Datos geómicos de Mycobacterium bovis

La profundidad media de la cobertura osciló entre 20x y 174x excepto 7 aislados, con un 85,3% (n = 116) de los aislados con valores ≥30x. La longitud media de lectura de los aislados osciló entre 186,5 y 239,4 (mediana = 229,7, IQR = 222.6-23,6). La cobertura media del genoma fue del 99,0% (IQR = 98,9-99),1). Los datos resumidos de alineación y los metadatos asociados con muestra de los 136 aislados sometidos a WGS se incluyen en la Tabla Suplementaria S1. No se detectó ninguna indicación de la presencia de aislados mixtos en la población secuenciada, ya que no se observaron muchas ocurrencias de posiciones mixtas de forma recurrente en todo el genoma en regiones con buenas puntuaciones de mapeo.

Análisis filogenético y estructura de agrupación

Se excluyeron unascientos once SNP, ya que se detectaron en regiones donde el mapeo era propenso a errores o estaban presentes en áreas con una acumulación anómala de variantes. El análisis de los SNP informativos mostró que entre los aislados españoles de M. bovis estudiados había un total de 1.345 SNP, de los cuales 773 eran singletones (presentes en un solo aislamiento). La diversidad genética entre los aislados era variable, con un número promedio de 62 SNP (rango = 49-88) desde que divergió de su antepasado común más reciente (MRCA). Los aislados se subdividieron en dos grupos distantes (A y B, Figura 2), con el más grande (A) subdividido en seis clades diferentes (A.1-A.3, A.4.1, A.4.2 y A.5) de acuerdo con BAPS y basado en una distancia máxima dentro de la cláusula de 57 SNP (Tabla complementaria S2; Figura 2; Figuras Todos los aislados del grupo A se caracterizaron por la presencia de dos SNP adicionales (ausentes en el grupo B) e incluían el 96 % (n = 95) del ganado y el 97,3 % (n = 36) de aislados de vida silvestre. El Grupo B incluía 5 aislados, uno de los cuales fue recuperado de un jabalí y el resto del ganado.

La distribución de los clados por provincia se muestra en la Figura Suplementaria S4. Clade A.2 representó el mayor clado/número de aislados (74,3 % del total) e incluyó todos los aislados de animales bovinos y de Madrid (n = 66) y Mallorca (n = 8), junto con 27 aislados de bovinos y vida silvestre de 12 provincias diferentes (Tabla complementaria S2; Figura complementaria S4). Los aislados de este clado se recuperaron durante todo el período de estudio (2005-2018) con un número medio de siete aislados por año (rango 1-21). Clade A.1 incluyó 3 aislados bovinos y 3 de vida silvestre recuperados entre 2011 y 2018 de provincias ubicadas en el centro y sur de España, mientras que los aislados de los clades A.3, A.4.1, A.4.2 y A.5 eran exclusivamente de ganado y se cultivaron en 2007, 2008, 2016 y 2018 (clade A.3, n = 4), Los aislados de los clados A.3, A.4.1 y A.4.2 se recuperaron de las provincias que cubrían la franja central de oeste a este de España y dos regiones del norte, mientras que los dos aislados en el clado A.5 se originaron de provincias muy lejanas (>600 km) (Figura complementaria S4). Finalmente, los aislados del grupo B se recuperaron en 2011 (n = 1) y 2017-2018 (n = 4).

La distancia genética entre el grupo (A frente a B) oscilaba entre 115 y 163 SNP, mientras que las distancias genéticas dentro del grupo eran mucho más bajas en el grupo A (mediana = 37 SNP, rango = 0-1229) que en el grupo B (mediana = 96 SNP, rango = 12-108, tabla complementaria S2). La distancia genética mediana dentro de las glomos en el grupo A fue de 30 (rango = 21-57; Tabla Suplementaria S2), mientras que la distancia genética mediana entre las glos fue de 85 (rango = 35-1414). Aunque los aislados del grupo B eran genéticamente distantes (distancia media 96 SNP), dos aislados de ganado y un jabalí estaban relativamente estrechamente relacionados (<16 SNP) y se recuperaron cerca en el tiempo (2017 y 2018).

