Introducción

La tuberculosis bovina (TBB), una enfermedad crónica diseminada en todo el mundo, afecta a los países agrícolas. Su agente etiológico, Mycobacterium bovis, infecta a una amplia gama de mamíferos, incluidos los humanos. Los programas de control y erradicación de esta enfermedad consisten en una política de «prueba y sacrificio» mediante el uso de la prueba cutánea de la tuberculina in vivo (TST) como herramienta primaria de cribado (1). La TST es muy eficaz, pero tiene limitaciones. El diagnóstico puede verse comprometido por las altas tasas de exposición a micobacterias no tuberculosas (MNT) (2) y la existencia de no reactores a las pruebas de cribado. Informes previos mostraron la presencia de animales falsos negativos a las pruebas de cribado en rebaños endémicos (3-10).

Los bovinos falsos negativos de TST constituyen un desafío para la sanidad del rebaño, ya que permanecen en el rebaño como fuente de infección. En Argentina, Garbaccio et al. (5) reportaron que el 76% de los bovinos lecheros falsos negativos de TST también fueron negativos para el IGRA, lo que sugiere que las pruebas basadas en la respuesta inmune mediada por células detectan parcialmente la infección entre estos animales. Además, la respuesta humoral detecta falsos negativos de TST en bovinos de rebaños endémicos, lo que probablemente se asocie a etapas tardías de la enfermedad (4, 5, 10). Sin embargo, algunos animales con falsos negativos de TST e IGRA podrían estar en una etapa pre-serológica y, por lo tanto, no serían detectados en los rebaños.

Los bovinos falsos negativos para la PT presentaron lesiones macroscópicas exacerbadas con un compromiso multiorgánico predominante (5), que puede ocurrir debido a la diseminación hematógena de los bacilos desde el área de infección primaria. Este hecho sugiere que las micobacterias viables podrían ser detectables en muestras de sangre, como se ha confirmado previamente en bovinos infectados de forma natural (11). En cuanto a la detección de M. bovis en sangre, estudios previos desarrollaron diferentes PCRs específicas en sangre, dirigidas a secuencias de M. bovis (mpb70, gen esxB, región RD4, IS6110), con resultados variables (12-16).

Zumárraga et al. (17) desarrollaron un ciclo de aterrizaje para PCR, con el elemento IS6110 como diana (IS6110 TD-PCR), que es altamente específico para los miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) (17). La TD-PCR IS6110 mostró una sensibilidad mejorada en comparación con la IS6110-PCR estándar y detectó ADN de M. bovis en diferentes muestras biológicas (tejidos, leche, hisopos nasales) y cultivos de colonias (PCR de colonias), para su diagnóstico directo en bovinos infectados de M. bovis (17-20). Sin embargo, la utilidad de la TD-PCR IS6110 en muestras de sangre sigue sin explorarse.

El objetivo del estudio fue evaluar el rendimiento de la TD-PCR IS6110 en bovinos falsos negativos TST de rebaños endémicos de tuberculosis bovina. Los resultados confirman la presencia de ADN de M. bovis en sangre, y constituyen evidencia para futuros estudios que evalúen la utilidad de la técnica en una etapa pre-serológica de la infección.

Materiales y métodos

Diseño del estudio

Se realizó un estudio de casos y controles para evaluar el rendimiento de la PCR IS6110 TD en sangre de bovinos Holstein frisones (n = 151), predominantemente mayores de 2 años, con TBB confirmada. Los animales provenían de 31 hatos lecheros diferentes bajo programas de saneamiento ubicados en la región lechera productiva central de Argentina.

El grupo control (n = 81) incluyó bovinos positivos a la PT de acuerdo con los lineamientos oficiales argentinos. La selección de casos (n = 70) se realizó entre los no reactores a la PT, considerando aquellos animales positivos para respuesta humoral contra M. bovis mediante Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) (5). La sangre de los casos y controles se analizó mediante PCR.

Los casos también fueron analizados por IGRA, como una prueba auxiliar a la TST que también evidencia una respuesta inmune mediada por células.

