrido al menos más de 48 horas antes de las pruebas. Las pruebas se realizaron en una sala de pruebas de 4×4 m con algunos muebles y grabadas por cinco cámaras (GoPro Hero 8 Black; GoPro, Inc., San Mateo, CA, Estados Unidos). Los protocolos utilizados en este estudio se describen en el Archivo Complementario 3.

2.7.1 Test de ansiedad

Los perros se sometieron a tres tareas, incluida una prueba de campo abierto (nuevo entorno), una prueba de separación y miedo dirigido por extraños y una segunda prueba de campo abierto (sonido de tormenta eléctrica). La primera prueba de campo abierto (nuevo entorno) y la prueba de miedo dirigido a la separación y al extraño se modificaron a partir de los estudios de Konok y otros (19) y Palestrini y otros (20), mientras que la segunda prueba de campo abierto se realizó utilizando protocolos modificados de un estudio de Gruen y otros (21). Los videos de las pruebas se analizaron utilizando el software K9-Blyzer desarrollado por Tech4Animals,1 el Departamento de Sistemas de Información de la Universidad de Haifa, Israel. Los parámetros y protocolos analizados fueron modificados a partir de los estudios de Bleuer-Elsner et al. (22) y Fux et al. (23). El método y los parámetros utilizados se describen en detalle en el archivo complementario 3.

2.7.2 Test de cognición

La prueba de cognición consistió en dos tareas, incluida una tarea de memoria de trabajo espacial y una tarea de resolución de problemas basada en el protocolo modificado de un estudio de Winter y otros (24). Se cuantificaron y compararon los tiempos exactos.

2.8 Perfiles sanguíneos y niveles de fármacos anticonvulsivos

Se recogieron muestras de sangre en V1 antes del primer TMF, en V3 y V5 para hemograma completo, química sanguínea, electrolitos, ácidos biliares, lipasa pancreática canina, serotonina y análisis de concentración de CIA (fenobarbital y bromuro de potasio).

2.9 Muestras fecales

Las muestras fecales fueron recolectadas después de la micción por los propietarios en cada día de cita, incluyendo V1, V2 y V3 antes del TMF, y V4 y V5. Las muestras se almacenaron en tubos de plástico de 5 mL (Sarstedt^®, Nümbrecht, Alemania) a -80 °C. Todas las muestras se enviaron con hielo seco al Laboratorio Gastrointestinal de la Universidad de Texas A&M, College Station, Texas, Estados Unidos, para el análisis de DI y ácidos grasos de cadena corta (AGCC) basados en qPCR. La DI fecal se calculó a partir de ensayos de qPCR de taxones bacterianos centrales (es decir, Faecalibacterium, Turicibacter, Streptococcus, Escherichia coli, Blautia, Fusobacterium, Clostridium hiranonis y Bifidobacterium). El DI por debajo de 0 fue considerado como normobiosis (25). La concentración de AGCC, incluidos acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato e isovalerato se analizó mediante cromatografía de gases de dilución de isótopos estables-ensayo de espectrometría de masas. Luego, las muestras fecales se entregaron a Diversigen, Houston, TX, Estados Unidos, para su metagenómica mediante secuenciación de escopeta de ADN superficial, incluidos los módulos de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) para su análisis funcional. Los resultados se utilizaron para análisis de diversidad alfa y beta. La diversidad alfa se refiere a las variaciones dentro de una muestra, mientras que la diversidad beta se refiere a las diferencias entre muestras (26). La diversidad alfa de cada visita se evaluó mediante Chao1, índice de Shannon-Wienner y características observadas. La diversidad beta se evaluó mediante medidas de distancia UniFrac ponderadas y no ponderadas, y gráficos de análisis de coordenadas principales (PCoA) utilizando la disimilitud de Bray-Curtis. Las diferencias en el agrupamiento de la microbiota entre todos los perros de cada visita y el donante se investigaron mediante el análisis métrico de distancia de Bray-Curtis y la diversidad beta con QIIME2. Para el análisis funcional de los genes, se identificaron los grupos de ortología KEGG alineándolos al 97% de identidad con las bases de datos de genes y vías procariotas. La base de datos de vías representa los procesos celulares esenciales asociados a los genes, como el metabolismo, el transporte de membrana, la transducción de señales y el ciclo celular (27, 28). Los métodos de DI, evaluación de AGCC y secuenciación superficial de ADN con escopeta fueron descritos previamente (29).