Diversidad genética entre y dentro de las especificaciones

La diversidad genética entre aislados de diferentes huéspedes se evaluó utilizando 90 aislados (53 de ganado, incluido solo uno por rebaño, y todos los aislados de vida silvestre: 20 de jabalí, 9 de ciervos y 8 de ciervos rojos).

Se encontraron seis eventos de distancias genéticas cortas (≤3 SNP) entre aislados de diferentes especies huésped recuperadas cerca en el tiempo (dentro de 5 años, y dentro de <2 años en cinco de ellos) y espacio (dentro de la misma provincia o provincias vecinas). Específicamente, estos eventos incluyeron: un aislamiento de ganado y un ciervo rojo recuperados en Ávila y Madrid, respectivamente, un aislado de ganado de Córdoba y una muestra de ciervos rojos de Ciudad Real, un triplete formado por un ganado, un jabalí y un aislado de ciervo rojo M. bovis de Toledo, dos muestras de M. bovis aisladas de ganado y ciervos recuperados recuperado en Mallorca (Figura 2).

neral, la mediana de la divergencia genética dentro de los aislamientos de ganado en España (mediana = 80 SNP, IQR = 36–109), fue significativamente (p < 0,001, Kruskal-Wallis) más alta que entre el ganado y la vida silvestre (mediana = 66 SNP, IQR = 29– 93), y aislamientos dentro de la vida silvestre (mediana = 29 SNP, IQR = 22–40). No se observaron cambios cuando se volvió a evaluar la variabilidad dentro de la especie del ganado utilizando 10 selecciones aleatorias de aislamientos de los rebaños con múltiples aislamientos disponibles (cambio porcentual máximo 0,01%). Las distancias genéticas se correlacionaron de baja a moderada con las distancias geográficas (rho = 0.42, p < 0.001). Cuando se analizó la asociación entre las distancias genética y geográfica teniendo en cuenta el huésped del que se originaron los aislamientos utilizando un modelo lineal, tanto el huésped como la interacción entre el huésped y la distancia geográfica fueron significativos (Tabla complementaria S3): la distancia genética aumentó con el aumento de las distancias geográficas entre los ubicación de donde se originaron los dos aislados, pero este efecto fue menos pronunciado cuando se consideraron dos aislados de ganado en comparación con dos aislados de vida silvestre (y similar cuando se consideraron parejas recuperadas tanto de ganado como de vida silvestre; Figura 3). Se esperaba un aumento de 5 SNP en la diversidad genética dentro de los aislamientos de la vida silvestre por cada aumento de 100 km entre el origen de cada par de aislamientos, mientras que este número aumentó a 7 cuando ambos aislamientos se recuperaron del ganado (Tabla complementaria S3; Figura 3). Los coeficientes y las pendientes de los 10 modelos construidos con base en las diferentes selecciones aleatorias de aislamientos de ganado de rebaños infectados crónicamente fueron similares (<10% de cambio), lo que sugiere que la selección aleatoria de aislamientos en rebaños muestreados intensivamente no tuvo un impacto sustancial en la diversidad genética observada. (Figura 3; Figura complementaria S5; Tabla complementaria S3).

Por el contrario, cuando se realizó el mismo análisis en el subconjunto de aislados recuperados en Madrid, no se identificaron diferencias significativas (p > 0,05, prueba de Kruskal-Wallis) en las distancias encontradas entre los aislados de la misma especie (rango medio dentro del ganado = 30-32 SNP; mediana dentro de la vida silvestre = 30 SNP) o diferentes El modelo final incluyó solo la distancia geográfica entre los aislados como covariable, ya que no se encontró ningún efecto significativo de la especie animal. Se observó un aumento de 13 SNP por 100 km de distancia entre pares de aislados basado en los resultados de los 10 modelos de regresión lineal (Tabla complementaria S4). Los coeficientes de los modelos de regresión fueron más susceptibles a la variación basada en los aislados seleccionados al azar por rehada (hasta un cambio del 20 %, Tabla Suplementaria S4).

