Introducción

La placenta es un órgano demasiado complejo de vital importancia en el embarazo equino. La placenta de Mare como tipo epitelicorial, permite el contacto directo del epitelio endometrial con la superficie coriónica, a través de seis capas de tejido que separan la circulación materna de la circulación fetal, durante todo el embarazo (1–3). Este órgano permite nutrir al feto a través del intercambio metabólico de nutrientes, el suministro de oxígeno y la eliminación de desechos, proporcionando protección contra las agresiones internas y externas (4). Como placenta microcotyledonaria y difusa, también presenta una distribución uniforme de vellosidades coriónicas en la superficie materna, que se unen al epitelio materno formando microcotiledóneones bien distinguidos (2, 3).

En la práctica clínica equina, el examen meticuloso de la placenta, principalmente mediante una inspección anatomía grossosa, es un procedimiento de rutina (5). En la yegua, las alteraciones de la placenta pueden ser un signo de mal funcionamiento. A pesar de los marcadores de diagnóstico de sangre propuestos, el valor de un clínico experimentado que examina a la yegua es esencial (6). Es bien sabido que la nutrición fetal intrauterina influye tanto en la salud del foal (7, 8) como en su rendimiento atlético (9, 10). Sin embargo, independientemente de la especie animal, el examen macroscópico de la placenta no revela lesiones microscópicas que solo se detectan mediante examen histológico o observación de microscopía electrónica, y que podrían estar relacionadas con la muerte fetal, el bajo peso corporal neonatal o la enfermedad (11-14).

El envejecimiento de las yeguas se ha relacionado con el aumento de la fibrosis en el endometrio (15, 16) y el oviducto (17), y varias alteraciones patológicas en la placenta (13, 18). De hecho, durante la gestación de la yegua, además de las alteraciones morfológicas y los cambios degenerativos en los microplacentomas en la superficie de la placenta de la yegua, también el desarrollo de los lechos capilares fetales y maternos dentro de cada microplacentoma disminuye, perturbando el contacto físico y hematológico en la interfaz fetomater En otras especies, la vascularización de la placenta también es extremadamente importante, como en la cerda (11), la perra (14) y en la mujer (19). De hecho, en los seres humanos, la reducción de la vasculatura de la placenta se relaciona con frecuencia con la restricción del crecimiento fetal intrauterino (19).

El tejido fibrótico se caracteriza por la deposición excesiva de componentes de la matriz extracelular, como el colágeno, la fibronectina y el ácido hialurónico, debido a la activación, proliferación y acumulación de fibroblastos y miofibroblastos (20). De esta manera, el tejido fibrótico puede desregular el funcionamiento normal y la arquitectura de un órgano (21). La fibrosis se desarrolla a partir de un proceso inflamatorio crónico, en el que tanto los mecanismos de inmunidad innata como la adquirida desempeñan un papel importante (22), y donde la inflamación y la remodelación tisular ocurren simultáneamente (23). Los fibroblastos, una vez activados, se diferencian en miofibroblastos que inician la deposición de componentes del tejido conectivo, remodelando y destruyendo progresivamente la arquitectura del tejido (24). Aunque el colágeno existente en la placenta humana está relacionado con el desarrollo normal de la placenta, también se ha asociado a complicaciones metabólicas de la función placentaria (25). Los tipos de colágeno I, III, IV y V participan activamente en la formación del proceso fibrótico de las vellosidades coriónicas de la placenta humana (26).

Un cuerpo de evidencia muestra que en varias especies, las deficiencias en la estructura y función placentaria pueden reflejarse en el deterioro del desarrollo y el crecimiento fetal con la disminución del peso al nacer de los recién nacidos (13, 14, 18, 27). Por lo tanto, hemos planteado la hipótesis de que a medida que envejecen las yedas, la fibrosis en la placenta aumenta y la microvascularización disminuye, lo que conduce a una reducción en el peso del foal. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar en tres porciones (cina de gravedad, cuerno no de gravedad y cuerpo) de la placenta de las yedas (i) la transcripción del gen del colágeno (COL1A1A1, COL1A2, COL3A1, COL5A1); (ii) la proteína de colágeno total (hidroxiprolina);

Materiales y métodos

Identificación de la yegua

Dieciséis yeguas embarazadas de diferentes razas (Lusitano, Trotter francés, anglo-a Arabian, Hannover y KWPN) de la misma granja de sementales fueron seleccionadas al azar y agrupadas en dos categorías, según su edad. Las yeguas más jóvenes, con edades de entre 5 y 9 años, se asignaron al grupo de «ote yeguas jóvenes» (n = 7; 6,4 ± 0,6 años, media ± SEM), mientras que las yeguas más antiguas, de 10 a 15 años, se incluyeron en el grupo de «odas mayores» (n = 9; Se enredaron entre abril y mayo.