2.10 Muestras de orina

La orina del chorro medio de la primera micción del día de cada perro fue recolectada por el propietario en la mañana de V1, V4 y V5 y luego almacenada siguiendo los protocolos establecidos (30). Los neurotransmisores urinarios, a saber, los neurotransmisores monoamínicos (noradrenalina, adrenalina, dopamina y serotonina), los neurotransmisores de aminoácidos (glutamato, ácido gamma-aminobutírico (GABA), aspartato, glicina y serina), así como los precursores de neurotransmisores glutamina y 5-hidroxitriptófano se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con derivatización fluorescente previa a la columna con el método de o-ftalaldehído, que fue modificado a partir del método de Hörstermann (31). Para la detección fluorométrica se utilizó el fluorómetro RF 20A (Shimadzu, Kioto, Japón). Los métodos de análisis de neurotransmisores en orina se describen en el Archivo complementario 4. También se analizó la concentración de creatinina de cada muestra para estandarizar la concentración de orina.

2.11 Evaluación de las convulsiones

Se instruyó a los propietarios para que registraran el diario de convulsiones de sus perros, incluida la frecuencia de las convulsiones tónico-clónicas generalizadas, la intensidad, la duración y los signos clínicos durante las fases preictal, ictal, postictal e interictal durante el período prospectivo de seis meses. El período retrospectivo de seis meses (6 meses antes de V1) se comparó con los datos de convulsiones del período prospectivo a los 3 meses (V3-V4) y a los 6 meses de seguimiento (V3-V5).

2.12 Análisis estadístico

Los datos fueron cotejados y analizados utilizando Prism^® Versión 9.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, Estados Unidos). El nivel de significancia se fijó en p-valor <0,05. La hipótesis de normalidad se probó mediante la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, revelando que la mayoría de los datos no cumplían con la hipótesis de normalidad. Por lo tanto, se utilizó la prueba de rangos con signo emparejados de Wilcoxon para las comparaciones por pares. Para la diversidad beta (análisis de similitud, ANOSIM) se realizó un análisis estadístico multivariado utilizando Primer7 (Plymouth Routines in Multivariate Ecological Research Statistical Software, v7.0.13) (32). A continuación, se realizó una prueba de Friedman seguida de una prueba de Dunn post-hoc sobre la diversidad alfa utilizando JMP Pro 12 (Cary, Carolina del Norte, Estados Unidos), y sobre taxones bacterianos para todos los niveles taxonómicos y datos metagenómicos utilizando Prism^® versión 9.4.1. Los valores de p se ajustaron para comparaciones múltiples con Benjamin & Hochberg FDR a un valor de p <0,05.

3 Resultados

3.1 Perros

En este estudio se incluyeron diez perros propiedad de clientes con un nivel de confianza IE Tier II resistente a los medicamentos (14) (Archivo suplementario 5). Un perro fue excluido del estudio. El perro estuvo libre de convulsiones hasta el día 78, pero luego tuvo convulsiones en racimo, desarrolló un edema pulmonar neurogénico y murió. Los datos de los nueve perros restantes se utilizaron para el análisis del comportamiento.

3.2 Donante

Se eligió como donante de TMF un pastor australiano intacto macho de siete años de edad con IE bien controlada, que cumplía todos los criterios de inclusión del donante (ver sección 2.3). El perro había sido tratado con fenobarbital 2,2 mg/kg cada 12 h y había estado libre de convulsiones durante 1,5 años. El perro no tenía problemas de conducta. El DI en este perro fue de -4,91.

