1 Introducción

El cambio climático actual amenaza la seguridad mundial del agua dulce, que es uno de los objetivos de desarrollo sostenible de las Naciones Unidas (1). A pesar de la inevitable incertidumbre en los modelos de predicción, se espera que los países del sur de la Unión Europea (UE) experimenten cambios severos tanto en la disponibilidad como en la calidad de los recursos hídricos, lo que podría conducir a una presión sin precedentes sobre los recursos hídricos (2). En la actualidad, el sector agrícola de algunas regiones meridionales del área euromediterránea ya utiliza el 80% de los recursos hídricos, mientras que el resto de Europa consume solo el 44% y el mundo alrededor del 75%, de media (3, 4). Dentro del sector primario, se estima que la producción ganadera utiliza el 29% de la demanda total de agua agrícola, y una gran parte se destina a los cultivos para producir alimentos para animales (5). En este escenario, la recuperación de aguas residuales urbanas tratadas o regeneradas con fines de riego tiene un enorme potencial para hacer frente a la creciente escasez de agua, preservando los recursos potables y reduciendo el impacto ambiental asociado a la descarga de efluentes a los cuerpos de agua (6, 7). Hasta la fecha, el uso de aguas residuales regeneradas en la producción de hortalizas y frutas para el consumo humano se ha implementado con éxito en muchas zonas rurales mediterráneas, demostrando ser una opción económicamente viable para mitigar el consumo de agua asociado con la producción de varios cultivos (8-11). Sin embargo, se ha prestado menos atención al uso de aguas residuales en los sistemas de producción de forraje y piensos (5, 12).

El uso de aguas residuales con fines agrícolas presenta preocupaciones relacionadas con la presencia de microorganismos patógenos que podrían ser una fuente de infección para humanos y animales (5, 13). Del mismo modo, puede haber sustancias químicas orgánicas e inorgánicas que pueden entrar en la cadena alimentaria, acumularse en el suelo, ser absorbidas por las plantas y luego tener a los humanos como consumidores finales (14, 15). Actualmente, en el contexto europeo, el uso de aguas residuales para riego está estrictamente regulado. En las plantas de tratamiento, las aguas residuales urbanas, tal como se definen en la Directiva 91/271/CEE de la UE, se someten a un tratamiento secuencial para eliminar los sólidos en suspensión y los contaminantes, así como los compuestos y microorganismos no deseados (16). Las aguas residuales tratadas para eliminar patógenos y estabilizar la calidad del agua, en lo sucesivo denominadas aguas residuales urbanas regeneradas (RSU), pueden utilizarse para el riego de cultivos alimentarios crudos y transformados y cultivos no alimentarios, como pastos y forrajes (17). En este escenario, la hidroponía se considera ahora una tecnología agrícola que puede adaptarse fácilmente para reutilizar fuentes de agua alternativas, reduciendo tanto la demanda de agua de riego como la eliminación de aguas residuales, y mejorando la sostenibilidad ambiental y económica de la producción de cultivos y las tecnologías de tratamiento de aguas residuales (18). La hidroponía es un tipo de cultivo vertical, sin suelo, de interior en el que el ambiente de cultivo está controlado en cuanto a temperatura, humedad, luz y en el que el uso de productos químicos tiende a ser mucho menor que en los sistemas de cultivo tradicionales (19, 20). En los últimos años, también se ha propuesto que la hidroponía produce forraje fresco, un alimento natural, sabroso y de fácil digestión que puede mejorar la salud y el rendimiento de los animales lactantes e incluso las propiedades nutracéuticas de los productos lácteos (21-23), que sin embargo no está disponible durante todo el año en las condiciones climáticas del sur de Europa (24, 25). La producción de forraje hidropónico fresco (HF) se basa en la germinación en interiores y el crecimiento durante un corto período (6-8 días) de semillas de cereales (especialmente cebada) caracterizadas por una germinabilidad alta y rápida (26). Además de producir forraje fresco y de alta calidad durante todo el año, independientemente de las condiciones climáticas y sin necesidad de tierra, también se espera que la producción de HF reduzca el consumo de agua en comparación con los cultivos forrajeros convencionales (27, 28) y se ha propuesto como un sistema adecuado para las explotaciones ganaderas con disponibilidad limitada de tierra cultivable y agua de riego (29, 30). Se ha encontrado que el uso de fuentes alternativas de agua aumenta la eficiencia en el uso del agua, así como la calidad nutricional de la HF (31-34), pero los efectos de dicho forraje en el rendimiento y la salud de los animales no se han abordado hasta ahora.

Además, en el contexto europeo, teniendo en cuenta los requisitos definidos por el Reglamento Europeo 2020/741 (17), recientemente promulgado, es fundamental evaluar los posibles riesgos zoosanitarios asociados a la reutilización de RSU para la producción de forraje hidropónico. De hecho, aunque el forraje hidropónico no se menciona explícitamente en el reglamento de la UE, entra en la categoría de «cultivos no alimentarios», incluidos los pastos y el forraje.

Por lo tanto, asumiendo su seguridad, este estudio fue diseñado como un primer intento de evaluar el uso de RUW para la producción de HBF en términos de características del agua, calidad del alimento y efectos sobre la salud y la producción de vacas lecheras, elementos que han sido considerados por separado o no en absoluto en la literatura disponible.

2 Materiales y métodos

2.1 Aprobación ética

El estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Ministerio de Salud italiano (código de protocolo 74371-X/10, n. 1.031/2020-PR, Fecha de aprobación 19, noviembre de 2021). La retirada y el uso de RUW fueron autorizados por el Acueducto de Apulia (Acquedotto Pugliese S.p.A.), que fue socio en el marco del proyecto de investigación Hydrofodderpuglia financiado por la región de Apulia (PO FE5R 2014/2020-Azione 6.4-Sub-Az 6.4.a.DGR 2321/2017).