Las yeguas se mantuvieron en pasto y las dietas se ajustaron de acuerdo con las diferentes necesidades. Todas las yeguas fueron desparasitadas y vacunadas de forma rutinaria de acuerdo con el protocolo de granja de sementales. En el último mes de gestación, las yeguas se estabilizaron individualmente de la noche a la mañana, para la supervisión de los partos. En el foaling, las placentas de esas yeguas se recogieron inmediatamente después de la expulsión, se pesaron y se utilizaron para el muestreo. Los potros recién nacidos se pesaron dentro de las 24 horas posteriores al parto.

Colección de muestras

Se identificaron diferentes regiones de la placenta como cuerno gravid (A), cuerno no grave (B) y cuerpo placentario (C) (Figura 1). De cada una de estas áreas, se recogieron muestras de tejido de aproximadamente 5 mm3, de la siguiente manera: (i) cada una de las dos piezas se sumergió en 1 ml de ARN Later® (AM7020, Ambion, Applied Biosystems, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) para estudios de PCR en tiempo real (qPCR) y para la determinación Las muestras de placenta en RNA Later® se mantuvieron a 4 °C durante 24 horas y luego se almacenaron a -80 °C hasta que se realizaron pruebas de laboratorio.

Reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real

La determinación de la transcripción génica de los genes de colágeno, como el tipo I (COL1A1, COL1A2), el tipo III (COL3A1) y V (COL5A1) se realizó mediante PCR en tiempo real (qPCR) en el cuerno grave, el cuerno no grave y el cuerpo de la placenta obtenidos de yeguas más jóvenes (n = 7 Se diseñaron cebadores específicos, así como el gen de referencia, utilizando el programa basado en Internet Primer-3 y el software Primer Premier (Premier Biosoft Interpairs, Palo Alto, CA, EE. UU.). Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1. La extracción de ARN de muestras de placenta se llevó a cabo con el método del alcohol. En resumen, los tejidos placentarios (50 mg) se maceraron con una hoja de bisturí. Luego, se agregaron 500 μL (10 veces el peso de la muestra, en mg) de reactivo TRI® (T9424; Sigma Life Science, Burlington, MA, Estados Unidos), y se realizó una interrupción de la muestra con el TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Alemania) durante cinco ciclos de 30 s cada uno, a 25 Hz, y Para la separación de ARN, se añadieron 100 μL (0,2 del volumen de sobrenadante) de cloroformo (C2432-1L – Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EE. UU.) al sobrenadante recogido. La solución se mezcló, se incucursó en hielo durante 5 minutos y luego se centrifugaron a 12.000 g durante 20 minutos a 4 °C. Se recogió el sobrenadante. Posteriormente, 250 μL de isopropanol (alcohol isopropílico – 0918 – 500 ML – Biotecnología – VWR Life Science; Radnor, Pensilvania, EE. UU.), se añadieron a 500 μL del sobrenadante, se incubaron durante 10 minutos y se centrifugaron a 12.000 g durante 20 minutos a 4 ° El pellet recuperado se lavó con 75 % de etanol (K43342083215, índice -No: 603-002-00-5, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania; volumen igual al volumen de sobrenadante), centrifugado a 7.500 g durante 5 minutos, a 4 °C, y secado al aire a temperatura ambiente durante 30 minutos. El ARN se disolvió en agua tratada con DEPC de 20-30 μL (AM9915G; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) y se almacenó a -80 °C. La concentración y la calidad del ARN se evaluaron utilizando Nanodrop® (ND200C; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.), y mediante la visualización de bandas de ARNr después de la electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y una tinción roja (41003; Biotium, Hayward, CA, EE. UU. El ARN extraído se utilizó para la síntesis de ADNc, a través de la transcripción inversa. Este último se realizó utilizando la transcriptasa inversa M-MLV (M170B, Promega®, Madison, Wisconsin, EE. UU.) a partir de 1 μg de ARN total en un volumen de reacción de 20 μL utilizando oligonucleótidos (C1101, Promega®, Madison, Wisconsin, EE. UU.) y un inhibidor

El ADNc obtenido se combinó con Power SYBER Green PCR Master Mix (Ref. 4368706; Applied Biosystems, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) y con los genes objetivo o de referencia, y los ensayos qPCR de ambos se realizaron simultáneamente en un sistema de PCR en tiempo real StepOne-Plus TM (Applied Biosystems, Waltham, Massachusetts, EE. UU.), utilizando los ciclos de temperatura universal descritos anteriormente (28).