3.3 Cuestionarios conductuales

Los resultados de los cuestionarios en V4 y V5 se compararon con los de V1 (antes del TMF). Hubo una mejoría significativa en la impulsividad conductual similar al TDAH por parte de V4 (p = 0,019) y V5 (p = 0,037), mientras que no se detectaron cambios significativos en la falta de atención de la conducta similar al TDAH (Figura 2A). El análisis del cBARQ mostró una mejora continua en el «miedo no social» por V4 (p = 0,004) y por V5 (p = 0,009). Además, el comportamiento de «persecución» disminuyó significativamente en V4 (p = 0,004) y V5 (p = 0,037) (Figura 2B), otra señal de que los perros eran menos impulsivos y estaban más controlados. La EpiQoL indicó que la «gravedad y frecuencia de las convulsiones» mejoraron significativamente en V4 (p = 0,031) y V5 (p = 0,006). Los propietarios también experimentaron una reducción de la ansiedad («ansiedad del cuidador en torno al evento convulsivo») en V4 (p = 0,015) y V5 (p = 0,011) (Figura 2C).

Los cuestionarios CCDR no mostraron cambios significativos en las puntuaciones de disfunción cognitiva canina entre los puntos temporales. Sin embargo, las puntuaciones en V1 (39,44 ± 4,30), V4 (36,55 ± 2,79) y V5 (37,67 ± 3,46) fueron inferiores a 50, lo que indica que no hay signos de disfunción cognitiva (18).

3.4 Pruebas de comportamiento

3.4.1 Test de ansiedad

El análisis computacional se utilizó para verificar los resultados del cuestionario y evaluar objetivamente las pruebas de ansiedad en el laboratorio de comportamiento. Al comparar V4 (tres meses después del TMF) y V5 (seis meses después del TMF) con V1 (inicio previo al TMF), los resultados respaldaron los resultados de los datos del cuestionario (Tabla 2). Los perros estaban más tranquilos y mostraban menos impulsividad.

3.4.2 Test de cognición

Las pruebas de cognición también confirmaron los resultados del cuestionario, no habiendo diferencias en la memoria de trabajo espacial ni en la tarea de resolución de problemas.

3.5 Perfiles sanguíneos y concentraciones séricas de CIA

No se produjeron cambios significativos en los parámetros sanguíneos, incluidas las concentraciones séricas de serotonina y CIA, en todos los puntos de tiempo de muestreo (Ficha complementaria 5).

3.6 Análisis de muestras fecales

Los resultados se presentaron al sistema de taxonomía de la base de datos de taxonomía genómica (GTDB). Los datos de secuencia asociados a este proyecto están depositados en la base de datos del Archivo de Lectura Corta (SRA) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (Número de acceso: PRJNA1006674).

3.6.1 Diversidad alfa y beta

La diversidad alfa, incluyendo Chao1, el índice de Shannon-Wiener y las características observadas, se mantuvo sin cambios después del TMF (Figura 3). El análisis de la diversidad beta no mostró un agrupamiento significativo del microbioma entre todos los perros de cada visita y el donante (ANOSIM; R = − 0,032, p = 0,809). Además, no hubo tendencias a cambios en la agrupación del microbioma en la dirección hacia el donante después de cada TMF y de toda la intervención (Figura 4).

3.6.2 Diferencia taxonómica

En comparación con la línea de base (V1), hubo disminuciones en la abundancia de bacterias Firmicutes, concretamente en el filo Firmicutes B, clase Peptococcia, orden Peptococcales, familia Peptococcaceae, género UMGS1590 y especie UMGS1590 sp900553245 en V4 (p = 0.023) y V5 (p = 0.045) (Figura 5). Además, hubo una disminución de Blautia_A_sp900541345 especies en V4 (p = 0.029) y un aumento de especies no identificadas de Ruminococcus_B (Ruminococcus_B_Snoopy_p1_metabat2_high_ PE.024.contigs) en V5 (p = 0.036) (Figura 6).

