Diagnóstico molecular de la campilobacteriosis genital bovina mediante análisis de fusión de alta resolución

Diagnóstico molecular de la campilobacteriosis genital bovina mediante análisis de fusión de alta resolución, foto Campylobacter fetus

 

Diagnóstico molecular de la campilobacteriosis genital bovina mediante análisis de fusión de alta resolución

Marta Filipa Silva1,2 , Sabine Kienesberger3,4,5, Gonçalo Pereira1,2,  Luísa Mateus1,2,  Luís Lopes-da-Costa1,2 y Elisabete Silva1,2*
  • 1Faculdade de Medicina Veterinária, Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal
  • 2Laboratorio Asociado de Ciencias Animales y Veterinarias (AL4AnimalS), Lisboa, Portugal
  • 3Instituto de Biociencias Moleculares, Universidad de Graz, Graz, Austria
  • 4BioTechMed-Graz, Graz, Austria
  • 5Campo de Excelencia BioSalud, Universidad de Graz, Graz, Austria

 

La campilobacteriosis genital bovina (BGC) es una enfermedad venérea transmitida por todo el mundo del ganado causada por Campylobacter fetus subsp. venerealis (Cfv). Aunque se desarrollaron varios ensayos de PCR en tiempo real para la identificación de Cfv, la mayoría de los elementos genéticos móviles se dirigen a los que pueden conducir a un diagnóstico falso positivo. En este estudio, se desarrolló un ensayo de PCR en tiempo real junto con un análisis de fusión de alta resolución (HRM) para la identificación de la subespecie de Campylobacter fetus y su aplicación en el diagnóstico de BGC. Se validaron dos ensayos de MDH dirigidos a diferentes polimorfismos de un solo nucleótido utilizando 51 cepas de C. fetus, incluidas 36 Cfv y 15 C. fetus subsp. feto (Cff). La especificidad se evaluó en 50 muestras prepuciales previamente probadas como negativas para C. feto y en 24 cepas de otras especies de Campylobacter. La sensibilidad analítica se determinó con diluciones diez veces de las copias del genoma de Cfv y en muestras preputiales con células Cfv. Ambos ensayos de gestión de recursos humanos identificaron con precisión las cepas de 51 C. feto, mostrando una concordancia del 100 % con la identificación anterior. La identificación de la subespecie de C. feto por HRM mostró resultados concordantes con la prueba de glicina en el 98,0% de los aislados. No se obtuvo amplificación en muestras prepuciales negativas de C. feto, así como en cepas de otras especies de Campylobacter. Los ensayos fueron capaces de detectar 102 copias del genoma de Cfv, mientras que para las muestras de lavado prepucial el límite de detección fue de 103 UFC/ml. Estos novedosos ensayos de gestión de recursos humanos representan una herramienta altamente específica y sensible para la identificación de la subespecie C. feto y muestran potencial de uso directo en muestras prepuciales de toros para el diagnóstico de BGC.

Introducción

La campilobacteriosis genital bovina (BGC) es una enfermedad bacteriana venérea del ganado causada por Campylobacter fetus subsp. venerealis (Cfv) (OIE, 2021). Los toros actúan como reservorios de la enfermedad al llevar Cfv en el tracto genital durante largos períodos de tiempo (Silveira et al., 2018). La infección de las hembras se produce durante la reproducción natural o la inseminación artificial, y causa endometritis, mortalidad embrionaria y aborto, lo que resulta en infertilidad de la vaca, un bajo rendimiento reproductivo del rebaño y pérdidas económicas para la industria ganadera (Mshelia et al., 2010; Michi et al., 2016).