Antes de ejecutar el ensayo, se optimizó la concentración de los cebadores (80 nM para los genes objetivo y de referencia), y se validó el gen de referencia. Para determinar el gen de control interno más estable, se consideraron inicialmente cuatro genes de referencia potenciales, de la siguiente manera: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), complejo de succinato deshidrogenasa A, subunidad A, flavoproteína (SDHA), beta-2-microglobulina (β2M) y proteína ribosó GAPDH fue el gen de control interno más estable (29) y, por lo tanto, se consideró nuestro gen de referencia.

La confirmación de la especificidad de los productos de PCR se obtuvo mediante el funcionamiento de un gel de agarosa al 2,5% (BIO-41025; Bioline, Luckenwalde, Alemania) y mediante el análisis de la curva de fusión. El análisis cuantitativo del ARNm se determinó mediante el algoritmo PCR Miner en tiempo real (30), como se describió anteriormente (31). Los niveles de ARNm de los genes diana se normalizaron con respecto a los del gen de referencia.

Determinación de la concentración total de colágeno

Como la transcripción de los genes no siempre corresponde a la cantidad de proteína sintetizada (32), era necesario cuantificar el colágeno total presente en las muestras de placenta. Dado que la hidroxiprolina es un componente importante del colágeno que estabiliza su estructura helicoidal, la determinación de la concentración de hidroxiprolina se puede utilizar como indicador de la presencia de colágeno (33). Por lo tanto, la concentración total de hidroxiprolina en las diversas porciones de todas las placentas equinas se evaluó utilizando un método de inmunoensayo enzimático (Ref. ABIN593448; kit de ensayo colorimétrico de hidroxiprolina, Antibodies-online GmbH, Aquisgrán, Alemania). Se obtuvo un producto colorimétrico proporcional a la hidroxiprolina presente en la muestra y posteriormente se leyó en un espectrofotómetro a la longitud de onda de 560 nm, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como microgramos de hidroxiprolina por miligramo de placenta.

Evaluación histológica cualitativa del colágeno

Las muestras de placenta conservadas en el 4 % de formaldehído se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol (70, 80, 95 y 100 %) y en xilol, y luego se procesaron para obtener bloques de parafina. Las secciones histológicas (4 μm de grosor) de cada sitio elegido de la placenta (cuerno de gravedad, cuerno no de gravedad, cuerpo) se tiñeron con Picrosirius Red (PSR). La evaluación de las muestras manchadas de PSR se realizó utilizando una cámara (TIS 2MP RGB) acoplada a un microscopio vertical de campo ancho (Olympus BX51, Olympus Corporation, Tokio, Japón) en un aumento de 100x, bajo un haz de luz polarizado. De cada diapositiva teñida con PSR, se obtuvieron al azar 10 imágenes de cada porción (A, B y C) observadas en un campo oscuro. Además, para identificar las estructuras fotografiadas, también se tomaron duplicados de esas fotografías tomadas bajo luz polarizada en campo brillante. Dado que la mancha de PSR es particularmente útil para representar la organización y/o la orientación de la fibra de colágeno en varios tejidos conectivos en condiciones normales o patológicas (34), este método se utilizó para evaluar el colágeno en la placenta de la yegua.

Medición del grosor del tejido conectivo de la placa coriónica

El grosor del tejido conectivo de la placa coriónica en el cuerno gravid de las placentas de las yeguas se evaluó en secciones histológicas de 4 μm, teñidas con hematoxilina-eosina (05-06014E; Bio-Optica; eosina HT1103128; Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri Se seleccionaron al azar dos fotografías de la placa coriónica de los cuernos gravid de cada placenta. Más tarde, se realizaron 10 mediciones de cada fotografía utilizando el programa ImageJ (Instituto Nacional de Salud, EE. UU.), que es un software de código abierto para procesar y analizar imágenes científicas. Una vez que se recogieron las 20 mediciones de cada placenta, se sometieron a un análisis estadístico.