El patrón patológico se evaluó en la inspección del matadero para caracterizar la presentación de la enfermedad entre los casos. Se registró como un órgano con lesiones o más de un órgano con lesiones (lesiones multiorgánicas).

Se confirmó la presencia de tuberculosis bovina en los animales que dieron positivo en al menos una de las siguientes pruebas: bacteriología, histopatología-tinción de ZN y PCR de tejidos.

Prueba cutánea de la tuberculina

Los veterinarios acreditados realizaron la TST del pliegue caudal (CF-TST) de acuerdo con las directrices oficiales del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Ley 128/12)¹. Debido a que la CF-TST se aplicó en rebaños en saneamiento, un animal que presentó un aumento del grosor de los pliegues cutáneos ≥3 mm fue positivo (prueba de interpretación severa).

Ensayo de liberación de interferón gamma (IGRA)

Todos los casos fueron analizados por el IGRA. La sangre heparinizada (200 μL) de la vena yugular se estimuló con 25 μL de los siguientes antígenos: Tuberculina aviar PPD 2500 (250 UI/mL), Tuberculina bovina PPD 3000 (300 UI/mL), solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) 1X y BOVIGAM® Pokeweed Mitogen (5 μg/mL) en una placa de cultivo celular de 96 pocillos. El plasma recolectado se almacenó a -20 °C para la medición de γ-IFN mediante ELISA utilizando un ELISA comercial de microplacas de γ IFN bovino. La estimulación sanguínea, el ELISA y la interpretación de los datos (interpretación estándar, punto de corte = 0,1) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit de tuberculosis BOVIGAM, Thermofisher).

Detección de la respuesta humoral mediante ELISA

Sueros humorales probados con ELISA de animales TST no reactores. Se obtuvo sangre (10 ml) de la vena yugular entre 15 y 20 días después de la prueba de fibrosis quística. El suero (100 μL, 1.100 en solución PBS 1X), se centrifugó a 2500 g y luego se utilizó para probar anticuerpos contra el derivado purificado de proteína bovina (PPDB). El ELISA consistió en una etapa de unión (12 μL de PPDB por pocillo, 1 μg/mL) realizada durante la noche a 4 °C, una etapa de lavado (cinco veces con una solución de PBS 1X-Tween 0,5, 1% de leche desnatada) y una etapa de incubación con sueros (100 μL, diluido 1.100 en solución de PBS 1X) 1 h a 37 °C. La placa se lavó con PBS 1X y se adicionaron 100 μL de anticuerpo conjugado anti-IgG-Peroxidasa bovina (Sigma, dilución 1:7000) para incubar las muestras con este anticuerpo secundario durante 1 h a 37°C. Los platos se lavaron cinco veces más. Finalmente, 100 μL del sustrato revelador (Tampón Citrato + ABTS (Sigma) + H₂O₂) se añadieron y se incubaron durante 10 min en la oscuridad. La lectura de la reacción se realizó a 405 nm. Las densidades ópticas (DO) ≥ 0,42 clasificaron a los animales como positivos (5).

PCR en sangre

Se obtuvo sangre (10 mL) anticoagulada con EDTA (0,5 mg/mL) de la vena yugular. La extracción de ADN se realizó con un kit comercial (kit PuriPrep-S, InbioHighway), siguiendo las instrucciones del fabricante. Como la PCR en sangre no es un protocolo rutinario que se realiza en nuestro laboratorio, se realizaron algunas evaluaciones antes de comprobar la presencia de ADN de M. bovis en las muestras. La calidad (A₂₆₀nm/A₂₈₀nm) y la concentración (A₂₆₀) se evaluaron mediante espectrofotometría (NanodropTM, Thermo Fisher Scientist). La integridad del ADN también se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% (tampón TAE 1X, 80 voltios durante 60 min.) teñido con 5 μg/mL de bromuro de etidio (Promega, EE.UU.). También se realizó la amplificación de un fragmento de 450 pb del gen endógeno de ARN ribosómico mitocondrial 16S (16SRNArmt) (21) mediante el uso de la ADN polimerasa GoTaq® G2 (Promega, EE. UU.). Los productos de amplificación se visualizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,2% (tampón TAE 1X, 90 voltios durante 45 min) teñido con bromuro de etidio, como se ha descrito anteriormente, y con un marcador de peso molecular de 100 pb (100 pb Plus DNA Ladder, Trans, China).