3.6.3 Análisis de genes funcionales

Las comparaciones de las concentraciones de genes funcionales antes y después del TMF no revelaron cambios estadísticos.

3.6.4 Índice de disbiosis (ID)

De acuerdo con los resultados del análisis metagenómico, no hubo cambios significativos en la comparación de la DI de cada visita con la línea basal de V1. Todas las muestras estuvieron dentro de los intervalos de referencia con DI < 0 en todos los puntos temporales (25).

3.6.5 Análisis de ácidos grasos de cadena corta (AGCC)

La comparación de las concentraciones de AGCC en muestras fecales de V1 a V5 no demostró cambios significativos en las concentraciones de acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato y en las concentraciones totales de AGCC.

3.7 Análisis de neurotransmisores en orina

La concentración de neurotransmisores en orina en V4 (tres meses después del último TMF) y V5 (seis meses después del último TMF) se comparó con V1 (valor basal). La concentración de aspartato disminuyó significativamente en V4 (p = 0,048) y V5 (p = 0,027). La concentración de glutamato disminuyó en V4 (p = 0,048) y V5 (p = 0,027). Por el contrario, hubo aumentos en la concentración de GABA (p = 0,027) y en la relación GABA/glutamato (p = 0,005) en V5 (Figura 7). La concentración de noradrenalina, adrenalina, dopamina, serotonina, 5-hidroxitriptófano, glicina, serina y glutamina se mantuvo sin cambios en V1, V4 y V5.

3.8 Frecuencia y gravedad de las convulsiones

3.8.1 Frecuencia de las convulsiones, frecuencia de los días de las convulsiones y frecuencia de los días de las convulsiones

Ninguno de los perros estaba libre de convulsiones después del TMF. Solo uno de los nueve perros tuvo una respuesta parcial (más del 50% de reducción en la frecuencia de las convulsiones) a los 3 y 6 meses de seguimiento (perro nº 4 y 5 respectivamente). En cuanto a las convulsiones en racimo, uno (perro n.º 4) y cuatro perros (perro n.º 2, 4, 7 y 8) tuvieron una reducción de más del 50% en la frecuencia de los días de convulsiones en racimo a los 3 y 6 meses de seguimiento, respectivamente (Ficha complementaria 5).

3.8.2 Fases preictal, ictal, postictal e interictal

No se reportaron cambios durante la fase preictal en ninguno de los perros. Durante la fase ictal, seis de cada nueve perros experimentaron una reducción del > del 50% en la duración de las convulsiones, y en la fase postictal, se observó una reducción del > del 50% en la duración en cuatro de los nueve perros.

3.9 Efectos secundarios

Dos perros tuvieron efectos secundarios leves a corto plazo después del TMF. Uno mostraba inquietud y el otro experimentaba hinchazón abdominal. Estos efectos ocurrieron después de un solo TMF y duraron solo 1 día.

4 Discusión

El vínculo entre el microbioma y el comportamiento en humanos y roedores se ha demostrado en varios estudios, pero hasta la fecha no se han estudiado los datos sobre cómo el microbioma puede modificar las comorbilidades conductuales en un modelo canino natural para la epilepsia. El estudio actual sugirió que el TMF tiene el potencial de mejorar las comorbilidades conductuales, incluido el TDAH, así como el comportamiento similar al miedo y la ansiedad, en perros receptores con DRE. En general, los propietarios informaron una mejora en la calidad de vida de sus perros y en la suya propia.