2.2 Lugar de estudio y producción de forraje de cebada hidropónica

El estudio se llevó a cabo en una granja lechera de la región de Apulia, en el sur de Italia (40°48′N 16°56′E; 360 m s.n.m.). La granja cuenta con dos cámaras hidropónicas (modelos E-6-TC y EC-2-T, Eleusis International, Madrid, España) con una producción potencial diaria de forraje de cebada hidropónica (HBF) de 500 kg y 120 kg y una capacidad de 32 y 8 bandejas de polietileno perforado (60×60 cm), respectivamente. Independientemente de la capacidad de producción, cada cámara constaba de una sala bien aislada y equipada con control climático, extractores de aire, un sistema de riego de riego superficial, un sistema de iluminación de tubos fluorescentes (40 W, con 12 a 16 luces diarias) y un conjunto de estantes donde se colocan las bandejas de germinación de semillas. La temperatura dentro de las cámaras se ajustó a un rango de trabajo de 18 °C a 21 °C y la humedad relativa se ajustó en aproximadamente un 70% utilizando la circulación de aire. Se utilizaron semillas de cebada (Hordeum vulgare L.) limpias, sanas, intactas, sin tratar, de alta calidad (germinación superior al 95%). Diariamente, las semillas se remojaron primero en una solución de hipoclorito de sodio al 1,5% durante 30 min, se enjuagaron y se remojaron en agua dulce durante 16 h. Luego, se escurrió el agua y se dejaron las semillas sin agua durante 24 h (pregerminación). Posteriormente, las semillas se esparcieron en las bandejas de polietileno perforadas a una tasa de siembra de 4-6 kg/m2. El ciclo de crecimiento, desde la colocación de la semilla hasta la cosecha, duró 8 días, después de lo cual el forraje, que consistía en una masa de raíces, granos de semillas y la parte verde aérea de las plántulas (de 12 a 14 cm), se descargó manualmente de las bandejas, puntuando la presencia de moho de acuerdo con la escala de cinco puntos de Söder et al. (35), y cargado en el vagón mezclador equipado con una báscula electrónica para su inclusión en la ración total mezclada (TMR).

Con fines experimentales, el HBF se produjo utilizando RUW tomado de la planta de tratamiento del acueducto de Apulia ubicado en Noci (40°48′N 17°08′E), que adopta una cadena de tratamiento de aguas residuales con biorreactor de membrana. Una vez a la semana, el RUW se tomaba de los embalses de la planta de abastecimiento de agua, se transportaba a las granjas en un tanque específico y se almacenaba en tanques de polietileno no tóxico con la adición semanal de dióxido de cloro (0,58 ppm/L), conectado al sistema de riego de la cámara de crecimiento. La cantidad de agua necesaria para producir diariamente 620 kg de HBF era de aproximadamente 1,5 m³. Antes del inicio del ensayo de alimentación, las características de RUW fueron evaluadas para los principales parámetros de calidad del agua (17, 36) por un laboratorio de referencia (EuroQuality Lab S.r.l., Gioia del Colle, Italia) de acuerdo con métodos estándar (Tabla suplementaria S1).

Para evaluar la posible influencia de los RUV en el crecimiento del forraje, en octubre de 2021 se midió el rendimiento y la altura del forraje producido utilizando agua de pozo y RRU. Se realizaron mediciones en ambas cámaras durante 10 días consecutivos para cada tipo de agua. Además, dos muestras de los forrajes así producidos fueron evaluadas por β un laboratorio de referencia (EuroQuality Lab S.r.l., Gioia del Colle, Italia) según métodos estándar (Tabla suplementaria S2).

2.3 Inscripción de animales

En noviembre de 2021 se evaluó el estado de salud de ochenta vacas lactantes del rebaño. Los animales fueron examinados visualmente, pesados y puntuados para determinar su condición corporal utilizando una escala de 1 a 5 (37). Se tomaron muestras de sangre de la vena coxígea, se utilizaron inmediatamente para cuantificar el nivel de beta-hidroxibutirato (BHB) utilizando un cetómetro (CentriVet GK), y se colocaron en un tubo de EDTA K3 (10 mL) para realizar un hemograma completo (CBC) (CELL-DYN 3700 Hematology Analyzer, Abbott), y en un tubo simple (5 mL) para obtener suero después de la centrifugación (15 min a 1500 × g) para el panel bioquímico (incluida la albúmina (Alb), fosfatasa alcalina (ALP), alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST), calcio (Ca), cloruro (Cl), creatinina (Cr), glucosa (Glu), potasio (K), magnesio (Mg), sodio (Na), ácidos grasos no esterificados (NEFA), fósforo (PHOS), bilirrubina total (T Bil), hierro total (Ti), proteínas totales (Tp); Beckman Coulter, Analizador de Química Clínica AU680). Además, se recogieron muestras fecales (alrededor de 10 g) del recto utilizando guantes de polietileno estériles, se almacenaron en bolsas de plástico y se examinaron en busca de helmintos gastrointestinales (38). Se realizó desparasitación con eprinomectina (Eprinex Multiple Pour, Boehringer Ingelheim) debido a resultados positivos. Para ser incluidas en el estudio, las vacas debían estar clínicamente sanas, tener una temperatura de 38,8 °C, 5-6 contracciones ruminales cada tres minutos medidas por auscultación de la fosa lumbar y no presentar signos clínicos de laminitis, metritis y mastitis.