La presencia de ADN de M. bovis en sangre se evaluó utilizando un fragmento específico de MCT IS6110 (IS6110 TD-PCR) utilizando el kit HotStarTaq® Master Mix (Qiagen, EE. UU.), como se describió anteriormente (17). Los productos se visualizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2% (tampón TAE 1X, 80 voltios durante 45 min) teñido con bromuro de etidio, como se ha descrito anteriormente, y con un marcador de peso molecular de 100 pb (100 pb Plus DNA Ladder, Trans, China). El producto de amplificación esperado era de 245 pb.

Inspección post mortem y toma de muestras

Los veterinarios oficiales realizaron una inspección detallada en busca de lesiones compatibles con la tuberculosis bovina, de acuerdo con los procedimientos oficiales del matadero. Se tomaron muestras de porciones representativas de los ganglios linfáticos (LN) retrofaríngeos y submandibulares, respiratorios (LN traqueobronquiales y mediastínicos, y pulmón), digestivos (LN mesentéricos y hepáticos, e hígado) y mamarios (ubre y supramamarios) en contenedores individuales para realizar PCR de tejidos y bacteriología. Además, otras piezas fueron dispuestas en recipientes con formalina tamponada al 10% para la fijación de tejidos para histopatología. En cuanto a los casos, después de realizar la inspección patológica, los animales se clasificaron como aquellos que presentaban un órgano con lesiones macroscópicas o aquellos con lesiones multiorgánicas.

Bacteriología e histopatología

Para bacteriología, 30 g de cada tejido se cortaron en trozos pequeños con unas tijeras y se colocaron en una bolsa estéril con 20 mL de agua estéril de doble destilación. Se realizó una maceración de 3 min. (Basic Masticator, IUL Instruments tipo 470, España) y el homogeneizado se descontaminó por el método de Petroff (22). Se inoculó una alícuota de 2 mL de cada muestra descontaminada en medios sólidos Stonebrink a base de huevo a 37 °C con observación quincenal, durante al menos 8 semanas. Esta inoculación se realizó por triplicado. Las colonias sospechosas de M. bovis se tiñeron con Ziehl-Neelsen (ZN) para identificar bacterias acidorresistentes (23). Para la histopatología, las muestras fijas se deshidrataron con diferentes soluciones alcohólicas de concentración creciente (50, 70, 80, 95% y etanol absoluto), posteriormente se clarificaron con xileno y, finalmente, se incluyeron en parafina. Los tapones de parafina se cortaron en secciones de 5 μm de espesor (Leica RM2125 RTS, Biosystems), se desparafinaron, se hidrataron y se tiñeron con hematoxilina-eosina y tinción con ZN (23).

PCR de tejidos

Se utilizaron indistintamente dos PCR diferentes para comprobar la presencia de ADN de M. bovis en los tejidos recogidos: la TD-PCR IS6110 (17), con un producto esperado de 245 pb, y una PCR de aterrizaje adaptada a partir de una PCR anidada Rv2807 (TD-PCR Rv2807) previamente descrita (24). El ADN de los tejidos se obtuvo utilizando un kit de extracción comercial (ADN PuriPrep-T Kit, InbioHighway, Argentina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó la ADN polimerasa GoTaq® G2 (Promega, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, la etapa de adaptación de la TD-PCR Rv2807 consistió en una desnaturalización inicial a 96 °C durante 3 min, con ocho ciclos de 96 °C durante 1 min, con una temperatura de recocido que se redujo gradualmente de 72 °C a 64 °C, y una etapa de extensión a 72 °C durante 1 min. El procedimiento fue seguido por 30 ciclos que incluyeron una etapa de desnaturalización a 96 °C durante 1 min, recocido a 66 °C durante 1 min, extensión a 72 °C durante 1 min 45 s y una extensión final a 72 °C durante 8 min. El producto de amplificación esperado fue de 443 pb. Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 2% (tampón TAE 1X), 80 voltios durante 45 min, teñido con 5 μg/mL de bromuro de etidio (Promega, EE. UU.) y comparado con un marcador de peso molecular de 100 pb (100 pb Plus DNA Ladder, Trans, China). La digitalización de las imágenes se realizó en un analizador genético Geldoc (Bio-Rad Laboratories).