El fenotipo conductual del perro donante se transfirió con éxito mediante TMF a los perros del grupo de estudio, lo que condujo a una mejora en el comportamiento similar al TDAH. Estos hallazgos se alinean con estudios preclínicos en roedores que demuestran que el TMF podría transferir fenotipos conductuales como la depresión, el comportamiento similar a la ansiedad y el estrés (12, 13). Sin embargo, hay datos limitados sobre las vías mecanicistas. En nuestro estudio, la abundancia del filo Firmicutes_B en el GIM, incluyendo la familia Peptococcaceae, disminuyó después del TMF. Peptococcaceae se ha asociado con el estrés y la ansiedad, como se ha demostrado en estudios que involucran ratas expuestas a estrés de hacinamiento y pollitos que experimentan estrés por calor (33). De manera similar, una mayor ansiedad prenatal materna en humanos se ha relacionado con una mayor abundancia de géneros no identificados en la familia Peptococcaceae (34). Por lo tanto, la disminución de la abundancia de Peptococcaceae, encontrada en nuestro estudio, puede haber contribuido potencialmente al alivio del estrés y la ansiedad.

También encontramos una disminución en el Blautia_A_sp900541345 y un aumento en las bacterias no identificadas en el género Ruminococcus_B después del TMF. En nuestro estudio, utilizamos la taxonomía GTDB, que tiene diferentes clasificaciones en comparación con la taxonomía del NCBI. El GTDB tiene como objetivo crear una taxonomía microbiana estandarizada basada en la filogenia del genoma. Los árboles filogenéticos basados en secuencias ofrecen una estructura para elaborar una taxonomía que considere tanto las conexiones evolutivas como las variaciones en las tasas evolutivas. Las taxonomías microbianas existentes, como las ofrecidas por el NCBI, con frecuencia divergen de las relaciones evolutivas debido a la inclusión de agrupaciones polifiléticas (35). El Blautia_A_sp900541345 incluye algunas bacterias de la taxonomía del NCBI, a saber, Blautia sp., así como bacterias de la familia Lachnospiraceae y del orden Clostridiales. Estudios previos han reportado un crecimiento excesivo de Blautia en pacientes con TDAH (36), junto con correlaciones positivas entre el crecimiento excesivo de Blautia y la gravedad de la ansiedad y la depresión en humanos (37). En un estudio preclínico, las ratas con un comportamiento crónico impredecible inducido por la ansiedad y la depresión también tenían una mayor abundancia de Blautia en comparación con el grupo tratado con antibióticos, que mostró una reducción en los comportamientos (38). Estos estudios mostraron que la abundancia de Blautia tenía una correlación positiva con la gravedad de los problemas psiquiátricos o de comportamiento en humanos y animales, respectivamente. Por lo tanto, la reducción de Blautia encontrada en nuestro estudio podría estar relacionada con la mejora conductual. Sin embargo, existe cierta controversia. Un estudio reveló que las bacterias de la familia Lachnospiraceae estaban disminuidas en pacientes con TDAH (39) y esto se asoció con una reducción en el comportamiento repetitivo en un modelo de ratón de trastorno del espectro autista (40). No existen datos de investigación neuropsicológica para Clostridiales y bacterias del género Ruminococcus_B. Con respecto a nuestros resultados, los cambios taxonómicos en este estudio fueron menores, con genes funcionales inalterados, y los perros mantuvieron una DI normal. Es plausible que el vínculo entre el GIM y el comportamiento abarque factores intrincados y finamente diferenciados, que potencialmente incluyen sustancias diminutas como pequeños metabolitos o subproductos del GIM, ya sea con funciones directas o indirectas. También hay que tener en cuenta que la reducida abundancia de Blautia spp. encontrada en nuestro estudio no duró mucho, ya que solo se pudo detectar a los 3 meses y no a los 6 meses después del TMF. Además, el aumento de Ruminococcus_B llevó tiempo, ya que solo se pudo detectar a los 6 meses después del TMF. Las observaciones durante más de 6 meses y un tamaño de muestra mayor podrían mostrar cómo cambian a largo plazo y proporcionar resultados más claros, respectivamente. Es posible que se necesite una dosis más alta o un TMF más frecuente para mantener niveles de abundancia estables o proporcionar resultados más significativos en perros con ERD.