2.4 Diseño del estudio, animales y dietas

Sesenta vacas lecheras cumplieron con los criterios de selección y se inscribieron en un estudio prospectivo, aleatorizado, controlado y de campo que duró de diciembre de 2021 a febrero de 2022. Las vacas inscritas fueron asignadas al azar en dos grupos equilibrados por raza, producción de leche, días en leche (DIM), paridad, puntuación de condición corporal (BCS) y peso corporal (PC) (Tabla Suplementaria S3). El grupo control (GC) fue alimentado con la TMR utilizada por el agricultor, mientras que el otro grupo (HBFG) fue alimentado con la misma TMR en la que 10 kg de HBF reemplazaron 1 kg de heno de avena y 0,5 kg de maíz. Las dietas fueron isonitrogenadas e isoenergéticas y formuladas para un nivel de producción de 28 kg de leche energéticamente correcta (MEC) por día (39). Las raciones se administraron dos veces al día (08:00 y 15:00) en cantidades iguales, con varios empujes de alimento a los animales. Los rechazos de alimento (5%-10%) se eliminaron diariamente antes de descargar la TMR recién preparada. Los animales tenían libre acceso al agua potable. Los grupos se alojaron en dos establos adyacentes con suelo de hormigón equipados con establos profundos (2,6 × 1,25 m, lecho de arena) y un campo de entrenamiento de arcilla de acceso abierto (30 × 10 m). El ensayo tuvo una duración de 9 semanas, 2 semanas para la adaptación a las dietas y 7 semanas para las mediciones experimentales y el muestreo según el esquema que se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Cronograma del proyecto de estudio, incluidos los plazos y los procedimientos programados. Creado con BioRender.com.

2.5 Examen físico y toma de muestras de sangre

El examen físico, el registro del peso corporal, la puntuación BCS y la toma de muestras de sangre de las vacas inscritas se repitieron en T-14, T14, T28 y T42 como se describió anteriormente (Figura 1).

2.6 Ingesta de materia seca, clasificación de alimentos y análisis de alimentos

El consumo de alimento se midió semanalmente por grupo por la diferencia entre la TMR descargada y los residuos. También se tomaron muestras de alimentos y TMR, se agruparon por grupo y se analizaron para determinar el contenido de materia seca (MS; método 930.15), cenizas (método 942.05), proteína cruda (PC; método 976.05) y extracto de éter (EE; método 954.02) (40). También se determinaron la fibra detergente neutra (FDN), la fibra detergente ácida (FDA) incluyendo cenizas residuales (41), la lignina detergente ácida (ADL) (42), el azúcar total (43) y el almidón enzimático (44). Las proteínas se fraccionaron (PA, PB1, PB2, PB3, PC) de acuerdo con el Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) versión 6.5 (45). Los carbohidratos no fibrosos (NFC) se calcularon como se detalla en otra parte (46, 47). Se tomaron muestras adicionales de TMR y rechazos cada dos semanas durante el período de muestreo para evaluar la estructura física de las dietas (tamaño de partícula y FDN físicamente efectiva) y la actividad de clasificación de las vacas. La distribución del tamaño de partícula de las TMR frescas y los rechazos se estratificó en largas (>19 mm), medianas (<19 mm, >8 mm) y cortas (<8 mm; Pan) utilizando un separador de partículas de Penn State (PSPS) con dos pantallas (19 y 8 mm) (48). El factor de efectividad física (pef), la FDN físicamente efectiva (peNDF) y el índice de clasificación de alimento (IS) de las dietas se determinaron de acuerdo con DeVries et al. (49).

2.7 Toma de muestras y análisis de leche

La producción de leche de cada vaca se midió utilizando una máquina registradora electrónica (DeLaval Corp., Tumba, Suecia) y se tomaron muestras en el ordeño de la mañana (07:00) a intervalos semanales (Figura 1). Las muestras se enviaron refrigeradas a 4 °C al laboratorio para el análisis de grasa, proteína, caseína, lactosa, sólidos totales, sólidos no grasos, nitrógeno ureico de la leche (MUN), índice de crioscopia, acidez de titulación, recuento de células somáticas (SCC) y propiedades de coagulación de la leche, que se realizaron el mismo día utilizando un analizador infrarrojo de leche (CombiFoss TM7, Foss, Hillerød, Dinamarca). En T42, se recolectaron dos muestras más de leche de un subgrupo seleccionado de 10 vacas/dieta. Uno se evaluó para determinar la concentración de metales pesados (As, Cd, Co, Cu, Ni, Pb) mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), mientras que el otro se utilizó para determinar la composición de ácidos grasos (AG) como se detalla en otra parte (50). La grasa láctea se extrajo por el método Röse-Gottlieb, la mezcla de componentes Supelco 37 (Supelco, Bellefonte, PA, Estados Unidos) y una mezcla de isómeros de ácido linoleico conjugado (Nu-Chek Prep. Inc. Elysian, MN, Estados Unidos) se utilizaron como patrones externos para el análisis por cromatografía de gases.

2.8 Monitorización del pH ruminal

En el momento de la inscripción (Figura 1), todas las vacas recibieron un sensor reticolo-ruminal inalámbrico permanente (pH Plus Bolus; smaXtec Animal Care GmbH, Graz, Austria) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los bolos proporcionaron una medición continua del pH ruminal, la temperatura corporal y los niveles de actividad de los animales. Los datos se registraron cada 10 minutos, se transmitieron de forma inalámbrica a una estación base colocada en el establo y se dispuso en tiempo real desde un software informático o una aplicación de teléfono celular. El riesgo de acidosis ruminal subaguda (SARA) fue notificado por el bolo ruminal cuando el valor del pH cayó por debajo de 5,8. Se calcularon los valores medios de pH diario, mínimo y máximo por vaca y por día. También se midió el porcentaje de animales que presentaron al menos una alarma de riesgo de SARA, el número y el tiempo (min) de alarmas de riesgo de SARA.