El diagnóstico de BGC requiere una identificación precisa del agente causal, lo que es un desafío debido a las dos subespecies de C. fetus que pueden estar presentes en el ganado, C. fetus subsp. fetus (Cff) y Cfv (Silveira et al., 2018). Estas subespecies tienen genomas altamente sinténicos y exhiben rasgos fenotípicos similares, lo que dificulta su diferenciación mediante métodos moleculares o ensayos fenotípicos (Sprenger et al., 2012; Silveira et al., 2018). El cultivo microbiológico seguido de la identificación fenotípica es el enfoque clásico para la identificación de C. feto y la diferenciación de subespecies, según lo recomendado por la Organización para la Salud Animal (OIE) (OIE, 2021). Esta diferenciación se basa en la prueba de tolerancia a la glicina al 1 %, en la que el Cfv es intolerante, mientras que el Cff es tolerante a la glicina (OIE, 2021). Sin embargo, el diagnóstico de BGC por cultivo microbiológico es un desafío debido al crecimiento exigente y la mala supervivencia del patógeno (Mshelia et al., 2010). Por otro lado, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha surgido como una técnica prometedora para diferenciar a la subespecie C. feto con la ventaja de no depender de la viabilidad bacteriana (McMillen et al., 2006; Silveira et al., 2018). Se han desarrollado varios ensayos dirigidos a diferencias en las características genómicas, como el gen parA y el elemento de inserción ISCfe1 (McMillen et al., 2006; Abril et al., 2007; McGoldrick et al., 2013; van der Graaf-van Bloois et al., 2013). Sin embargo, estos objetivos se pueden transferir horizontalmente, lo que puede provocar una falta de especificidad cuando se utilizan con fines de diagnóstico en muestras clínicas (Spence et al., 2011;Silva et al., 2020a; Polo et al., 2021). Recientemente, se detectaron homólogos Cfv parA e ISCfe1 en otro habitante del tracto genital bovino, Campylobacter portucalensis (Silva et al., 2020b), identificando este microorganismo como una causa de resultados falsos positivos en ensayos moleculares de detección de Cfv (Silva et al., 2020a). Estos informes destacan la importancia de desarrollar ensayos moleculares alternativos para la detección y diferenciación fiables de la subespecie C. feto.

Estudios anteriores han demostrado que algunos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en el genoma central de C. feto diferencian a Cff de Cfv (Abdel-glil et al., 2020). En este contexto, la PCR en tiempo real seguida del análisis de fusión de alta resolución (HRM) permitiría la detección de tales variaciones en secuencias de amplicon. Este método se basa en la amplificación de un objetivo de interés en la presencia de un tinte de unión a dsDNA, que exhibe una alta fluorescencia en el estado limitado al dsDNA y baja fluorescencia cuando no está unido. La fusión de alta resolución sigue el paso de amplificación, con la desnaturalización gradual de los amplicones debido a pequeños incrementos en la temperatura, lo que origina un perfil de fusión específico de cada producto (Chua et al., 2015). El equipo captura los cambios en la señal de fluorescencia con alta precisión en diferentes puntos de temperatura, detectando con precisión las diferencias en el comportamiento de fusión de las secuencias diferenciadas por un solo SNP (Life Technologies Corporation, 2010). En los últimos años, este método se ha empleado como herramienta para la identificación y diferenciación de patógenos (Chua et al., 2015; Zhang et al., 2021; Ghorbani et al., 2022; Pakbin et al., 2022). En este estudio, desarrollamos dos ensayos de gestión de recursos humanos para detectar SNP que identifican y diferencian la subespecie C. feto. Estos ensayos tienen el potencial de aplicarse directamente en el análisis de muestras clínicas.

Materiales y métodos
Las cepas de Campylobacter fetus y las condiciones de cultivo

Cincuenta y una cepas de C. feto identificadas en estudios anteriores como Cfv (n = 36) o Cff (n = 15; Tabla Suplementaria 1), se utilizaron para el desarrollo de los ensayos de MDH. Además, se evaluaron tres cepas de C. feto con clasificación de subespecies no consensuada en estudios anteriores (Tabla complementaria 1). Las cepas se cultivaron en placas de agar de sangre de Columbia, suplementadas con un 5 % de sangre de oveja (COS, Biomerieux, Marcy l’Étoile, Francia), a 37 °C durante 48 horas en condiciones microaerófilas (GenBox Microaer, Biomerieux, Marcy l’Étoile, Francia).