Los resultados de los cuestionarios mostraron mejoras en el comportamiento similar al TDAH, el miedo y la ansiedad al reducir la impulsividad, la persecución y los factores de miedo no social, así como mejorar la calidad de vida de los perros y sus dueños. Los resultados fueron respaldados objetivamente por pruebas de comportamiento validadas seguidas de análisis computacionales. Los perros de nuestro estudio estaban más tranquilos y mostraban menos impulsividad después del TMF. Caminaron de forma menos errática y cubrieron distancias más cortas que antes del TMF. En general, se espera que los perros con TDAH, miedo y ansiedad exhiban movimientos y giros rápidos frecuentes, así como un alto nivel de comportamiento de exploración (23, 41). Se debe tener en cuenta que la evaluación del comportamiento requiere una evaluación integral, particularmente a través de análisis clínicos y objetivos, para evitar sesgos por parte de los evaluadores y propietarios. Se justifican más investigaciones sobre los parámetros que exhiben una fuerte correlación con comportamientos específicos.

Se ha descubierto que los neurotransmisores están asociados con afecciones psiquiátricas. La investigación clínica emergente está comenzando a enfatizar la importancia de la alteración del equilibrio excitatorio/inhibitorio en el TDAH y la ansiedad, asociada con irregularidades funcionales en la señalización de glutamato y GABA dentro del cerebro (42, 43). Varios estudios en humanos utilizando espectrografía de resonancia magnética informaron un aumento en el glutamato o una disminución en las concentraciones de GABA en áreas específicas del cerebro, como la corteza cingulada anterior de pacientes con TDAH (44), el tálamo de pacientes con trastorno de ansiedad social (45) y la corteza occipital de pacientes con trastorno depresivo mayor (46). Estos estudios destacaron el papel potencial de los niveles de GABA y glutamato en la etiología de los trastornos neuropsiquiátricos. Si bien es posible que los neurotransmisores específicos del área del cerebro no se correlacionen directamente con las concentraciones totales de GABA y glutamato en el líquido cefalorraquídeo, algunos trastornos han mostrado cambios direccionales similares. Por ejemplo, hubo una elevación de los niveles de glutamato en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con depresión (47) y trastorno obsesivo compulsivo (48), mientras que se informó que el GABA disminuyó en pacientes con trastorno de pánico (49) y ansiedad, lo que también se correlacionó con su gravedad (50). En nuestro estudio, el TMF podría disminuir los neurotransmisores excitatorios aspartato y glutamato, al tiempo que aumentaba el neurotransmisor inhibidor GABA, así como la relación GABA/glutamato en orina. La mejora en los comportamientos observados podría explicarse si la reducción de glutamato y los niveles elevados de GABA en la orina reflejan los niveles correspondientes en el cerebro o podrían actuar periféricamente a través de un mecanismo no identificado, como la modulación de la actividad del nervio vago. Esto significa que las concentraciones de neurotransmisores que se encuentran en la orina podrían no correlacionarse positivamente con las concentraciones de los neurotransmisores en el sistema nervioso central, ya que los neurotransmisores podrían no cruzar la barrera hematoencefálica y podrían no pasar a través de la circulación sistémica periférica antes de ingresar a los riñones y estar presentes en la orina (30). Además, los neurotransmisores podrían estar influenciados por la producción de neurotransmisores de otros órganos, el GIM y la nutrición (30). Por lo tanto, los resultados deben interpretarse con precaución. Sin embargo, en algunos estudios se ha reportado una correlación entre los neurotransmisores periféricos y centrales (51, 52) y los cambios en el glutamato y el GABA en plasma parecen reflejar sus niveles en el cerebro y el líquido cefalorraquídeo (47, 53, 54). Además, un estudio en perros epilépticos reveló una correlación entre los patrones de neurotransmisores urinarios y la epilepsia (30). En este caso, la mejora en el TDAH y en las conductas similares al miedo y la ansiedad encontrada en nuestro estudio podría explicarse por la reducción del glutamato y el aumento de los niveles de GABA. El mecanismo exacto por el cual estos neurotransmisores contribuyen a estos trastornos sigue siendo incierto, y es posible que no se expliquen completamente por un solo sistema de neurotransmisores (55). Otros estudios sobre neurotransmisores mediante espectroscopia de resonancia magnética en perros con comorbilidades conductuales deberían proporcionar más información y apoyar nuestros resultados.