2.9 Digestibilidad aparente total del tracto, síntesis de proteínas microbianas y balance de nitrógeno

En T42 y durante 3 días consecutivos, se recogieron muestras fecales (∼200 g) tres veces al día de un subgrupo seleccionado de 10 vacas/dieta, mantenidas a +4 °C en bolsas de plástico cerradas, y luego compuestas por vaca. Las muestras de heces, dietas y rechazos se secaron, molieron y analizaron en busca de cenizas insolubles en ácido (AIA) (51), así como de cenizas, materia orgánica (MO), PC y FDN. El contenido de AIA se utilizó como marcador interno para estimar la digestibilidad aparente de los nutrientes en el tracto total y la producción fecal de MS (52).

Al mismo tiempo que la toma de muestras fecales, también se recogieron muestras de orina puntuales, ya sea mediante la micción voluntaria o la estimulación del nervio pudendo según el procedimiento de Spanghero (53). Las muestras (∼100 mL) se acidificaron inmediatamente (10% v/v con solución de ácido sulfúrico) y se almacenaron a -20°C hasta el análisis. Después de la descongelación (4° C), las muestras fueron evaluadas para N total (40) y creatinina y derivados de purina (PD; es decir, alantoína y ácido úrico) como lo describen George et al. (54). El volumen diario de orina y la excreción de N total, alantoína, ácido úrico y DP total (alantoína más ácido úrico) se estimaron en función del peso corporal y la concentración de creatinina urinaria, asumiendo una tasa de excreción de creatinina constante de 29 mg/kg de peso corporal (55). La síntesis ruminal de nitrógeno microbiano (MN) se estimó a partir de la excreción de DP utilizando la ecuación de Chen y Gómez (56). El balance de nitrógeno (NB) se calculó según lo reportado por Spanghero y Kowalski (57).

2.10 Análisis estadístico

El tamaño muestral a priori se basó en 30 como mínimo y se eligió la proporción de tamaño muestral 1:1. Las características bovinas se reportan como media ± desviación estándar (M ± DE), y como frecuencias y porcentajes (%) para las variables categóricas. Para probar las asociaciones y la aleatorización corregida entre brazos (HBFG vs GC), se utilizó la suma de rangos de Wilcoxon (Mann-Whitney) para la continua y la prueba de Chi-cuadrado o proporción para la categórica. Antes del análisis estadístico, la normalidad y la homogeneidad de la varianza de los datos se comprobaron mediante las pruebas de Shapiro-Wilks y Levene, respectivamente. Se utilizó el ANOVA de medidas repetidas para determinar la diferencia de medias de los parámetros repetidos (a saber, peso corporal, BCS, producción de leche, panel bioquímico y hemograma) con el tratamiento, el tiempo y la interacción como factores. Los datos sobre el consumo de materia seca, la digestibilidad in vivo y el balance de nitrógeno se analizaron mediante ANOVA de una vía para determinar los efectos fijos del tratamiento. Los datos del bolo ruminal se analizaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (Mann-Whitney). Al probar la hipótesis nula de no asociación, el nivel de probabilidad de error en dos colas fue de 0,05. Todos los cálculos estadísticos se realizaron con StataCorp. 2021. Software estadístico Stata: Versión 17. College Station, TX: StataCorp LLC.

3 Resultados

3.1 Hallazgos de aguas residuales urbanas regeneradas y forrajes hidropónicos

En las Tablas 1 y 2 se muestran las características microbiológicas y químicas de los RUP utilizados para la producción de HBF. Para evaluar la calidad del riego de los RSU, se utilizaron las directrices revisadas por Hashem y Qi (14) y Ayers y Westcot (36) para los parámetros no incluidos en el Reglamento 2020/741 (17).

Tabla 1. Características de las aguas residuales urbanas regeneradas utilizadas en el estudio en relación con los requisitos de la UE para uso de riego (reglamento 2020/741).

Tabla 2. Carga de salmonela y características químicas y físicas de las aguas residuales urbanas regeneradas utilizadas y rango recomendado para uso en riego.

El RUP se clasificó en la clase A por turbidez, sólidos suspendidos totales y presencia de huevos de nematodos, mientras que el valor de DBO y la carga de E. coli llevaron a que las aguas residuales se clasificaran como Clase B (17). No se detectó Salmonella spp. Se detectaron niveles por encima del rango recomendado, pero lejos de niveles peligrosos para la conductibilidad eléctrica, NO⁻³, N, Na y Cl. Los niveles de metales estaban por debajo o cerca de los límites de detección. La Tabla 3 muestra los niveles de contaminantes de HBF producidos con RUW en comparación con la muestra de referencia producida con agua de pozo.

Tabla 3. Carga de Escherichia coli y Salmonella spp. y contenido de metales y no metales del forraje hidropónico de cebada (HBF) producido con aguas residuales regeneradas y con agua de pozo.