Prueba de tolerancia a la glicina

La tolerancia al 1 % de glicina se evaluó siguiendo las recomendaciones publicadas anteriormente (On y Holmes, 1991a, b). En pocas palabras, las placas se prepararon añadiendo un 1 % de glicina (grado de biología molecular de glicina, AppliChem, Darmstadt, Alemania) al agar de Columbia (base de agar de sangre de Columbia, Hampshire, Inglaterra) antes del autoclave, y complementando con un 5% de sangre de oveja desfibrinada (Thermo Scientific, Hampshire, Después de 48 horas de crecimiento, se prepararon suspensiones bacterianas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una turbidez ajustada a 0,3 McFarland, utilizando un densitómetro de densimat (Biomerieux, Marcy-l’Étoile, Francia), correspondiente a 108 UFC/ml. Las placas de agar sanguíneo suplementadas con 1% de glicina fueron inoculadas por triplicado con 20 μL de gotas de una suspensión bacteriana ajustada a 106 UFC/ml, las manchas se dejaron secar y incubadas en condiciones microaerófilas a 37 °C durante 72 h. Para validar la ausencia de crecimiento bacteriano en placas de glicina, se confirmó el crecimiento bacteriano en placas libres de glicina. Cfv NCTC 10354 y Cff NCTC 10842 se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente.

Extracción de ADN

El ADN genómico de las cepas bacterianas se aisló utilizando el kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN purificado se cuantificó utilizando un espectrofotómetro nanogota 2000C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos) y se almacenó a -20 °C hasta el análisis.

Ensayos de análisis de fusión de alta resolución PCR en tiempo real
Diseño de imprimación

Se diseñaron tres juegos de imprimación para dirigirse a tres SNP descritos anteriormente (Abdel-glil et al., 2020), con el potencial de diferenciar Cfv de Cff. Los loci CFF8240_0641, CFF8240_1016 y CFF8240_1380 de la secuencia de referencia de Cff 82-40 (NCBI adhesión no. CP000487.1) fueron seleccionados para el diseño de imprimación, utilizando el software Primer3web v.4.1.0 (Koressaar y Remm, 2007; Untergasser et al., 2012; Kõressaar et al., 2018) y el software Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, Estados Unidos), y Primer-BLAST (Ye et al El análisis de imprimación-BLAST incluyó 18 genomas de C. feto y reveló un SNP en el genoma Cff 04/554 (n.o de acceso: CP008808.1) en el sitio de unión de la imprimación inversa dirigida a CFF8240_1016. Aunque no fue posible diseñar una cartilla entre este polimorfismo y el SNP objetivo debido a su proximidad, el ensayo se incluyó en el estudio ya que entre todos los genomas secuenciados de C. feto de bovinos solo la cepa Cff 04/554 muestra este polimorfismo.

Un análisis preliminar reveló que los cebadores dirigidos al locus CFF8240_1380 produjeron productos de amplificación no específicos en muestras prepuciales negativas para C. feto, y fueron excluidos de un análisis posterior. Los ensayos dirigidos a los loci CFF8240_1016 y CFF8240_0641, que codifican una fosfatasa de la familia Ppx/GppA y una proteína de la familia Hit, respectivamente, se seleccionaron para un análisis posterior (Tabla 1 y Figura 1).

www.frontiersin.orgTabla 1. Secuencias de imprimación utilizadas para identificar y diferenciar la subespecie C. feto.

www.frontiersin.orgFigura 1. Representación esquemática de los productos de amplificación que contienen SNP que diferencian aCampylobacter fetus subsp. venerealis de C. fetus subsp. fetus. La imagen muestra los productos de amplificación para los loci CFF8240_0641 (A) y CFF8240_1016 (B) para la cepa Cff 82-40 y las cepas utilizadas como controles en este estudio, Cff NCTC 10842 y Cfv NCTC 10354. Los SNP están resaltados en rojo (Cff) y verde (Cfv); las líneas negras representan los sitios de unión de imprimación.