Diversidad genética dentro y entre el rebaño

Entre las 99 secuencias de ganado, 61 se originaron en los mismos 15 rebaños y fueron seleccionados para evaluar la diversidad dentro de los rebaños (Tabla 2). El número medio de aislados procedentes de las 15 rehadas fue de 3 (IQR = 3-5) y se recuperaron en una mediana de 2 años diferentes (IQR = 1-3). Diez de estas manadas se consideraron infectadas crónicamente (aislados recuperados en >1 año), produciendo 48 aislados de ganado (número medio de aislados por rebaño infectado crónicamente = 5, rango = 3-8) recuperados a lo largo de una mediana de 4 años diferentes (IQR = 2-5). Los 5 rehadas restantes (n = 5) no infectados crónicamente representaron 2-3 muestras recuperadas en un solo año (Tabla 2).

Los aislados de los análisis genéticos dentro del rebaño se incluyeron en tres clados del grupo A (A.2, A.4.1 y A.4.2). Las distancias genéticas medianas dentro del rebaño entre los aislados de cada uno de los 15 rebaños oscilaron entre 0 y 44 SNP (mediana = 9). Se observó una mayor diversidad genética en aislados recuperados de rehadas ubicadas en Madrid (a saber, M_A-M_C, M_G y M_H), aunque los aislados de rehadas individuales tendían a agruparse (Figura suplementaria S6). Los aislados recuperados en el retría CS_A, recuperados dentro del mismo año, estaban en un rango de 5-7 SNP separados. La distancia genética entre los aislados recuperados de los 10 rebaños infectados crónicamente fue de 2-4 SNP (mediana = 30), mientras que la diversidad genética fue menor en los aislados de los 5 rebaños restantes que no estaban infectados crónicamente con bTB (mediana de la distancia genética dentro del rebaño = 2 SNP, rango = 0-6).

En cinco de los 10 rehados infectados crónicamente, al menos el 60 % de los aislados recuperados en un rango de 2 a 5 años diferentes estaban a una distancia de 3 SNP entre sí (Tabla 2). De hecho, hubo una alta correlación positiva entre las distancias genéticas medias y el número de años diferentes a partir de los cuales se originaron los aislados en un reh (rho = 0,88, p < 0,001). Seis (M_A, M_C, M_D, M_H y M_J) de los siete rehados infectados crónicamente ubicados ubicados en Madrid incluyeron aislados similares (es decir, ≤3 SNP), casi similares (es decir, 4 SNP para M_C y M_H) y diferentes (es decir, >20Sin embargo, dos de estas manadas (M_D y M_H) produjeron aislados separados por distancias genéticas que oscilaron entre 29 y 37 SNP que se recuperaron en el mismo mes (Figura 4). Este patrón de distribución bimodal de las distancias genéticas por pares dentro del rebaño no fue evidente en el rebaño crónico restante de Madrid y en los rebaños crónicos ubicados en otras regiones (a saber, M_B, MA_A, NA_A y Z_B, Figura 4). Además, se identificó un evento de posible persistencia o reintroducción de cepas similares en el rehado M_G, como lo demuestran las cepas estrechamente relacionadas (6 SNP) en la manada encontrada con 5 años de diferencia (Figura 4).