No se detectaron Salmonella ni mohos en ambos forrajes y la carga de E. coli se mantuvo por debajo de 10 UFC/g. El forraje producido con RUW tuvo casi cinco veces el contenido de Na y el doble del contenido de P de la muestra de referencia, mientras que esta última tuvo un contenido de N muy alto. No hubo efecto del tipo de agua sobre la altura del forraje (12.35 vs 12.38 cm para RUW y agua de pozo respectivamente, SEM 0.41 , p = 0.94) y el rendimiento (545 vs 519 kg como alimento, SEM 21.5, p = 0.41). Las características nutricionales de HBF y TMR se muestran en las Tablas 4 y 5.

Tabla 4. Características nutricionales (% de materia seca, a menos que se indique lo contrario) del forraje de cebada hidrónico utilizado en el ensayo de alimentación.

Tabla 5. Ingredientes (kg alimentados), composición química (% de materia seca a menos que se indique lo contrario) y distribución del tamaño de partícula (% de materia seca retenida del tamiz) de las dietas suministradas a las vacas lactantes.

El HBF se caracterizó por una cantidad significativa de NFC y azúcares solubles, un contenido moderado de PB, compuesto principalmente por nitrógeno no proteico y proteína altamente soluble, y un contenido muy bajo de ADF y lignina. Sin embargo, la composición de la TMR control y HBF fue muy similar.

3.2 Hallazgos clínicos, hematológicos y bioquímicos

Ninguna vaca mostró signos clínicos de enfermedad activa durante el estudio. No se observaron diferencias significativas entre los grupos en cuanto al peso corporal final (660,0 vs 661,7 kg para GC y HBFG, respectivamente, SEM 12,9, p = 0,91) y BCS (3,1 vs 3,2, SEM 0,04, p = 0,32). Los valores de BHB y CBC se mantuvieron dentro del rango de referencia y no se vieron afectados por el tratamiento dietético (Tabla suplementaria S4), así como por la mayoría de los hallazgos bioquímicos (Tabla 6).

Tabla 6. Perfil sanguíneo bioquímico (Media ± DE) de vacas lactantes alimentadas con dietas que contenían (HBFG) o no (CG) forraje hidropónico de cebada en los días T-14, T14, T28 y T42.

Las únicas excepciones fueron la urea, el fósforo y el colesterol, cuyos niveles estuvieron ligeramente fuera del rango óptimo de referencia tanto en GC como en HBFG (Tabla 6). Además, frente a valores iniciales similares (T-14), los niveles de Cl y Na mostraron una tendencia errática, siendo mayores en GC en T14 (p = 0,04 y p = 0,007, para Cl y Na, respectivamente) y en T42 (p = 0,004 y p < 0,001), y en HBFG en T28 (p = 0,02 y p = 0,07). Por último, la importancia de las iteraciones de T Bil, Alb, Cr, PHOS y NEFA parece deberse principalmente a las diferencias erráticas, a veces sólo numéricas, entre los dos grupos.

3.3 Ingesta de materia seca, clasificación de alimentos, hallazgos de pH ruminal

El consumo de materia seca tendió a ser mayor (p = 0,07) en el grupo HBFG (22,1 vs 23,4 kg/cabeza/d SEM 0,34 para GC vs. HBFG), mientras que no se observaron diferencias para la clasificación granulométrica de las dietas (Tabla Suplementaria S5). En el cuadro 7 se muestran el pH medio diario, el porcentaje de animales con al menos una alarma de riesgo de SARA y el número y el tiempo de las alarmas de riesgo de SARA detectadas por el sensor de pH ruminal.

Tabla 7. pH ruminal (media ± DE), porcentaje de animales que presentaron al menos una alarma de riesgo de acidosis ruminal subaguda (SARA), número y tiempo (min) de alarmas de riesgo de SARA detectadas durante el período experimental por sensores de pH ruminal en vacas lactantes alimentadas con dietas que contenían (HBFG) o no (CG) forraje hidropónico de cebada.

En promedio, aproximadamente la mitad de las vacas (es decir, 16 frente a 15 vacas para CG y HBFG) en ambos grupos tenían al menos un riesgo de SARA detectado. El número y la duración de las alertas SARA fueron numéricamente mayores para HBFG, pero las diferencias estuvieron lejos de ser estadísticamente significativas.

3.4 Producción y calidad de la leche

La producción de leche y los macrocomponentes de la leche de los grupos GC y HBFG se muestran en la Tabla 8. La inclusión de HBF de RUW no tuvo ningún efecto sobre la producción real de leche (kg/d) ni sobre el porcentaje de grasa, proteína, sólido no graso y sólido total. En consecuencia, la producción de MEC, grasa y proteína (kg/d) no difirió entre los dos grupos, a pesar de que la producción de proteína fue significativamente mayor en T1, por lo que se observó una interacción dieta × tiempo (datos no mostrados). Del mismo modo, el mayor contenido de lactosa en T7 y T42 en HBFG explica la importancia de la interacción.

Tabla 8. Producción de leche (LSM) de vacas alimentadas con dietas que contienen (HBFG) o no (CG) forraje hidropónico de cebada.

En cuanto a los componentes de la leche y los parámetros relacionados con las propiedades tecnológicas e higiénicas, no se observaron efectos de la dieta para el CCS y la caseína. Por otro lado, los valores de índice crioscópico y tiempo de coagulación del cuajo (r) fueron mayores (p = 0,003) y menores (p = 0,04), respectivamente, en HBFG que en GC. Además, también se observaron diferencias cercanas a la significación estadística para el tiempo de reafirmación de la cuajada (K20) (p = 0,06) y la firmeza de la cuajada (A30) (p = 0,04), que fueron mayores y menores, respectivamente, en el GC. De manera análoga a la producción de proteínas y al contenido de lactosa, la importancia de la dieta × las iteraciones temporales encontradas para las propiedades de urea, pH y coagulación reflejan su tendencia irregular durante el período de observación (datos no mostrados). Finalmente, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos en cuanto a la composición de AG de la grasa láctea (Tabla Suplementaria S6). No se detectaron metales pesados en la leche.