Análisis de fusión de alta resolución por PCR en tiempo real

Los ensayos de PCR en tiempo real se llevaron a cabo en mezclas de reacción de 20 μL que contenían 1× MeltDoctor HRM Master Mix (pplied Biosystems, Foster City, Estados Unidos), 0,3 μM de cada imprimación, 2 ng de ADN bacteriano o 1 μL de ADN de muestras prepuciales. Todas las muestras se probaron por triplicado y las cepas de C. feto se probaron en tres carreras independientes. Cfv NCTC 10354 y Cff NCTC 10842 se incluyeron como controles positivos y se utilizaron para la llamada variante. La clasificación de las subespecies se basó en el comportamiento de fusión de los controles incluidos en cada carrera. La amplificación se realizó en un sistema 7500 FAST (Applied Biosystems, Foster City, Estados Unidos) utilizando las siguientes condiciones térmicas: un paso de inicialización de 95 °C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de amplificación con desnaturalización a 95 °C durante 15 s y recocido a 60 °C durante 1 minuto. Los amplicones generados se sometieron a la etapa de gestión de recursos humanos, que se realizó de acuerdo con las especificaciones del fabricante: desnaturalización a 95 °C durante 10 s, recocido a 60 °C durante 1 minuto, seguido de gestión de gestión de recursos humanos hasta 95 °C durante 15 s y recocido a 60 °C durante 15 s. El análisis de la gestión de recursos humanos se realizó utilizando el software de fusión de alta resolución v3.0 (Applied Biosystems, Foster City, Estados Unidos). Se consideró positivo un ciclo de umbral (Ct) < 35 y se secuenciaron los productos de amplificación de ocho cepas representativas de C. feto (Stabvida, Almada, Portugal) para confirmar la presencia del SNP esperado.

Especificidad y sensibilidad analítica

La especificidad de los ensayos se evaluó en 24 cepas de otras especies de Campylobacter (Tabla Suplementaria 2), incluyendo Campylobacter portucalensis (n = 5), Campylobacter sputorum (n = 6), Campylobacter lari (n = 1), Campylobacter lanienae (n = 1), Campylobacter coli (n = 4) Además, se analizaron un total de 50 muestras de lavado prepucial previamente probadas como negativas para C. feto por PCR en tiempo real dirigida al gennahE (Silva et al., 2020a) para evaluar la especificidad del ensayo de MHRM en muestras clínicas.

La sensibilidad analítica se evaluó mediante el uso de diluciones seriadas 10 veces del ADN de la cepa Cfv NCTC 10354, como se describió anteriormente (Silva et al., 2020a). Las diluciones que van desde 1 × 101 a 1 × 106 copias del genoma se probaron por triplicado, en tres carreras independientes, para garantizar la reproducibilidad. Se analizó la curva estándar para la evaluación de la linealidad (r2), la eficiencia de amplificación (E) y la reproducibilidad como se describió anteriormente (Silva et al., 2020a).

Además, las muestras prepuciales de tres toros se aumentaron con la cepa Cfv NCTC 10354 para simular muestras positivas. En resumen, los cultivos bacterianos se suspendieron en PBS y se ajustaron a 0,3 McFarland (≈1 × 108 UFC/ml), y las suspensiones se diluyeron y se agregaron a las muestras preputiales para alcanzar concentraciones finales de mezcla que oscilaban entre 1 × 105 y 1 × 101 UFC/ml en 2 ml de muestra preput La extracción de ADN se realizó utilizando 2 ml de muestra, se centrifugó a 5.000 × g durante 10 minutos y el gpele se resuspendió en 180 μL de tampón ATL (DNeasy Blood and Tissue kit, Qiagen, Hilden, Alemania) para el aislamiento del ADN como se describió anteriormente para los aislados de C. fetus. El paso final de la elución se realizó utilizando 100 μL de tampón AE (DNeasy Blood and Tissue kit, Qiagen, Hilden, Alemania).

Reproducibilidad

La reproducibilidad intra e interensayal se evaluó para todas las cepas de C. feto, utilizando el coeficiente de variación (CV) del valor de la temperatura de fusión (Tm) en tres réplicas probadas en la misma placa y en tres carreras independientes, respectivamente.