Discusión

En este estudio, la información del WGS de un gran panel de aislados de M. bovis recuperados de varias especies y regiones animales de España se utilizó para comprender el potencial de transmisión entre especies y dentro de las especies y para dilucidar el papel de la vida silvestre en la transmisión de bTB. Este es el primer estudio geómico a gran escala que describe la diversidad de M. bovis en la interfaz ganado-salvaje de múltiples provincias/regiones de España y destaca el papel relevante que los enfoques genómicas y filogenéticos pueden tener para adquirir conocimientos sobre la epidemiología de la bTB.

Seleccionamos los aislados de SB0339, ya que este fue el tercer tipo de spoligo más frecuente en España, y el más frecuentemente recuperado tanto en las poblaciones de ganado como en las de vida silvestre. Se ha aislado de forma recurrente, principalmente de las regiones centro-sur y norte del país, con evidencia de transmisión entre especies (Garcia-Jimenez et al., 2013). Aunque otros espoligotipos también se han encontrado repetidamente en la interfaz ganado-salvaje (por ejemplo, SB0121 y SB0134), más de un tercio de todos los aislados de SB0339 provienen de jabalí, ciervos rojos y ciervos (la mayor proporción de aislados de vida silvestre para un tipo de spoligo dado en España; mycoDB Además, SB0339 representa el patrón molecular aislado con más frecuencia en Madrid, incluyendo >50% de todas las muestras de M. bovis recuperadas en la región (mycoDB.es).

La proporción más alta (72,8 %) de aislados incluidos en este estudio se recuperaron del ganado, mientras que 37 aislados SB0339 se recuperaron de diferentes especies de vida silvestre. Más de la mitad de ellos (n = 20) fueron recuperados del jabalí, que se considera el principal anfitrión de mantenimiento en la Iberia mediterránea (Munoz-Mendoza et al., 2013; Gortazar et al., 2015). Los aislados incluidos en el estudio se tomaron muestras en diferentes momentos (datos heterocrónicas) entre 2005 y 2018. Este amplio intervalo de tiempo se seleccionó dada la pequeña tasa de mutación de M. bovis [estimaciones medias entre 0,15 y 0,5 eventos por genoma por año (Biek et al., 2012; Trewby et al., 2016; Crispell et al., 2017)], lo que hace necesario comparar los aislados recuperados a través de largos períodos al intentar reconstruir Del total de muestras secuenciadas, el 84,6 % (n = 115) se recuperaron después de 2009, ya que el ADN viable y de alta calidad era difícil de recuperar de las muestras (especialmente de la vida silvestre) recuperadas durante el período 2005-2009. No había aislamientos disponibles antes de 2005 en el Centro VISAVET.

Los datos de todo el genoma de los 136 aislados bTB revelaron una gran cantidad de SNP adquiridos dentro de los grupos A y B, con aislados de 47-72 y 38-61 SNP aparte de su MRCA, respectivamente (datos no mostrados). Además, se podían distinguir siete clados distintos entre la colección secuenciada, de los cuales tres contenían secuencias de vida silvestre y de M. bovis derivadas del ganado. Estos resultados pueden no solo ser sugestivos de una larga historia de endémica, sino también que la infección por M. bovis se ha transmitido entre las poblaciones de ganado y vida silvestre en España durante mucho tiempo. De hecho, se esperaba un alto grado de diversidad genética en los aislados SB0339, dado que representa el 8% de todos los aislados de M. bovis tipados en España, y ha estado circulando en varias áreas de España durante largos períodos de tiempo (Rodriguez-Campos et al., 2010; Gortazar y Boadella, 2014).