3.5 Digestibilidad, balance de nitrógeno, derivados de purinas en orina, aporte microbiano de N

No se observaron diferencias entre los grupos en cuanto a la digestibilidad in vivo (Tabla Suplementaria S7). En la Tabla 9 se muestran los parámetros del metabolismo del N.

Tabla 9. Balance de nitrógeno, excreción urinaria de creatinina y derivados de purinas (DP), y suministro microbiano de N (LSM) de vacas lactantes alimentadas con dietas que contienen (HBFG) o no (CG) forraje hidropónico de cebada.

El grupo alimentado con HBF tuvo una mayor ingesta de N (p = 0,04) (+ 39 g/d) debido al mayor IMD (+ 1,3 kg/d), junto con un mayor volumen de orina estimado (p = 0,06). Por el contrario, la distribución de N en leche, orina y heces y la excreción urinaria de alantoína y ácido úrico no se vieron afectadas por los tratamientos dietéticos, aunque se observó una tendencia hacia un aumento de la oferta estimada de MN (p = 0,07) en el grupo HBFG.

4 Discusión

4.1 Rendimiento y calidad de las aguas residuales urbanas regeneradas y del HBF

El gran interés en el uso de aguas residuales regeneradas con fines agrícolas afecta principalmente a las regiones áridas y semiáridas, pero el aumento del consumo de agua para riego ha dado lugar a innovaciones tecnológicas y marcos normativos para su uso seguro también en la UE. Los criterios establecidos en el Reglamento (UE) 2020/741 (17) se centran en las características fisicoquímicas (por ejemplo, demanda de oxígeno, sólidos suspendidos totales, turbidez) y microbiológicas (por ejemplo, carga de Salmonella y E. coli) del efluente. De acuerdo con este marco legislativo, el RUW utilizado en el presente estudio para producir HBF pertenece a la «clase B» y puede utilizarse para cultivos no alimentarios, incluidos los destinados a la alimentación del ganado lechero o cárnico. Otros criterios de calidad del agua de riego relacionados con la seguridad humana y ganadera, el crecimiento de los cultivos, la protección del suelo y los métodos de riego (por ejemplo, niveles de tóxicos, pH, conductividad eléctrica y SAR) indicaron una buena idoneidad general de RUW (14, 36). No existe un marco regulatorio para el uso de RUW tanto para la producción de HF como, en general, para sistemas hidropónicos, y la literatura sobre este tema específico es escasa y apenas aborda el tema de la calidad del agua. La conexión de los sistemas hidropónicos a las plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas puede proporcionar tanto un suministro continuo de RSU durante todo el año como de nutrientes a las plantas, especialmente nitrógeno y fósforo, que como principales nutrientes de las plantas no suponen un riesgo per se en el agua de riego (18). Sin embargo, en contraste con los resultados de otros (32, 34), que observaron una mejora en la producción de forraje, los rendimientos de HBF aquí descritos no fueron diferentes cuando se utilizó RUW o agua de pozo. Por lo tanto, por un lado, el uso de RUP no afectó negativamente los procesos de germinación y crecimiento, como puede ser el caso cuando permanecen altos niveles de contaminantes (es decir, metales pesados y sustancias tóxicas y contaminantes orgánicos) en el efluente (58, 59). Por otro lado, la falta de mejora en el rendimiento indica que el ciclo de producción extremadamente corto del HBF no permitió aprovechar el suministro de nutrientes del RUW. Hipotéticamente, el alto contenido de nitrógeno del HBF del agua de pozo (Tabla 3) podría ser indicativo de contaminación por nitratos de las aguas subterráneas, lo que podría haber enmascarado las diferencias entre los rendimientos de HBF. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la actividad fotosintética no comienza hasta cinco días después de que aparece la primera raíz, y solo entonces se requiere N para el crecimiento de la planta (60).

La composición química del HBF difiere de la del forraje producido convencionalmente debido al ciclo de crecimiento muy corto, que no permite la deposición de celulosa y lignina en la pared celular, y por la presencia no solo de la parte epigea (hojas y tallos) sino también de semillas residuales no germinadas o germinadas y raíces jóvenes. Estas características explican el menor contenido de lignina y celulosa, la mejor digestibilidad de la FDN y el mayor contenido de proteínas solubles y azúcares en comparación con los forrajes convencionales (61, 62). Como alimento, el HBF podría compararse con el ensilado o el puré de maíz, con la gran diferencia, como ya se mencionó, de que se trata de un alimento fresco. Nuestros resultados sobre la composición del HBF concuerdan en gran medida con los informes de la literatura (31, 35, 63-66) que confirman aún más que el RUW no interfirió con los procesos normales de germinación y crecimiento de las semillas durante la producción de HBF.