Muchos medicamentos pueden afectar el GIM. A la hora de seleccionar a los donantes, es fundamental tener en cuenta sus medicamentos, en particular los antibióticos, los gastroprotectores y los antiinflamatorios no esteroideos. Los antibióticos, por ejemplo, pueden provocar cambios a largo plazo en el GIM, incluida la reducción de la diversidad microbiana, el agotamiento de las bacterias beneficiosas, la proliferación de patógenos dañinos y alteraciones en las funciones metabólicas y los subproductos (56). También se deben tener en cuenta otros medicamentos, como los antiinflamatorios no esteroideos o los fármacos gastroprotectores como el omeprazol (57, 58). En este estudio, se eligió un donante con EI bien controlada con un nivel de confianza de nivel II, tratado únicamente con PB, en lugar de un donante sano sin epilepsia debido a la abundancia esperada de un GIM transformado. En general, se han observado diferencias en el GIM entre perros con EI y perros sanos (59). Además, los perros con EI tratados con PB mostraron diferencias en las funciones metabólicas de GIM y en los productos, como una mayor producción de AGCC, particularmente en los perros que responden a PB (29). Estas diferencias pueden estar relacionadas con respuestas variadas de neuronas entéricas en perros con EI (60). Por lo tanto, se seleccionó para su uso en este estudio al donante con EI bien controlada bajo tratamiento de PB, que proporcionó el GIM transformado esperado y los productos asociados en materiales fecales. Sin embargo, el uso de perros sanos como donantes podría producir resultados diferentes en términos de comportamiento y control de convulsiones, lo que podría proporcionar información valiosa para la selección de donantes.

Este estudio tiene todas las limitaciones de un estudio abierto y solo puede considerarse como un estudio piloto. Los efectos placebo son notables y no deben subestimarse. Influyen en gran medida en los resultados en diversas afecciones médicas, como lo demuestra un metaanálisis sobre la epilepsia canina, que muestra una disminución del 29% en la frecuencia de las convulsiones durante la administración de placebo (61). Por lo tanto, es necesario tener precaución al interpretar los resultados positivos en el comportamiento, los cuestionarios de calidad de vida y los datos de control de convulsiones. Sin embargo, estos hallazgos fueron reforzados por pruebas de comportamiento estandarizadas y análisis computacional. El ejemplo también existe en el estudio, las mejoras en la gravedad y frecuencia de las convulsiones reportadas en el cuestionario EpiQoL no se reflejan en el análisis estadístico. Otra limitación es que los análisis de ADN a través de la secuenciación de escopeta se sometieron a repetidos ciclos de congelación y descongelación, lo que podría afectar a cambios menores en el GIM (62). El pequeño tamaño de la muestra del estudio subraya su naturaleza piloto. Se justifican investigaciones futuras con tamaños de muestra y grupos de control más grandes para obtener pruebas más sólidas. La decisión de realizar un estudio piloto estuvo influenciada por la ausencia de indicaciones previas del impacto del TMF en el comportamiento canino asociado con la epilepsia y ofrece la ventaja de estimar el tamaño del efecto.