Análisis estadístico

La comparación estadística de proporciones se realizó con el software EpiDat versión 3.0 (Xunta de Galicia, OPS-OMS). Los valores de p calculados iguales o inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Se analizó la concentración y calidad del ADN para identificar valores atípicos significativos (p > 0,05) mediante la prueba de Grubbs (25). La distribución de los datos se probó mediante la prueba de Shapiro Wilk con mediana y rango intercuartílico de 25-75 (RIQ_25–75) como estadística descriptiva. Las comparaciones de medias se realizaron mediante la prueba t de Student no apareada (GraphPad Software, Inc.). Se utilizó el Test exacto de Fisher para evaluar la asociación entre los resultados de la TD-PCR IS6110 en sangre y el perfil patológico.

Resultados

La prueba IGRA in vitro, que representa una herramienta adicional que mide la respuesta inmune mediada por células, registró un 55,4% de negatividad entre los casos. Este resultado muestra que los animales, positivos o negativos a esta prueba de tamizaje auxiliar, estuvieron representados de manera similar dentro de los bovinos falsos negativos CF-TST (p > 0.05) (Tabla 1).

En la inspección del matadero, los casos presentaron 97,1% de lesiones macroscópicas compatibles con TBB. De estos animales, el 80,9% desarrollaron lesiones multiorgánicas y, en menor proporción, el 19,1% de ellos granulomas limitados a un órgano. Dos animales carecían de lesiones macroscópicas, aunque con resultado positivo de tinción histopatológica-ZN (Tabla 1).

Se realizó extracción de ADN de sangre en todos los bovinos estudiados (n = 151). La mediana de la concentración genómica de ADN de los casos fue de 5,9 ± 3,6; 11,2 ng/μL, significativamente inferior a la obtenida en el grupo control, en el que la mediana de concentración fue de 27,0 ± 19,0; 56,3 ng/μL (p < 0,0001). A pesar de esta diferencia, la calidad de las plantillas según A_260nm/Un_280nm y los resultados positivos para la PCR 16SRNArmt sugirieron buenas condiciones del ADN extraído (Figura suplementaria 1). Por lo tanto, la plantilla fue útil para otras determinaciones posteriores, como la TD-PCR IS6110.

La PCR en sangre realizada en casos y controles (n = 151), arrojó un 22% de positividad para la TD-PCR IS6110. La estratificación de los datos reveló que el 27,2% de los controles fueron positivos para la TD-PCR IS6110, mientras que una proporción menor (15,7%) de los casos fue positiva para esta prueba; sin embargo, las diferencias no fueron significativas (p = 0,134).

Por otro lado, la TD-PCR IS6110 arrojó resultados positivos significativamente mayores en animales con lesiones focalizadas (46,2%), en comparación con animales con lesiones multiorgánicas (7,3%) (p = 0,002). Además, el 66,7% de las muestras positivas para TD-PCR IS6110 fueron IGRA negativas (Tabla 1).

Discusión

La tuberculosis bovina, un problema de salud para los animales y los seres humanos, es una enfermedad milenaria distribuida en todo el mundo, que se encuentra entre las principales amenazas zoonóticas (26). En la actualidad, los bovinos falsos negativos de TST constituyen un reto para el diagnóstico, ya que estos animales permanecen en los rebaños que propagan la enfermedad. Algunos de estos bovinos tampoco reaccionan a las herramientas de diagnóstico auxiliares como el IGRA (3, 5).

En Argentina, nuestro grupo reportó casos de estos bovinos falsos negativos para TST con resultados negativos repetidos para CF-TST y una patología multiorgánica predominante en hatos en saneamiento, la mayoría de estos animales fueron negativos para IGRA (5). En España, los bovinos doble negativo TST e IGRA fueron identificados como positivos para bacteriología. Los investigadores informaron que estos animales produjeron una proporción significativamente mayor de cultivo positivo en el ganado vacuno de carne en comparación con el ganado lechero (3).