Análisis estadístico

Las diferencias en la Tm media entre los amplificadores Cfv y Cff se evaluaron con la prueba t de Student utilizando IBM SPSS Statistics 27.0 (IBM Corporation, Armonk, Estados Unidos). Los resultados de la temperatura de fusión se informan como media de tres carreras independientes ± desviación estándar (SD). Los valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados
Clasificación de las cepas de Campylobacter fetus

Las 51 cepas de C. feto se evaluaron mediante dos ensayos de PCR en tiempo real dirigidos a los loci CFF8240_0641 y CFF8240_1016, seguidos de un análisis de la gestión de recursos humanos. Ambos ensayos de PCR-HRM en tiempo real fueron capaces de segregar las cepas de C. feto en dos poblaciones distintas basadas en el Tm de los productos de amplificación (Figura 2). La amplificación de un solo amplicón se confirmó por la presencia de un solo pico en cada parcela de curva de fusión y por electroforesis en gel de agarosa. Además, se confirmó que las diferencias en el Tm estaban asociadas con los SNP esperados mediante la secuenciación de Sanger de cinco amplicons representativos de ambos perfiles de curva. Ambos ensayos de gestión de recursos humanos identificaron aislados de Cfv y Cff de acuerdo con la clasificación inicial de las cepas. Todas las cepas de Cfv eran sensibles a la glicina, mientras que las cepas de Cff crecieron en placas de glicina, con la excepción de la cepa 98/v445.

www.frontiersin.orgFigura 2. Análisis de la curva de fusión de los productos de amplificación de Campylobacter fetus subsp. venerealis y C. fetus subsp. fetus. Curvas de fusión alineadas (A,B) y gráficos de diferencia (C,D) de los ensayos dirigidos a los loci CFF8240_0641 (A,C) y CFF8240_1016 (B,D) obtenidos utilizando el software de fusión de alta resolución. Las gráficas de diferencia se estaban obteniendo utilizando como referencia la curva de Cfv NCTC 10354. Curvas azules: C. fetus subsp.venerealis; Curvas rojas: C. fetus subsp. feto.

Las temperaturas de fusión obtenidas para cada aislado en las tres carreras independientes se muestran en la Tabla 3 complementaria. El ensayo dirigido a CFF8240_0641 diferenció Cfv de Cff a través de un amplicon medio Tm de 73,34 y 73,74°C (P < 0,001), respectivamente (Tabla 2). El ensayo dirigido a CFF8240_1016 diferenció Cfv de Cff a través de una Tm media de 73,11 °C y 73,59 °C (P < 0,001), respectivamente (Tabla 2). Estos ensayos mostraron bajos coeficientes de variación dentro del ensayo para todas las cepas probadas, que fueron menores o iguales a 0,085 y 0,095 % utilizando cebadores para loci CFF8240_0641 y CFF8240_1016, respectivamente (Tabla 2), lo que evidenciando una buena reproducibilidad entre réplicas. Para ambos ensayos, las cepas se probaron en diferentes carreras y los resultados de Tm mostraron solo diferencias menores entre los ensayos, como lo demuestra el CV entre ensayos menor o igual a 0,337 y 0,176 % para CFF8240_0641 y CFF8240_1016, respectivamente (Tabla 2).

www.frontiersin.orgTabla 2. Temperatura de fusión en ensayos de fusión de alta resolución para diferenciar la subespecie Campylobacter fetus.

En este estudio también se evaluaron tres cepas de C. fetus (98/v444, BT 34/99 y 110800-21-2) con clasificación de subespecies sin consenso en informes anteriores. De acuerdo con la prueba de tolerancia a la glicina y los ensayos de gestión de recursos humanos, las cepas 98/v444 y BT 34/99 se clasificaron aquí como Cfv, mientras que la cepa 110800-21-2 se clasificó como Cff (Tabla complementaria 3).

Especificidad y sensibilidad analítica de los ensayos de análisis de fusión de alta resolución

La especificidad de los ensayos se evaluó probando el ADN de otras especies de Campylobacter (Tabla Suplementaria 2) y muestras de lavado prepucial previamente clasificadas como negativas para C. feto. No se obtuvo amplificación y, en consecuencia, no se obtuvieron curvas de fusión al usar ADN de C. portucalensis, C. sputorum, C. lari, C. lanienae, C. coli, C. jejuni y C. hyointestinalis. Ambos ensayos también produjeron resultados negativos en las 50 muestras de lavado prepucial probadas, lo que es consistente con la ausencia de amplificación del gen nahE, lo que indica la ausencia de amplificación no específica. En general, ambos ensayos revelaron un 100 % de sensibilidad y un 100 % de especificidad.