5 Conclusión

Este estudio piloto proporciona la primera evidencia de que el TMF podría considerarse como uno de los procedimientos para mejorar el comportamiento en perros con ERD. En este estudio, el TMF mostró un claro efecto sobre el comportamiento y los neurotransmisores urinarios. En general, los propietarios informaron de una mejora en su calidad de vida y en la de sus perros con epilepsia. Además, la gravedad de las convulsiones y la frecuencia de las convulsiones tónico-clónicas solo mejoraron en perros individuales. Se necesitan urgentemente estudios controlados aleatorios para confirmar los prometedores resultados iniciales, que también podrían tener un importante valor traslacional para las comorbilidades en la epilepsia humana.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres de los repositorios y los números de acceso se pueden encontrar a continuación: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1006674.

Declaración ética

Los estudios en animales fueron aprobados por la Oficina Estatal de Protección del Consumidor y Seguridad Alimentaria de Baja Sajonia, Alemania (LAVES). Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones de los autores

AW: Redacción – revisión y edición, Redacción – borrador original, Administración de proyectos, Metodología, Investigación, Análisis formal, Curación de datos, Conceptualización. SM: Redacción – revisión y edición, Validación, Supervisión, Metodología, Investigación, Conceptualización. NF: Redacción – revisión y edición, Software, Metodología, Investigación, Análisis formal. JS: Redacción – revisión y edición, Validación, Supervisión, Metodología, Análisis formal, Conceptualización. RP: Redacción – revisión y edición, análisis formal, curación de datos. MK: Escritura – revisión y edición, análisis formal. BL: Redacción – revisión y edición, análisis formal, curación de datos. AB-N: Redacción – revisión y edición, Recursos. AF: Redacción – revisión y edición, Supervisión, Recursos, Metodología, Conceptualización. KB-H: Redacción – revisión y edición, Metodología. CF: Redacción – revisión y edición, Recursos, Metodología. MG: Redacción – revisión y edición, Metodología, Análisis formal. FR: Redacción – revisión y edición, Validación, Supervisión, Metodología, Análisis formal. AZ: Redacción – revisión y edición, Software, Metodología, Análisis formal. HV: Redacción – revisión y edición, Validación, Supervisión, Metodología, Conceptualización.

Financiación

El/los autor/es declaran/n que se recibió apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Esta publicación de acceso abierto fue financiada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) – 491094227 «Financiación de publicaciones de acceso abierto» y la Fundación de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover. AW es titular de una beca de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Kasetsart, Tailandia con el número 02/2562.

Reconocimientos

Los autores desean agradecer a los perros con epilepsia, incluidos el donante y los pacientes, y a sus dedicados dueños que participaron en este estudio, a los veterinarios remitentes, a los colegas de los departamentos de Neurología, Parasitología, Farmacología y Laboratorio de Pequeños Animales de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover y a los colegas de laboratorio de la Universidad de Texas A&M por hacer posible completar con éxito este estudio. También agradecemos especialmente a Wolfgang Löscher y Marion Bankstahl por sus valiosos consejos, así como a Stefan Unterer y Anna-Lena Ziese por sus perspicaces aportaciones sobre el procedimiento TMF.

Conflicto de intereses

HV se ha desempeñado como consultor remunerado en el campo de la epilepsia para Boehringer Ingelheim, CEVA Animal Health, Nestlé Purina y se desempeñó como investigador contratado para: Nestlé Purina, Desitin Pharma y Boehringer Ingelheim. JS y RP eran empleados del Laboratorio Gastrointestinal de la Universidad de Texas A&M, que ofrece evaluación del microbioma a cambio de una tarifa por servicio. JS fue la Cátedra de Purina PetCare para la Investigación del Microbioma y recibe apoyo para la investigación del microbioma a través de los Fondos de Excelencia en la Investigación de Purina PetCare. JS también ha recibido honorarios de consultoría o conferencias de Nestlé Purina, IDEXX Laboratories, Royal Canin y Hill’s Pet Nutrition, Inc. AF participa en asociaciones entre el mundo académico y la industria con Nestlé Purina y Vetoquinol.

El resto de los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

El revisor AW declaró una colaboración pasada con los autores HV al editor de manejo.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2024.1385469/full#supplementary-material

Notas

Referencias