Las distancias genéticas entre pares entre los aislados en el clado principal A.2 fueron las más bajas de todos los clados, a pesar de que incluían el mayor número de secuencias (74,3% de toda la colección) e incluían aislados tanto del ganado como de la vida silvestre recuperada durante un largo período de tiempo. La similitud entre las cepas de este clado recuperadas de diferentes especies huésped es sugerente de eventos de transmisión recientes y/o transmisión desde una fuente común (no muestreada). Se ha informado evidencia de la transmisión de M. bovis entre el ganado y la vida silvestre en numerosos estudios en todo el mundo, especialmente en áreas donde coexisten varias especies susceptibles. Un estudio que incluyó un total de 27 spoligotipos diferentes realizados en Cataluña, una región ubicada en el noreste de España, reveló la transmisión entre diferentes huéspedes (Perea et al., 2021). La investigación realizada en el Reino Unido mostró que los aislados de tejón estaban en un rango de 0 a 4 SNPs aparte del aislado de ganado más cercano, y que la transmisión se produjo con más frecuencia de tejón a ganado que viceversa (Biek et al., 2012; Crispell et al., 2019). Utilizando un enfoque bayesiano, un estudio reciente realizado en Francia reveló una alta tasa de transmisión entre especies entre poblaciones de ganado y tejón (Duault et al., 2022). Además, también se sugirió una alta tasa de intercambio genético entre el ganado muestreado y las poblaciones de vida silvestre en Nueva Zelanda (Crispell et al., 2017).

En general, el tiempo y el origen geográfico de los aislados fueron buenos predictores de distancias genéticas, independientemente de la especie huésped de origen del aislado. La heterogeneidad genética era geográfica en lugar de específica de la especie huésped, ya que los aislados recuperados de diferentes especies animales dentro de las mismas provincias tendían a estar más estrechamente relacionados que los que se originaron en las mismas especies y diferentes provincias. Sin embargo, a pesar del potencial de transmisión entre especies sugerido por los hallazgos de nuestro estudio, la agrupación general de aislados por especies huésped señaló que las cepas de M. bovis recuperadas de los huéspedes salvajes eran menos diversas que las procedentes del ganado, y que las distancias genéticas estaban asociadas con la provincia de origen (Figura 2; Tabla Suplementaria S2). Esto fue particularmente evidente en el caso de las muestras de jabalí, con aislados recuperados de las mismas provincias o vecinas a pocos SNP de distancia entre sí. De hecho, un estudio anterior realizado en Cataluña sugirió que la proximidad y el vecindario eran los dos factores de riesgo más importantes asociados con la heterogeneidad genética observada (Perea et al., 2021). En nuestro estudio, se observó una heterogeneidad sustancialmente mayor en las distancias genéticas por pares entre los aislados de ganado en España en comparación con los aislados de vida silvestre y los pares de ganado y vida silvestre, lo que podría deberse a la transmisión de un grupo más grande de cepas SB0339 en el reservorio de ganado que no llegan a la vida silvestre (Figura Por el contrario, en el análisis de las cepas de Madrid, la diversidad genética de los aislados recuperados del ganado y de la vida silvestre fue más similar. Aunque se identificó una homogeneidad genética sustancial a nivel spoligo-VNTR entre los aislados de ganado en Madrid en un estudio anterior (de la Cruz et al., 2014), los análisis de todo el genoma realizados aquí revelaron un alto grado general de heterogeneidad genética independientemente de la especie de origen del huésped, lo que sugiere una larga historia de circulación endémica SB Sin embargo, no había información disponible sobre los perfiles de VNTR para este estudio, ya que la mecanografía de VNTR ya no se realiza de forma rutinaria en nuestro laboratorio. A pesar de que se identificó una relación significativa entre la distancia genética y geográfica de M. bovis en la región, la falta de asociación de la especie huésped con la distancia genética que separa dos aislados recuperados de Madrid también puede ser sugerente de la evolución de cepas en huéspedes no muestreados no considerados aquí (que podrían incluir poblaciones de ganado sin enlace de transmisión con la vida silvestre, Por el contrario, si solo se consideraron en el análisis provincias con una gran proporción de aislados de ganado y vida silvestre (es decir, Madrid, Ciudad Real y Toledo), los resultados obtenidos fueron los mismos que los del análisis general de España (datos no mostrados). Este análisis confirmó que, incluso después de realizar una comparación más similar de la diversidad genética en regiones con un mayor número de aislamientos de vida silvestre, Madrid es representativo de un escenario de transmisión SB0339 complicado e interespecífico. Además, la diversidad genética general de los aislados incluidos en el clado A.2 (Figuras Suplementarias S2, S4) reveló resultados similares a los de Madrid, ya que no se identificaron diferencias significativas en las distancias encontradas entre los aislados de la misma especie (rango medio dentro del ganado = 31-32 SNP; mediana dentro de la vida silvestre = 27 SNP La gran heterogeneidad (rango 55-163 SNP) identificada cuando se comparó el clado A.2 con los clados restantes identificados en regiones distintas de Madrid (Tabla Suplementaria S2) está de acuerdo con la hipótesis de una larga historia de endémica de este tipo de spoligo establecida en este estudio. Sin embargo, las relaciones filogenéticas descritas en este estudio pueden ser particularmente sensibles al sesgo de selección en la población muestreada de Madrid frente a los aislados secuenciados generales recuperados en múltiples provincias de España, y las diferencias en el efecto observado explicado aquí deben interpretarse con precaución. A pesar de la asociación observada entre distancias genéticas y geográficas, en varios casos se recuperaron aislados genéticamente no relacionados (es decir, muy distintos) de lugares cercanos (y en algunos casos incluso de la misma manada), lo que sugiere que la infección podría haber ocurrido en un lugar diferente, particularmente en el ganado, ya que la mayoría (>81%) de los aislados de Desafortunadamente, los movimientos individuales de todo el ganado muestreado no estaban disponibles para este estudio y, por lo tanto, no se pudo confirmar la hipótesis de nuevas introducciones debido al movimiento de animales infectados.