Densidad microvascular

De cada porción de la placenta (cuerno de gravedad, cuerno no gravitado y cuerpo) conservada en bloques de parafina, se recuperaron 4 secciones de tejido histológico de μ de grosor y se tiñeron con reactivo de Shiff ácido periódico (PAS; VWR Chemicals, ref. 20593.151, Lovaina, Bélgica). Esta mancha se ha utilizado en gran medida como marcador de las células endoteliales, ya que reacciona fuertemente con los carbohidratos presentes en la membrana basal microvascular (35). En este estudio, las paredes de los vasos sanguíneos se consideraron por igual, independientemente de su naturaleza (arteriollos, venules o capilares) (28). Las diapositivas histológicas se observaron bajo microscopía de luz y se fotografiaron con una ampliación total de 100x, para un mayor análisis del programa imageJ. Se determinó el número de vasos y áreas microvasculares en 10 campos de microscopio elegidos al azar de cada porción de las placentas. El porcentaje del área ocupada por los vasos sanguíneos, con respecto a toda el área de la micrografía, se consideró como el área vascular y se calculó para los 10 campos microscópicos, a partir de cada porción de cada placenta. En las mismas áreas de micrografía, también se contó el número de recipientes presentes. Los valores medios del área vascular total y el número total de vasos sanguíneos para cada región de la placenta se consideraron más para el análisis estadístico (28, 36).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando los programas GraphPad Prism (versión 8.4.3), Statistica 7 y SAS (SAS 9.4 Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.). En un primer enfoque y después de comprobar la distribución normal de las variables con la prueba Shapiro-Wilk, la transcripción de ARNm COL1, COL1A2, COL3A1 y COL5A1, la cuantificación de la hidroxiprolina y el grosor de la placa coriónica se analizaron mediante ANOVA unidireccional, seguida de la prueba de la diferencia Para evaluar la relación entre el peso del foal recién nacido y el peso de la placenta o la edad de la yegua, se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson, seguidos de un análisis de regresión lineal. Para evaluar los efectos de la edad (grupos de yeguas jóvenes frente a mayores), la ubicación del muestreo placentario (A, B y C) y su interacción en las variables, se utilizó un modelo mixto (procedimiento MIXTO de SAS). La duración de la gestación y la paridad se utilizaron en este análisis como covariable, y también se probó el sexo del potro. Cuando se detectaron diferencias significativas, las diferencias entre las medias se evaluaron utilizando la prueba Tukey-Kramer. El nivel de significación se definió como p < 0,05. Los datos se muestran como media ± SEM.

Resultados

Datos de animales

La duración de los embarazos que resultaron en los foalings de los que se recuperaron las placentas fue de 324 días (mínimo) hasta 352 días (337,2 ± 2,3 días). Los pesos de la placenta variaron entre 3 y 7,5 kg (5,5 ± 0,3 kg), y aumentaron con el envejecimiento de las yeguas (p < 0,001). El peso del potro a las 24 horas después del potro oscilaba entre 35 y 59,5 kg (50,8 ± 1,8 kg). Los potros más pesados nacieron de yeguas mayores (p < 0,0001), que también tenían más paridades (p < 0,0001), y gestaciones más largas (p < 0,01). Al considerar las yeguas, según su grupo de edad, los datos se presentan en la Tabla 2. Hubo una correlación positiva entre el peso de la placenta y el peso del potro (r = 0,728; p = 0,001; Figura 2A); entre la edad de la yegua y el peso de la placenta (r = 0,760; p = 0,0006; Figura 2B); y la edad de la yegua y el peso del potro (r = 0,659 La evaluación de la relación entre el peso de la placenta y el peso de la sefo, mostró una proporción más alta en las yeguas mayores en comparación con las yeguas más jóvenes (0,114 ± 0,003 frente a 0,099 ± 0,003; p < 0,001).

Reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real

En la placenta de las yeguas mayores, cuando se hizo una comparación con las mismas regiones placentaria de las yeguas más jóvenes, los niveles de transcripción de ARNm COL1A1 eran más altos en el cuerno de la sarroda (porción A) (p = 0,01), y entre el cuerno no grave (porción B), o entre el cuerpo de la placenta Además, la transcripción de COL1A1 en el cuerno grave de las yeguas más viejas también se aumentó, en comparación con el cuerno no grave y el cuerpo de las mismas placentas (p < 0,05; Figura 3A). Cuando se utilizaron la duración y la paridad de la gestación como covariables, no se observaron efectos significativos.