4.2 Salud de las vacas

El uso de RUW para producir HBF puede plantear riesgos para la salud de las vacas lactantes, principalmente debido a la posible presencia de agentes microbiológicos. De hecho, la producción hidropónica de forraje implica que el agua entra en contacto con el forraje, lo que puede transportar microorganismos dañinos. Como se ha mencionado anteriormente, el Reglamento de la UE tiene por objeto reducir significativamente este riesgo estableciendo límites estrictos para las cargas de Salmonella y E. coli, es decir, las principales especies microbianas utilizadas para certificar la seguridad del agua (67). La desinfección RUW con dióxido de cloro utilizada en el presente estudio y como se usa comúnmente en sistemas hidropónicos para prevenir el crecimiento de moho en un ambiente de alta HR (68), proporcionó una reducción adicional del riesgo microbiológico. De hecho, el HBF producido con RUW no tenía niveles de Salmonella spp., E. coli dentro de los límites seguros [es decir, < 10 UFC (13)], y, teniendo en cuenta que el índice de moho era cercano a cero durante el ensayo, no se detectó ningún crecimiento de moho relevante. Los efluentes urbanos pueden contener niveles de metales pesados que son peligrosos para la salud animal y humana (5, 13). Sin embargo, estos contaminantes se encontraban en niveles muy bajos o cercanos a cero en el RUW utilizado y no se detectaron en el HBF ni en las muestras de leche recogidas al final del ensayo, es decir, después de 7 semanas de alimentación diaria con el HBF producido por el RUW. En comparación con la literatura existente, estos resultados son de particular interés, ya que el uso de RUW en los sistemas tradicionales de producción de forraje puede conducir a la contaminación de los alimentos, exponiendo a los animales a un riesgo microbiológico inevitable (67, 69-72) y a un aumento peligroso en la ingesta de metales pesados (73-76).

Las vacas alimentadas con HBF estaban en buen estado de salud y no se produjeron manifestaciones clínicas de mastitis, laminitis u otras enfermedades o trastornos de salud y metabólicos durante el estudio. Además de la ausencia de signos clínicos de enfermedad en curso, los indicadores indirectos pero cruciales del estado de salud de las vacas, como el hemograma completo y los hallazgos bioquímicos clave, no mostraron variaciones significativas (77, 78), estando dentro del rango de referencia para vacas sanas y no difiriendo sustancialmente entre los grupos GC y HBFG. Los muy altos contenidos de Na y Cl tanto en RUW como en HBF (Tablas 2, 3) pueden haber influido en sus niveles séricos irregulares (Tabla 6) a través de fenómenos de excreción iónica típicos de los túbulos renales (79), aunque una explicación definitiva requerirá investigaciones futuras. En general, estos resultados apoyan la hipótesis de que el uso de RUW para la producción de HBF en las condiciones probadas puede considerarse seguro para el estado de salud de las vacas lactantes. Los efectos de los piensos derivados de las aguas residuales sobre el metabolismo y la salud de los animales se han investigado en un número limitado de estudios (5, 80). Por lo tanto, este estudio puede considerarse uno de los primeros en abordar la necesidad de un uso más sostenible del agua en la producción ganadera mediante el reciclaje de este recurso finito y limitante. En cuanto al estudio de Terrè et al. (5), encontraron que el uso de RUW para beber y preparar sustituto de leche no tenía efectos a corto plazo sobre la salud y el rendimiento de los terneros jóvenes. En contraste, Al-Qudah et al. (80) encontraron síntomas de envenenamiento por nitratos en rebaños lecheros alimentados con pasto fresco regado con agua municipal tratada.

4.3 Rendimiento de la leche, consumo de materia seca, digestibilidad in vivo y balance de nitrógeno

La inclusión de HBF producido por RUW en la dieta no tuvo un efecto significativo en la mayoría de los parámetros fisiológicos y rasgos de producción medidos durante el ensayo de alimentación. Se utilizó un nivel conservador de inclusión, pero estuvo en línea con la mayoría de los estudios que evaluaron el efecto del forraje hidropónico sobre la producción y la calidad de la leche (35, 81-86). La ausencia de diferencias entre el GC y el HBFG en términos de DMI y clasificación de alimento, así como digestibilidad in vivo y pH ruminal, confirma tanto la palatabilidad del HBF como la regularidad del proceso digestivo. La literatura científica y nuestros resultados coinciden en que el HBF es una rica fuente de vitaminas, minerales, enzimas bioactivas, azúcares solubles y nitrógeno soluble (87, 88). Sin embargo, de acuerdo con nuestros resultados, otros trabajos no han encontrado ningún efecto del HBF sobre la producción o la calidad de la leche (35, 82, 83, 89, 90). Estos resultados contrastantes podrían deberse fácilmente a los diferentes niveles de inclusión de IC y/o a las diferentes dietas utilizadas. En particular, la mejora en la producción de leche parece estar relacionada con la cantidad de HF incluida en la ración (30). La falta de diferencias significativas en la calidad de la leche también es reportada por la mayoría de los estudios previos (35, 89, 90). Vale la pena señalar que la falta de diferencias significativas para el CCS no es un resultado trivial, ya que la alimentación con piensos insalubres, mohosos, contaminados, etc. puede conducir a un aumento del CCS en la leche, incluso en ausencia de signos clínicos de enfermedad (91, 92). La tendencia al empeoramiento de la aptitud de coagulación en la leche HBFG, probablemente impulsada por el índice crioscópico más alto, no está confirmada en la literatura y se necesita más investigación para aclarar este hallazgo. Sin embargo, todos los valores de los parámetros reológicos estuvieron dentro del rango normal. Es bien sabido que el forraje fresco puede tener efectos positivos en la composición de AG de la grasa láctea en términos de aumento del contenido de AGPI, AGU y CLA (21, 25, 93). La falta de efectos significativos del HBF que encontramos no es inconsistente con la literatura porque, como hemos demostrado en trabajos anteriores (21), es poco probable que los bajos niveles de inclusión de forraje fresco en la dieta alteren significativamente la composición de ácidos grasos de la leche.