Además, tres de los seis grupos de cepas muy similares (≤3 SNP) recuperadas del ganado y la vida silvestre se encontraron en Madrid (Figura 2; Figura complementaria S2). De hecho, el patrón SB0339 se ha encontrado de forma recurrente en determinadas zonas, especialmente en el Parque Natural del Monte de El Pardo ubicado en el municipio de Madrid y en Colmenar Viejo, donde factores de riesgo como la gestión extensiva de los rebaños y la abundante presencia de reservorios de fauna pueden explicar las interespecies observadas. similitud genética y que la prevalencia de la TBb se ha mantenido históricamente alta tanto en el ganado como en la vida silvestre (Aranaz et al., 2004; Rodriguez-Campos et al., 2010).

Los análisis de la diversidad genética dentro del rebaño en aislados de rebaños infectados crónicamente tuvieron como objetivo proporcionar cierta información sobre el grado de diferencia esperada a lo largo del tiempo en un rebaño dado, lo que podría ayudar a diferenciar la fuente de un brote (es decir, recaída frente a la reinfección; Hatherell et al., 2016). Aquí se utilizó un umbral de ≤ 3 SNP para definir grupos de transmisión en los que estamos seguros de que cepas similares están circulando en diferentes huéspedes. Este valor fue inferior al seleccionado en el estudio realizado en Cataluña, donde se consideró una distancia por pares de ≤12 SNPs para definir grupos de transmisión putativos basados en los patrones de agrupación observados (Perea et al., 2021). En nuestro estudio, los aislados con ≤3 SNP se consideraron estrechamente relacionados porque la mayoría de los aislados epidemiológicamente vinculados recuperados de la misma manada y muestreados dentro del mismo año no superaron este nivel de divergencia. Cuando se aplicó un umbral de ≤ 10 SNPs en nuestros análisis, 2 rehadas adicionales (a saber, CS_A y M_H) de las 15 rehadas analizadas tenían >50% de las cepas muestreadas dentro de este corte circulando durante el período muestreado (Figura 4). El uso de diferentes umbrales puede afectar a las inferencias sugeridas aquí (es decir, recaída frente a nuevas presentaciones). Sin embargo, nuestro objetivo aquí era identificar grupos de patrones moleculares que probablemente hayan surgido de los vínculos epidemiológicos en lugar de la adquisición de SNP derivados del proceso de evolución. Además, seleccionamos este duro límite, ya que coincidió con el derivado de la revisión ampliada de la literatura del MTBC para identificar con precisión los eventos de transmisión, recaída y reinfecciones recientes (Kato-Maeda et al., 2013; Roetzer et al., 2013; Lee et al., 2015). En general, identificamos una fuerte relación de tiempo y origen espacial y variabilidad genética, de modo que esos factores fueron muy informativos para caracterizar la circulación, ya que los aislados tendían a agruparse en un patrón dentro del rebaño. Las distancias genéticas observadas tanto entre los rebaños como dentro de los rebaños fueron muy heterogéneas dependiendo de la historia epidemiológica (número de años con aislamientos de bTB en la manada), ya que las distancias genéticas medianas por pares observadas en los 10 rebaños muestreados crónicamente variaron en gran medida (rango 2-4 SNP) en comparación Esto se esperaba, ya que las manadas no infectadas crónicamente se tomaron muestras durante un período de 1 año frente a un número medio de 3,5 años diferentes con aislamientos en rejas infectadas crónicamente. Sin