Aunque no se encontraron diferencias en los niveles de ARNm de COL1A2 para comparaciones directas entre las porciones placentales de yeguas jóvenes y mayores, se observó un efecto significativo de la edad, con niveles más altos de transcripciones de COL1A2 en yeguas mayores (p < 0,05). Cuando usamos la duración y la paridad de la gestación como covariables, no se observaron efectos significativos.

En cuanto a los niveles de ARNm de COL3A1, que eran similares a los de COLA1, aumentaron en el cuerno grave de las placentas de las yeguas mayores, en comparación con la misma porción en las yeguas más jóvenes (p < 0,05). Además, el cuerno grave de las placentas de las yeguas mayores tenía el nivel más alto de transcripción de COL3A1, en comparación con las porciones B y C de la misma placenta (p < 0,05; Figura 3B). Cuando se utilizó la duración de la gestación como covariable, hubo un efecto significativo de la edad, con yedas mayores mostrando niveles más altos de ARNm de COL3A1 en sus placentas que las yeguas más jóvenes (p < 0,01).

Además, cuando se evaluaron los niveles de transcripciones de COL5A1 en las diferentes porciones de la placenta, se observó un aumento en los niveles de ARNm en el cuerno de la grava de las yeguas mayores, en comparación con cualquier porción de la placenta de las yeguas más jóvenes, (p < 0,05; Figura 3C). Hubo un efecto significativo de la edad (odas jóvenes vs. Yeguas más antiguas) sobre este parámetro (p < 0,05). Además, para este parámetro, no se observaron efectos significativos cuando se utilizaron la duración de la gestación y la paridad como covariables.

El sexo con un deligo no tuvo efectos en los niveles de transcripción de COL1A1, COL1A2, COL3A1 o COL5A1.

Concentración de hidroxiprolina

De acuerdo con el aumento de las transcripciones de COL1A1, COL3A1 y COL5A1 obtenidas por qPCR, hubo un aumento en el aminoácido hidroxiprolina en el cuerno embarazada de las yeguas mayores, en relación con el cuerno no gravitativo (p < 0,05), y en el cuerpo placentario (p < 0,01) de las mismas placenta Además, los niveles de hidroxiprolina en la placenta no se vieron influenciados por la duración de la gestación ni por el sexo del potro.

Evaluación histológica cualitativa del colágeno en la placenta de Mare

La observación histológica de la placenta de la yegua, bajo un campo brillante y bajo un rayo de luz polarizado, mostró la presencia de colágeno principalmente en la placa de corola y el tejido conectivo alantoico. La evaluación cualitativa sugiere que una mayor abundancia de fibras podría estar presente en el tejido conectivo de la placa coriónica del cuerno de la grava en todas las yeguas (Figuras 4A, B). En cuanto al tejido conectivo alantoico, las fibras de colágeno también parecen predominar en grandes cantidades (Figuras 4A,B). Siempre que el espacio exocelomico estaba presente, las fibras de colágeno lo rodeaban, dentro de la fina capa interna de tejido conectivo adherido al epitelio de la superficie alantoica, más internamente (Figuras 4C,D), y en el tejido conectivo alantoico asociado a la placa coriónica, externamente (Figuras 4C,D). Muy pocas fibras de colágeno estaban presentes en el tejido conectivo del eje de las vellosidades, aunque en el cuerno grave parecían ser más abundantes (Figuras 4E, F). La observación histológica cualitativa de las placentas de las yeguas sugirió que había más colágeno presente en el cuerno de la grava, con respecto al cuerno no grave y el cuerpo de la placenta, independientemente de la edad de las yeguas.