La falta de diferencias para la digestibilidad in vitro concuerda con la observación de otros para dietas similares (94, 95). Para ambos grupos, el nivel de excreción de N estuvo dentro del rango reportado por Spanghero y Kowalski (57) para una ingesta similar de N, mientras que la estimación de NB fue menor, probablemente debido al mayor N de la leche registrado en nuestro estudio o a una combinación de N no contabilizado, como la excreción urinaria de N en formas no detectadas por el método Kjeldhal (p. ej., nitrato), pérdidas volátiles de N gaseoso y amoníaco, y escoria dérmica (57, 96). Aunque la ingesta de N fue mayor para el HBFG, no se observaron diferencias entre los grupos para la excreción de N, en contraste con una gran cantidad de literatura que informa una estrecha relación entre la ingesta de N y la excreción urinaria de N (97-101). Este hallazgo podría deberse a una utilización más eficiente del amoníaco ruminal en las vacas HBFG, lo que resulta en una menor absorción de amoníaco portal y, en consecuencia, una menor N urinaria (102). La disminución de la EP total recuperada en orina, junto con la falta de diferencias en la concentración de urea en la leche y en el plasma, puede apoyar indirectamente esta hipótesis. La mayor producción de orina de las vacas alimentadas con la dieta que contiene HBF probablemente refleja la mayor ingesta de Na, junto con otros minerales y oligoelementos, lo que resulta en una mayor producción de orina para mantener una osmolaridad plasmática óptima (103, 104).

5 Conclusión

El uso del agua y la tierra asociado con la producción ganadera podría reducirse cambiando los métodos de producción de piensos y utilizando fuentes de agua adicionales, como las aguas residuales de las zonas urbanas. En este estudio investigamos los efectos del uso de aguas residuales urbanas terciarias para la producción hidropónica de forraje de cebada sobre la calidad del forraje, la salud y el rendimiento de las vacas lactantes y la calidad de la leche. Se comprobó que el tratamiento de aguas residuales mediante tecnología de biorreactor de membrana era eficaz para eliminar las bacterias y los huevos de nematodos, mientras que la desinfección en la granja de los RSU contribuyó además a mantener la carga de coliformes en el nivel establecido por el Reglamento de la UE 741/2020 para el agua de riego destinada a los cultivos destinados a la alimentación del ganado lechero o de carne. Los RUV mostraron una buena calidad general como calidad de riego y un buen contenido de N y P como fertilizantes, lo que, sin embargo, no afectó el rendimiento y la calidad de los HBF. Las características del HBF reflejaron la calidad del RUW suministrado a las cámaras de crecimiento. La alimentación de vacas lactantes con HBF derivado de RUW no tuvo efectos positivos o negativos importantes en la salud y la producción de los animales, incluida la calidad de la leche, la digestibilidad in vivo y el balance de nitrógeno. De ello se deduce que el uso de RUW en las condiciones consideradas parece ser seguro para el estado sanitario de las vacas lactantes y para la calidad de la leche obtenida. En general, los resultados no indican limitaciones importantes para el uso de aguas residuales terciarias para producir forraje de cebada hidropónico. Por lo tanto, parece realista una aplicación más amplia de RUW como agua de riego en sistemas hidropónicos. Los estudios futuros que tengan en cuenta la medición precisa del consumo de RUW, las características y la utilización del efluente de RUW de la cámara hidropónica, junto con la evaluación del impacto de los niveles más altos de alimentación de HBF producido por RUW en la salud y el rendimiento de los animales, es decir, las principales limitaciones de este estudio, serán de interés para validar plenamente estos resultados y proporcionar una indicación más completa del potencial de las dos tecnologías acopladas para mejorar el medio ambiente. sostenibilidad de la ganadería. Además, incluso si la calidad de los RSU está certificada por la planta de tratamiento, su uso sigue requiriendo un seguimiento en la explotación de los cultivos y del estado sanitario de las vacas lactantes, así como la adopción de prácticas de higiene adecuadas.

Por último, cabe destacar que el aspecto económico de la producción de HBF no puede considerarse «despreciable» en la decisión de utilizar este tipo de cultivo, aunque sí apoya los objetivos de este trabajo. A pesar de la posibilidad de reutilizar un recurso hídrico como son las aguas residuales, el cultivo hidropónico requería de una importante inversión económica y de costes variables, relacionados principalmente con la compra de cámaras de crecimiento y semillas de cebada, lo que podría afectar a la sostenibilidad económica de este tipo de producción. Se necesitan más estudios tecnológicos y de diseño para desarrollar cámaras de crecimiento que aumenten la productividad y reduzcan los costos.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración ética

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité de Revisión Institucional del Ministerio de Salud italiano (código de protocolo 74371-X/10, n.º 1.031/2020-PR, fecha de aprobación 19, noviembre de 2021). Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones de los autores

LC: Redacción: borrador original, conceptualización, adquisición de fondos. MC: Escritura: borrador original, curación de datos, investigación. FS: Curación de datos, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. AF: Conceptualización, Investigación, Curación de datos, Redacción – revisión y edición, Análisis formal, Supervisión. FM: Escritura – borrador original, Escritura – revisión y edición. GC: Obtención de fondos, administración de proyectos, conceptualización, redacción, revisión y edición.

Financiación

El/los autor/es declara(n) haber recibido apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Este trabajo fue financiado por la región de Apulia en el marco del Programa Operativo FE5R 2014/2020-Azione 6.4-Sub-Az 6.4.a.DGR 2321/2017 con el título del proyecto «Utilizzo delle acque reflue affinate per la produzione di foraggio idroponico per l’alimentazione del bestiame» (Acrónimo Hydrofodderpuglia).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2023.1274466/full#supplementary-material

Referencias