En las infecciones experimentales, M. bovis promueve un predominio de la inmunidad mediada por células, pero con anticuerpos bajos o ausentes durante las etapas iniciales. La respuesta humoral aumenta a medida que avanza la infección, lo que se asocia a la exacerbación de la patología de la enfermedad (27, 28). Los bovinos falsos negativos de TST exhiben una respuesta humoral, y estudios previos demostraron que la detección de anticuerpos contra M. bovis podría contribuir a identificar a estos animales en rebaños naturalmente endémicos (5, 6, 10). Sin embargo, la asociación de anticuerpos con estadios más tardíos de la enfermedad podría limitar el rendimiento de las herramientas basadas en la serología para detectar aquellos bovinos falsos negativos que aún no han alcanzado este estadio humoral.

El presente estudio constituye una evidencia valiosa para comprender cómo tratar este fenotipo en rebaños endémicos de tuberculosis bovina. Sin embargo, es importante destacar que los resultados aquí obtenidos están sesgados dados dados los criterios de selección para identificar bovinos falsos negativos CF-TST en hatos endémicos. Esta selección se basó en la presencia de respuesta humoral. Algunas preguntas siguen abiertas: ¿Se pueden identificar los bovinos falsos negativos de doble TST e IGRA antes de la etapa humoral? ¿Hay animales falsos negativos con lesiones pero sin respuesta humoral, a pesar de un supuesto estadio avanzado de la infección?

La detección del genoma de M. bovis en muestras de sangre constituye un enfoque poco desarrollado entre los reactores positivos en la literatura, y sin antecedentes entre el fenotipo falso negativo de CF-TST. En Etiopía, la PCR dirigida al gen mpb70 de M. bovis en muestras de sangre detectó una proporción significativamente mayor (68%) de animales positivos (12) que la obtenida en la presente investigación (p < 0,0001). Estos animales pertenecían a bovinos infectados crónicamente, según lo examinado por el TST cervical. En nuestro estudio, los bovinos positivos a CF-TST procedían de rebaños en saneamiento, donde no se espera que los bovinos altamente infectados estén presentes durante un período prolongado. Estas diferencias podrían limitar la sensibilidad de la TD-PCR IS6110 en muestras de sangre. Por el contrario, un estudio indio anterior no informó de muestras de sangre positivas para IS6110-PCR de bovinos positivos para TST cervical con infección confirmada (14). Los investigadores utilizaron el método de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico para extraer el ADN, en contraste con el presente estudio y la investigación de Elsohaby et al., que utilizaron kits comerciales optimizados. Thakur et al. no realizaron controles de la cantidad y la calidad del ADN extraído, que son esenciales para garantizar la utilidad de una muestra de ADN para aplicaciones posteriores, incluida la PCR (29).

Mediante la realización de la TD-PCR IS6110 en leche bovina, Zumárraga et al. (20) demostraron la presencia de M. bovis en hatos libres de tuberculosis bovina de un área productiva lechera con focos de infección en la provincia de Santa Fe, Argentina. Con base en este estudio, las autoridades incorporaron la detección de M. bovis en hatos lecheros como herramienta complementaria de vigilancia en el Plan Regional para el control y erradicación de la tuberculosis bovina en la provincia de Santa Fe (Ley 949/12, Ministerio de la Producción de la provincia de Santa Fe, Argentina). Sin embargo, los resultados del presente estudio sugieren que el uso de PCR para muestras de sangre podría ser útil, no solo para el ganado lechero, sino también para el ganado vacuno de carne, y en todos los períodos del ciclo productivo.

A pesar de las lesiones multiorgánicas predominantes observadas entre los bovinos falsos negativos para CF-TST, este patrón patológico no necesariamente reflejaría una mayor presencia de ADN micobacteriano en sangre.

Una posible explicación sería que el ADN desnudo circulante, bacilos viables asociados a bacteriemia o ambos, podrían estar presentes en la sangre pero de forma intermitente.