Espesor del tejido conectivo de la placa coriónica

La observación cualitativa de las fibras de colágeno teñidas por PSR en las placentas de las yeguas no reveló ningún cambio evidente entre las placentas de las yeguas jóvenes y mayores que pudiera explicar el aumento observado en el ARNm COL1 y COL3A1, evidenciado por qPCR, y por la hidroxiprolina en el cuerno grave de las yeguas mayores Por lo tanto, era necesario medir el grosor del tejido conectivo de la placa coriónica en el cuerno grave de todas las placentas. Nuestros resultados indican un aumento significativo en el grosor del tejido conectivo de la placa coriónica en el cuerno grave de las yeguas más antiguas (14,1 ± 42,1 μm), en comparación con la misma estructura en las placentas de las yeguas más jóvenes (401 ± 47,7 μm; p < 0,05),

Además, la duración de la gestación se correlacionó positivamente con el grosor de la placa coriónica (r = 0,525; p < 0,05), lo que significa que las gestaciones más largas aumentaron el grosor de la placa coriónica. Las yeguas que foalaba a un potro macho tendían a tener una placa coriónica más gruesa (p = 0,08).

Evaluación cuantitativa de la densidad microvascular

Las paredes de los vasos sanguíneos se mancharon mediante un desplazamiento periódico del ácido, como se muestra en la Figura 5A. El área microvascular en el cuerno grave de la placenta era más grande en las yeguas más antiguas que en las yeguas más jóvenes (p < 0,05; Figura 5B). Además, en las yeguas más viejas, el área vascular del cuerno gravid se incrementó con respecto al cuerno no gravid (p < 0,01) y al cuerpo de la placenta (p < 0,05; Figura 5B). Sin embargo, el área vascular de la placenta de las yeguas jóvenes era idéntica en todas las partes evaluadas de este órgano (Figura 5B). Además del aumento observado en el área vascular en el cuerno grave de las placentas de las yeguas más antiguas, el número de vasos por campo microscópico también fue mayor en esa región, en comparación con las otras porciones de la placenta (p < 0,001; Figura 5C). Las placentas de las yeguas mayores presentaban áreas vasculares más grandes que las placentas de las yeguas más jóvenes (p < 0,05). La longitud de la gestación y el sexo del potro no influyeon en el área vascular. Sin embargo, hubo un efecto de paridad en el área vascular del cuerno de la gravedad (p < 0,05) con yeguas que tenían un mayor número de partos que presentaban un mayor área vascular.

En las yeguas más jóvenes hubo un aumento en el recuento de vasos en la trompa embarazada, en comparación con la trompa no embarazada (p < 0,001; Figura 5C). La longitud de la gestación y el sexo del potro no influyeran en el recuento de vasos. Pero, de manera similar a los resultados obtenidos para el área vascular, la paridad tuvo un efecto en el número de vasos sanguíneos del cuerno grave (p < 0,0001), independientemente de la edad de la yegua.

Discusión

Estudios anteriores han tratado principalmente la histología de la placenta de la yegua y los patrones de proliferación celular durante el desarrollo (37-39). A pesar de que se han descrito los aspectos estructurales y hemovasculares del crecimiento placentario durante toda la gestación en yeguas jóvenes y envejecidas (13), no se ha evaluado el contenido de colágeno a nivel histológico y molecular. Por lo tanto, a nuestro leal saber y entender, este es el primer estudio que cuantifica las fibras de colágeno y la microvascularización en la placenta equina, relacionándolas con las diferentes partes de la placenta, la edad de la yegua, la placenta y el peso de los potros.

En el presente estudio, los potros más pesados al nacieron al nacer de yeguas más viejas, con más paridades, que también dieron placentas más pesadas y tenían longitudes de gestación más largas. Hubo una correlación positiva entre el peso del potro y el peso de la placenta, así como entre el peso del potro y la edad de la yegua. La correlación positiva entre el peso total de las membranas fetales y el peso del potro al nacer observado en el presente trabajo, se ha demostrado anteriormente para los pura sangre (40) y las yeguas Lusitano (41). De hecho, en Thoroughbreds, por cada kg de aumento en el peso placentario, hubo un aumento de 4,5 kg en el peso del potro (40). En la yegua, el peso de la placenta aumenta progresivamente con la paridad, el tamaño materno y afecta directamente al área de la superficie y la función del transporte de la placenta, así como a las glándulas endocrinas fetales que median el desarrollo fetal hacia el término (42-45). Además, el peso placentario equino aumenta en los meses de partos de abril y mayo, en comparación con los partos anteriores del año (46). Dado que todos los partos de las yeguas en el presente estudio se produjeron en abril y mayo, los cambios en el peso de la placenta pueden estar relacionados con la edad de las yeguas, las paridades, la duración de la gestación o el peso de los potros, pero no con ningún efecto estacional.