La sensibilidad analítica de los ensayos se evaluó mediante diluciones seriadas de diez veces del ADN genómico de Cfv NCTC 10354. Los resultados revelaron que ambos ensayos de PCR-HRM en tiempo real fueron capaces de detectar 102 copias del genoma con un umbral de ciclo (Ct) inferior a 35 (Ct = 34,71 ± 0,12 para CFF8240_0641 y Ct = 34,60 ± 0,03 para CFF8240_1016) (Tabla 3).Estos resultados fueron reproducibles en tres carreras independientes, mostrando la misma temperatura de fusión del amplicón. La curva estándar reveló una eficiencia de amplificación de 91,45 y 93,16 % para los ensayos CFF8240_0641 y CFF8240_1016, respectivamente, con un r2 de 0,99 y coeficientes de variación ≤ 1,7 % (Tabla 4).

www.frontiersin.orgTabla 3. Resultados de amplificación para las copias del genoma de Campylobacter fetus subsp. venerealis NCTC 10354.

www.frontiersin.orgTabla 4. Parámetros de rendimiento de los ensayos de PCR en tiempo real.

Para evaluar la idoneidad de los ensayos para el diagnóstico en muestras clínicas, también se evaluó el límite de detección (LOD) en muestras de lavado prepucial con Cfv. El LOD de ambos ensayos fue de 103 UFC/ml en tres carreras independientes utilizando muestras de lavado prepucial de tres toros. La amplificación de muestras prepuciales con 103 UFC/ml se produjo en ciclos de umbral de 34,13 ± 0,23 y 33,86 ± 0,55 para ensayos dirigidos a CFF8240_0641 y CFF8240_1016, respectivamente.

Discusión

La identificación precisa de Cfv es crucial para el diagnóstico de BGC, ya que solo las subespeciesvenerealis se reconocen como el agente etiológico de la enfermedad (OIE, 2021). La identificación errónea del feto de las subespecies como venerealis origina considerables costos económicos relacionados con las pruebas, el sacrificio y las estrategias de control, como la inseminación artificial. Por otro lado, la identificación errónea de un Cfv como Cff perpetúa la enfermedad en el rebaño con los costos asociados relacionados con la disminución de la eficiencia reproductiva. En los últimos años, se han desarrollado varios ensayos de PCR en tiempo real para detectar secuencias específicas de las subespecies venerealis, como los genes del elemento de inserción ISCfe1, parA y virB11 (McMillen et al., 2006; McGoldrick et al., 2013; van der Graaf-van Bloois et al., 2013; Sin embargo, estas secuencias se pueden transferir horizontalmente y se han asociado a fallas de especificidad en ensayos de PCR en tiempo real (Spence et al., 2011; Silva et al., 2020a;Polo et al., 2021). Por lo tanto, el diagnóstico molecular preciso de BGC todavía requiere la identificación de objetivos moleculares específicos de Cfv.

Un estudio reciente basado en datos de secuenciación de genoma completo identificó SNP que diferenciaban los genomas positivos de ISCfe1, propuestos como Cfv, de las cepas restantes de C. feto (Abdel-glil et al., 2020). La PCR en tiempo real junto con la MHR puede diferenciar a los SNP y ha surgido como un método rápido, fácil de realizar y rentable para la identificación y diferenciación de varios patógenos bacterianos (Zhang et al., 2021; Ghorbani et al., 2022; Pakbin et al., 2022).