Los bovinos falsos negativos de CF-TST limitan el saneamiento de los rebaños infectados por la tuberculosis bovina basándose en la aplicación de pruebas de cribado ante mortem, lo que apoya la búsqueda de mejores herramientas de diagnóstico. Los resultados aquí presentados, aunque preliminares, confirman la presencia de ADN de M. bovis en muestras de sangre bovina de bovinos falsos negativos CF-TST, lo que sugiere la utilidad de esta técnica a considerar. Sin embargo, otros estudios realizados en una etapa pre-serológica podrían proporcionar más evidencia sobre la contribución real de la técnica en rebaños.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración ética

Los estudios en animales fueron aprobados por el CICUAE Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, CICVyA. Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales. No se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio debido a que el estudio se realizó en rebaños endémicos. Los animales detectados como infectados por M. bovis deben ser enviados al matadero debido a que la infección en Argentina es una enfermedad de declaración obligatoria.

Contribuciones de los autores

MEn: Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Metodología, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. XF: Curación de datos, metodología, redacción, revisión y edición. RS: Curación de datos, Investigación, Metodología, Redacción, revisión y edición. VR: Curación de datos, metodología, redacción, revisión y edición. CG: Curación de datos, metodología, redacción, revisión y edición. FD: Curación de datos, Investigación, Metodología, Redacción – revisión y edición. AM: Investigación, Metodología, Redacción – revisión y edición. GM: Investigación, Metodología, Redacción – Revisión y Edición. MZ: Conceptualización, Obtención de Fondos, Recursos, Supervisión, Redacción – Revisión y Edición. SG: Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Obtención de fondos, Administración de proyectos, Recursos, Supervisión, Redacción, revisión y edición. MEi: Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Obtención de fondos, Metodología, Administración de proyectos, Recursos, Supervisión, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición.

Financiación

El/los autor/es declaran/n que se recibió apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. El presente estudio contó con el apoyo de las siguientes fuentes de financiamiento: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria PNSA-PDi-113, PICT 2019 04085, PICT Start Up 2019 00038 y PIP 2021-2023 11220200101912CO.

Reconocimientos

Los autores agradecen a Julia Sabio y García por la revisión inglesa del manuscrito. MEi y MZ son investigadores del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas de Argentina (CONICET).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2024.1359205/full#supplementary-material

FIGURA S1 | Características de las plantillas de ADN y de la TD-PCR IS6110 en bovinos falsos negativos para CF-TST. (A) Concentración y calidad del ADN. El diagrama de dispersión de la concentración (ng/μL) y la calidad (proporción A260/A280) del ADN de las muestras de sangre de bovinos falsos negativos para CF-TST (n = 70) se determinó mediante espectrofotometría. Los valores atípicos, previamente identificados por la prueba de Grubbs (GraphPad), se excluyeron del análisis estadístico. B) Plantillas de integridad del ADN obtenidas a partir de muestras de sangre bovina. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% teñido con bromuro de etidio para evaluar la integridad del ADN y la contaminación por ARN de las muestras (muestra de carga: 5 μL). S1-S9 se refiere a nueve ADN genómicos diferentes extraídos de muestras de sangre pertenecientes a bovinos falsos negativos de CF-TST. El «alto peso molecular» representa la región del gel que se espera que muestre ADN no alterado, como una banda densa de ADN genómico de alto peso molecular. «Degradación» muestra la región del gel en la que se visualiza la degradación del ADN genómico, observada como una banda continua y difusa, y finalmente, la «contaminación por ARN» indica el área del gel en la que se espera detectar el ARN contaminante que ha coeluido con el ADN genómico durante el proceso de extracción. (C) Amplificación de IS6110 TD-PCR en muestras de sangre bovina. Electroforesis en gel de agarosa al 2% para visualizar la amplificación de la diana IS6110 en muestras de sangre de bovinos falsos negativos para CF-TST. La flecha roja indica una banda de 245 pb correspondiente a la secuencia de amplificación IS6110. S1-S9 se refiere al ADN extraído de diferentes animales. PC, control positivo (ADN de M. bovis, cepa AN5). CC, control de la contaminación (agua libre de DNasa y RNasa); MWM: marcador de peso molecular.

Referencias