Los niveles de transcripción de ARNm mostraron un aumento en COL1A1, COL3A1 y COL5A1 en el cuerno embarazada de la placenta de las yeguas mayores. Este aumento en la transcripción del colágeno se confirmó por el contenido de hidroxiprolina (al colágeno total) en los tejidos de la placenta. De hecho, la regulación posttranscripcional, post-traduccional y de degradación contribuye a la concentración de proteínas en el tejido (32). En la placenta humana, el colágeno cambia su composición durante el desarrollo de la placenta y el envejecimiento, a medida que avanza el embarazo, para proporcionar nutrientes al feto y mantener el embarazo (47).

La observación histológica del colágeno en secciones de la placenta equina teñidas con PSR y observadas bajo luz polarizada permitió la visualización de esas fibras en las diferentes estructuras. En el tejido conectivo, las fibras de colágeno tipo I se agrupan densamente en haces, desempeñando un papel estructural y promoviendo la conexión entre las estructuras. Las fibras reticulares, formadas predominantemente por el colágeno tipo III, se distribuyen finamente en forma de red, desempeñando un papel de apoyo (33). En el endometrio de la yegua teñido de rojo picrosirio observado bajo un haz de luz polarizado, las fibras teñidas en rojo se identificaron como COL1, mientras que las fibras teñidas de verde se consideraron COL3 (48). Sin embargo, como han revisado otros autores, se ha demostrado que este método no es capaz de distinguir los tipos de colágeno, ya que las diferencias de color bajo la luz polarizada están simplemente relacionadas con la orientación de los paquetes de colágeno y no con el tipo de colágeno, lo que hace que dicha interpretación sea obsoleta (34). Los colores polarizados no se deben a ninguna reacción química de los componentes de la mancha roja de Picrosirius que permitiría diferenciar los tipos de colágeno por el tinte, sino que solo representan el grosor y el embalaje de la fibra (49, 50). Por lo tanto, dado que este es un método particularmente útil para revelar la organización y/o heterogeneidad de la orientación de la fibra de colágeno en diferentes tejidos conectivos en tejidos normales o patológicos (34), esta mancha se utilizó para evaluar el colágeno en la placenta de la yegua. En el presente estudio, las fibras de colágeno se representaron en diferentes lugares dependiendo de la estructura histológica del corioallantoico equino. De hecho, en todas las placentas de las yeguas predominaron las fibras de colágeno en la placa coriónica y en la membrana alantoica, mientras que muy pocas se observaron en las viles coriónicas. La presencia de colágeno en el tejido conectivo de las víboras coriónicas se describió previamente en las secciones histológicas de la placenta humana (26). El aumento en el grosor del tejido conectivo de la placa coriónica, observado en el cuerno embarazada de las yeguas mayores, que también tenían gestaciones más largas, puede explicar el aumento de los niveles de ARNm de COL1A1, COL3A1 y COL5A1 y en la hidroxiprolina. Sin embargo, se necesitan más estudios para apoyar esta hipótesis.

Hemos demostrado que la deposición de colágeno y la microvascularización (área vascular y recuento de vasos), aumentaron en el cuerno grave de las placentas de las yeguas más viejas. Aunque en otras especies la fibrosis placentaria puede indicar insuficiencia placentaria y reducción del peso corporal del recién nacido, esto no se observó en el presente estudio. El aumento de la vascularización en el cuerno gravid podría haber sido una característica compensatoria para proporcionar la nutrición adecuada al feto equino. En la perra, la proporción más baja de peso de la placenta y peso del cachorro ocurre en camadas más grandes y cuando las placentas representan la densidad capilar más alta, con respecto a las camadas más pequeñas (14). En las yeguas mayores, la mayor proporción de peso de la placenta y peso del foal se asoció con más partos, y placentas que presentaban la mayor densidad vascular, lo que podría mostrar una adaptación de la placenta y una mayor eficiencia con la paridad, como se hace referencia (51). Sin embargo, en el envejecimiento de las yeguas subfértiles con cambios degenerativos en el endometrio, la eficiencia placentaria disminuye, debido al área más pequeña del intercambio placentario (18). De hecho, en las yeguas viejas con endómetrosis, las viles coriónicas fetales son más cortas y más irregulares en comparación con las yeguas jóvenes sanas de la misma edad gestacional (13). Sin embargo, nuestros datos sugieren que las yeguas fértiles mayores fueron capaces de desarrollar una placenta funcional y continuar con un embarazo exitoso a término.