En el presente estudio, tres de los SNP propuestos para diferenciar la subespecie (Abdel-glil et al., 2020) fueron seleccionados para desarrollar ensayos de PCR en tiempo real junto con el análisis de la gestión de recursos humanos para identificar la subespecie C. feto. Los pares de imprimación más prometedores se dirigen a una fosfatasa de la familia Ppx/GppA (locus CFF8240_1016) y a una proteína de la familia Hit (locus CFF8240_0641). Aunque estas secuencias difieren en un solo SNP, el comportamiento de fusión de los productos de amplificación se desplazó significativamente, lo que permitió la diferenciación de las subespecies. Ambos ensayos de PCR-HRM en tiempo real identificaron con precisión la subespecie de las cepas de 51 C. feto, con perfiles de curva de fusión e inequívocamente distintos y temperatura de fusión. Además, ambos ensayos revelaron una buena reproducibilidad intra e interensayal de los valores de Tm en todas las cepas probadas, evidenciada por los bajos valores de CV. Aunque los valores de Tm mostraron ligeras diferencias entre las ejecuciones de MHR, como se observó en otros estudios (Naze et al., 2015; Ashrafi et al., 2017; Fehlberg et al., 2017), estas diferencias se equilibraron mediante la inclusión de controles Cfv y Cff en cada carrera. La clasificación de las subespecies se asignó en función del comportamiento de fusión de los controles Cfv y Cff incluidos en cada placa, cuya inclusión es obligatoria en todas las carreras. También evaluamos cepas con resultados de clasificación de subespecies discrepantes en estudios anteriores. Las cepas 98/v444 y BT 34/99 se clasificaron aquí como Cfv, como indican Van Bergen et al. (2005), aunque se escribieron como Cff en otros estudios (Wagenaar et al., 2001; Gorkiewicz et al., 2010). La cepa 11800-21-2 se identificó previamente como Cfv (Gorkiewicz et al., 2010), pero estaba de acuerdo con otros estudios (Van Bergen et al., 2005; van der Graaf-Van Bloois et al., 2014,2016a,b). La falta de métodos estandarizados para la clasificación de subespecies y la ausencia de un patrón oro explícito pueden ser responsables de las clasificaciones en desacuerdo de las cepas de C. fetus en los estudios. Los ensayos de MDH desarrollados también tienen el potencial de implementarse como un método preciso para la detección directa de Cfv en muestras clínicas. Ambos ensayos detectaron con éxito Cfv en muestras prepuciales con 103 UFC/ml. La idoneidad de los ensayos también se validó por la ausencia de amplificación no específica en muestras prepuciales negativas para C. feto. Sin embargo, se deben probar estudios adicionales con muestras de animales infectados naturalmente y diferentes matrices, es decir, muestras de fetos abortados, para validar completamente estos ensayos para su uso en muestras clínicas. Además, las pruebas interlaboratorios de estos ensayos a partir de ahora serán valiosas para considerar estos ensayos como herramientas de diagnóstico global para el diagnóstico de la campilobacteriosis genital bovina en todo el mundo. Además, como identificamos un polimorfismo en el sitio de unión de imprimación adyacente al SNP en el locus CFF8240_1016 en un aislado bovino (cepa Cff 04/554), no podemos excluir fallas de especificidad o sensibilidad cuando se evalúan otras colecciones aisladas o muestras clínicas. Este polimorfismo puede afectar a la temperatura de amplificación y/o fusión de los amplicones. Por el contrario, el ensayo dirigido a CFF8240_0641 demostró ser eficaz sin posibles problemas de especificidad, lo que lo convierte en un ensayo preferencial para ser utilizado para el diagnóstico.

Este estudio también destacó los fallos de especificidad de la prueba de tolerancia a la glicina, incluso cuando se utilizan condiciones estandarizadas como el tamaño del inóculo (106 UFC/ml) y las condiciones de cultivo. Aunque todos los Cfv se identificaron correctamente mediante esta prueba fenotípica, esto identificaría erróneamente un aislado de Cff. Estudios anteriores ya informaron de la aparición de cepas de Cfv con tolerancia a la glicina (van der Graaf-Van Bloois et al., 2014, 2016a), que se adquiere a través de mutación o transducción (Chang y Ogg, 1971), así como de sensibilidad de Cff a la glicina (Wagenaar et al., 2001). Por lo tanto, esta investigación también evidencia las inconsistencias entre el análisis fenotípico y los diferentes métodos moleculares en la identificación de la subespecie C. feto.

En conclusión, este estudio describe dos ensayos de PCR-HRM en tiempo real para la identificación y diferenciación altamente específicas y sensibles de Cfv y Cff. Aunque presenta un rendimiento similar en la presente colección de cepas, el ensayo dirigido a CFF8240_0641 es potencialmente más preciso debido a posibles, aunque presumiblemente raros, polimorfismos en cepas de Cff. Es importante destacar que los ensayos tienen el potencial de ser utilizados para el análisis directo de muestras prepuciales y, por lo tanto, podrían ser una herramienta valiosa para el diagnóstico y control de BGC.