embargo, en la mitad de los rederos infectados crónicamente, la mayoría de los aislados recuperados durante varios años estaban separados por ≤ 3-SNP. La limitada diversidad genética dentro del rebaño que se encuentra de forma recurrente en varios rebaños muestreados, en muchas ocasiones a pesar del tiempo considerable transcurrido entre sus aislamientos, sugiere que los animales infectados crónicamente en el rebaño (que se habrían perdido en las pruebas de rebaño bTB) pueden haber contribuido a la persistencia de la enfermedad (Guta et al. Además, la agrupación genética de cepas procedentes de los mismos rehados (y mismas provincias) indicó que M. bovis circulaba continuamente en los rehados muestreados (sin la introducción de nuevas cepas). Alternativamente, la persistencia de cepas muy similares también puede sugerir reintroducciones de otras fuentes, como rehadas vecinas, persistencia ambiental o huéspedes alternativos, como se sugiere en otros lugares (Biek et al., 2012).

La diversidad genética observada en los aislados de M. bovis analizados por SB0339 no fue aparentemente causada por las recientes introducciones exógenas en España. En cambio, las distancias genéticas observadas sugirieron una infección endémica de automantenimiento dentro de diferentes especies animales en cada región, con ciertos eventos de transmisión entre especies, lo que fue particularmente evidente en el caso de Madrid. A pesar del pequeño tamaño de la muestra incluido en este estudio, este cuadro está de acuerdo con los hallazgos de estudios anteriores en España y en otros lugares sobre el efecto potencial de los factores de riesgo locales (es decir, proximidad espacial, gestión extensa en rejas de carne de vacuno, contacto con otras fuentes de infección) en áreas endémicas de bTB (Green et al., Además, nuestros resultados están de acuerdo con un estudio anterior realizado en Portugal, donde la diversidad genética observada apoyó la circulación natural de M. bovis durante mucho tiempo con múltiples interacciones de diferentes especies huésped (Reis et al., 2021). La interacción con los reservorios de vida silvestre se identificó como la segunda causa más importante de colapsos de la manada en España, después de la infección residual (Guta et al., 2014a). De hecho, los aislados de M. bovis recuperados de especies de vida silvestre en el Parque Nacional de Doñana eran de hecho más prevalentes en el ganado, contribuyendo así a la persistencia de bTB (Romero et al., 2008). El ganado y los tejones encontrados en el norte de España en la misma área geográfica y durante el mismo período compartieron espoligotipos similares, lo que sugiere una dinámica común de la infección (Balseiro et al., 2013). Teniendo todo en cuenta, la mayor diversidad de huéspedes identificada en la epidemiología de bTB en España conduce a cadenas de transmisión más crecientes y diversas (Barasona et al., 2019). También se identificaron vínculos epidemiológicos entre diferentes huéspedes que involucran a la misma especie analizada aquí (es decir, jabalí y ciervos rojos) en países vecinos como Portugal (Cunha et al., 2012; Reis et al., 2020) y Francia (Hauer et al., 2015; Michelet et al., 2019), aunque se identificaron diferentes patrones moleculares. Los resultados obtenidos aquí son importantes teniendo en cuenta el grado relativamente alto de persistencia que existe en varias regiones de España, como las partes central y suroeste del país.