En los seres humanos, cualquier cambio en el área de la superficie, la vascularización, la composición celular o el grosor de la barrera placentaria influye en su capacidad de transporte (52). Se sabe que la fibrosis puede afectar la función de un órgano al interrumpir el transporte de fluidos y electrolitos (53). Aunque los datos obtenidos en este estudio no apoyan esta hipótesis, es posible que el grado de fibrosis placentaria de las yeguas viejas influya en el peso del foal al nacer. Varios autores han documentado la aparición de cambios degenerativos en el endometrio equino con el envejecimiento (54-56) que conducen a un menor desarrollo de microcotiledóneales placentarios (18). Un estudio realizado en nuestro laboratorio mostró la aparición de fibrosis en el oviducto asociada con la endometrosis en yeguas viejas (17). Por lo tanto, surge la hipótesis de que lo mismo podría ocurrir en la estructura histológica de la placenta equina. Teniendo en cuenta el presente estudio, a medida que las yeguas envejecieron y la duración de la gestación se prolongó, las fibras de colágeno parecían aumentar en una cantidad significativa en el tejido conectivo de la placa coriónica. Se sabe que el peso del potro al nacer refleja el equilibrio entre el contacto fetal y la eficiencia placentaria (51). Sin embargo, en el presente trabajo, la deposición de colágeno en el cuerno de grava de las yeguas mayores tuvo un efecto positivo en el desarrollo de la placenta y el peso de los potros, lo que sugiere una adaptación fisiológica de la placenta para el desarrollo intrauterino del foal. Esto podría explicarse por el hecho de que las yeguas mayores utilizadas en este estudio, de 10 a 15 años, todavía no estaban en el rango de yeguas con más problemas reproductivos asociados a la endomesis (más de 15 años) y la disfunción placentaria, como se refiere otros (51, 54). Además, dado que el presente estudio solo se centra en las placentas que se han obtenido de nacimientos exitosos, no se consideraron las placentas con lesiones histológicas y/o placentas disfuncionales que posiblemente originaron abortos. Esto puede explicar por qué no hay un impacto negativo evidente del envejecimiento de la yegua en el peso del potro. Finalmente, desafortunadamente, no fue posible recoger las biopsias endometriales de las yeguas de las que se recogieron las placentas, lo que hizo imposible correlacionar el grado de endometriosis y la fibrosis presente en la placenta.

En conclusión, nuestros datos sugieren que las yeguas fértiles más viejas, con más paridades y períodos de gestación más largos, pudieron desarrollar una placenta funcional, que era más pesada, más vascularizada y con un aumento del colágeno y el grosor de la placa coriónica, lo que permitió la entrega de potros más pesados. Por lo tanto, estas características podrían representar adaptaciones morfológicas y fisiológicas de las placentas fértiles de las yeguas más antiguas. Sin embargo, se debe continuar la investigación sobre una muestra más grande de placentas equinas (incluyendo foalings y abortos exitosos), para obtener un grupo de yeguas jóvenes y otro de yeguas viejas, que envejecidas bastante separadas entre sí. También será extremadamente importante obtener las biopsias endometriales correspondientes, para entender si la fibrosis en el endometrio va acompañada de fibrosis en la placenta y su patología.

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo/materiales complementarios, se pueden dirigir más consultas al autor/s correspondiente(s).

Contribuciones del autor

GF-D, MR y GA-P: conceptualización. ANS, AC, AT, JA-M, CF, MF, JF, MB y ES: metodología. GF-D, MR, JF, MF y GA-P: análisis formal. ANS, AC, AT, JA-M, CF, MF y MB: investigación. ANS: redacción: preparación del borrador original. GF-D y ANS: supervisión de la administración del proyecto y la adquisición de fondos. MF, MR, JF, ES, GA-P y GF-D: redacción, revisión y edición. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Financiación

Esta investigación fue financiada por los proyectos UIDB/00276/2020 y F-04 -CIISA MSC Internal Project.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

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Agradecimientos

Los autores están muy agradecidos a la granja de sementales Haras de La Gesse, 31350 Boulogne-sur-Gesse, Francia, por proporcionar amablemente todas las muestras de placenta y la recopilación de datos sobre los potros y placentas recién nacidos. También queremos dar las gracias a la Sra. María do Rosário Luís, para los preparativos histológicos.

Referencias