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en este estudio se incluyen en el artículo/material complementario, se pueden dirigir más consultas al autor correspondiente.

Declaración ética

No se requirió una revisión ética y aprobación para el estudio en animales porque las muestras prepuciales de bovino fueron recogidas por veterinarios certificados utilizando el método de muestreo recomendado por la OIE como parte del examen de solidez de la cría de los toros y como un servicio clínico solicitado por los propietarios a la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Lisboa. Como se recogieron muestras con fines de diagnóstico, de acuerdo con la legislación nacional y de la UE (Directiva 2010/63/UE y Decreto-ley no 113/2013), no se requirió la aprobación ética de un Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales u otra junta de ética pertinente. De acuerdo con la regulación pública del Hospital de Enseñanza Veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Lisboa, todos los procedimientos y registros clínicos y de diagnóstico pueden utilizarse con fines de enseñanza e investigación, manteniendo la confidencialidad. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones de los autores

LL-D-C y ES: conceptualización, supervisión, administración de proyectos y adquisición de fondos. MS, LL-D-C y ES: metodología y validación. MS, GP, LL-D-C y ES: análisis formal. MS: investigación y redacción: preparación del borrador original. SK, GP, LL-D-C y ES: recursos. SK, GP, LM, LL-D-C y ES: escritura: revisión y edición. MS, LM, LL-D-C y ES: visualización. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Financiación

Este estudio contó con el apoyo de Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) y Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), en el marco del proyecto PTDC/CVT-CVT/30145/2017. Este estudio también contó con el apoyo del Centro de Investigación Interdisciplinar em Sanidad Animal – CIISA (Proyecto UIDB/00276/2020, financiado por FCT) y por el Laboratorio Asociado de Ciencias Animales y Veterinarias (LA/P/0059/2020 – AL4AnimalS). ES fue financiado por FCT (DL 57/2016/CP1438/CT0001). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Agradecimientos

Reconocemos a Elena Velo-Rego y a la Agencia de Sanidad Animal y Vegetal (APHA) por proporcionar azúcar en C. fetus. Venerealis se aísla del Reino Unido. También reconocemos a J. Wagenaar, M. van Bergen, A. Burnens, S. Hum, M. Blaser y G. Gorkiewicz por proporcionar cepas de C. feto.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.969825/full#supplementary-material

Tabla complementaria 1 | Las cepas de Campylobacter feto se analizan mediante PCR en tiempo real seguida de un análisis de la gestión de recursos humanos.

Tabla suplementaria 2 | Muestras de Campylobacter spp. utilizadas para la evaluación de la especificidad de los ensayos de PCR-HRM en tiempo real.

Tabla complementaria 3 | Resultados del análisis de la gestión de recursos humanos utilizando cebadores dirigidos a CFF8240_0641 y CFF8240_1016.

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Palabras clave: Campylobacter fetus subsp. venerealis, Campylobacter fetus subsp. feto, campylobacteriosis genital bovina, PCR en tiempo real, fusión de alta resolución

Cita: Silva MF, Kienesberger S, Pereira G, Mateus L, Lopes-da-Costa L y Silva E (2022) Diagnóstico molecular de campilobacteriosis genital bovina mediante análisis de fusión de alta resolución. Frente. Microbiol. 13:969825. doi: 10.3389/fmicb.2022.969825

Editado por: Adrian Whatmore, Agencia de Sanidad Animal y Vegetal, Reino Unido

Revisado por:

Herbert Tomaso, Friedrich-Loeffler-Institute, Alemania
Birgitta Duim, Universidad de Utrecht, Países Bajos
Mohamed K. Fakhr, Universidad de Tulsa, Estados Unidos

Copyright © 2022 Silva, Kienesberger, Pereira, Mateus, Lopes-da-Costa y Silva.

*Correspondencia: Elisabete Silva, elisabetesilva@fmv.ulisboa.pt

Descargo de responsabilidad: Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo o reclamación que pueda ser fabricado por su fabricante no está garantizado ni respaldado por el editor.

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