El muestreo de diferentes especies huésped realizadas aquí coincidió en unidades temporales (años) y espaciales (provincia de origen) similares. Sin embargo, debido a la fuerte dependencia de la disponibilidad de aislamiento en la recolección de cepas VISAVET y al grado moderado de éxito (~60%) en la recultivo de los aislados, los sesgos incluidos en este estudio fueron inevitables.

El potencial de los análisis derivados de WGS puede verse comprometido cuando una población huésped mal muestreada contribuye a la transmisión, que en este caso podrían ser los reservorios de vida silvestre. Además, el muestreo de la población huésped a menudo se limita a las investigaciones de brotes en las que el muestreo se reduce a los rebaños afectados y la inclusión de otras fuentes, como granjas cercanas o reservorios de vida silvestre, enfrenta limitaciones financieras, éticas o logísticas. Más de la mitad de los aislamientos de fauna silvestre incluidos aquí (n = 20) se originaron a partir de muestras recolectadas de jabalíes, principalmente de Madrid, y la mayoría (n = 15/17) de los aislamientos de M. bovis de ciervo y gamo se muestrearon en las regiones centrales del país también. Por el contrario, otras provincias estaban claramente infrarrepresentadas en nuestra colección: el centro de España recibió un muestreo más intensivo en comparación con las regiones del sur, donde la tuberculosis bovina es muy frecuente tanto en el ganado como en la vida silvestre (Ministerio de Agricultura, Pesca, Alimentación y Medio Ambiente, 2020; Ministerio de Agricultura , Pesca y Alimentación, 2021). El esfuerzo de muestreo diferencial entre regiones puede haber afectado la solidez de nuestros hallazgos, particularmente con respecto a la vida silvestre, al considerar todo el país. Por lo tanto, nuestros hallazgos no deben extrapolarse a otras áreas a menos que estudios adicionales confirmen el grado de diversidad dentro y entre las especies que se encuentran aquí. No obstante, los aislados pertenecientes al espoligotipo SB0339 proceden mayoritariamente de Madrid, que fue la región más intensamente muestreada y en la que se consiguió un mejor equilibrio ganado-fauna (49% del total de aislados, relación ganado:fauna MADRID 2:1 Vs. ganado: vida silvestreOVERALL 3:1). Con respecto al ganado, se implementaron estrategias similares de prueba y sacrificio basadas en pruebas anuales utilizando la prueba única de tuberculina intradérmica en todas las provincias incluidas aquí durante el período de estudio y, por lo tanto, una representación razonable de ganado bTB positivo infectado con SB0339 circulando en España. estaba disponible. Aunque el control y la vigilancia de la TBb en la vida silvestre no están tan estandarizados como en el ganado bovino y había menos aislamientos de vida silvestre disponibles para el análisis, se recuperó una gran fracción de aislamientos de vida silvestre de Madrid (con una alta prevalencia de TBb y densidad de vida silvestre), lo que sugiere que los resultados observado aquí puede ser una buena aproximación del escenario real de SB0339 no solo en el ganado, sino también en la vida silvestre (Ministerio de Agricultura, Pesca, Alimentación y Medio Ambiente, 2020; Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2021).