1. Introducción

En los últimos años, ha habido un alto nivel de preocupación en todo el mundo sobre la incidencia de infecciones por trematodos transmitidos por los alimentos (FBT). Los parásitos responsables de esta infección incluyen Fasciola hepatica y F. gigantica flatworms, que representan un problema importante para los animales y los humanos (1). Tienen un ciclo de vida complejo, utilizando caracoles Lymnaeidae como huésped intermedio, portador (plantas acuáticas) y huésped mamífero final (ganado, ovejas o incluso humanos). En los seres humanos, se reconoce que esta parasitosis es una enfermedad (re)emergente en varios países que se ha propagado en estrecha asociación con las condiciones climáticas (2). Casi 80 especies de trematodos intestinales infectan a humanos y animales en todo el mundo (3, 4). Sin embargo, en América del Sur, solo se ha identificado F. hepatica en humanos y ganado (3). La fasciolosis se considera una enfermedad endémica importante en esta parte del continente americano (2, 5-7).

La fasciolosis bovina ocurre en todos los continentes excepto en la Antártida, y se estima que más de 700 millones de animales están en riesgo de infección. El costo para la agricultura y la industria de la infección por F. hepatica en el ganado se estima en más de 3 mil millones de dólares por año en todo el mundo (8, 9). Este costo no se cuantifica en gran medida a nivel nacional o regional, y se ha informado que la casualidad afecta la producción de leche y la composición de la canal, prolongando el tiempo requerido para alcanzar el peso de sacrificio (10-12). Por lo tanto, es importante desarrollar métodos para identificar las infecciones por trematodos hepáticos.

El estándar de oro para diagnosticar la infección por trematodos implica examinar los huevos fecales, que se pueden realizar a través de la concentración de éter, técnicas de sedimentación o el método Kato-Katz. En el caso de la inspección visceral, también se puede usar la presencia de gusanos en el hígado (13-16). Las infecciones por FBT generalmente se diagnostican a través de imágenes, inmunodiagnóstico y técnicas moleculares (humanos), así como métodos parasitológicos (animales). Las pruebas inmunodiagnósticas comúnmente incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas indirectas (ELISA), la hemaglutinación indirecta, la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos y las pruebas intradérmicas. Para el diagnóstico serológico, las pruebas ELISA de Fasciola utilizan diferentes antígenos para la detección de anticuerpos en humanos, ovejas y bovinos. Estos antígenos incluyen una serie de enzimas proteolíticas, como proteasas y glutatión S-transferasas, que el parásito utiliza para sobrevivir en el cuerpo huésped (17-19). Estas enzimas han sido implicadas en varios aspectos del desarrollo de helmintos (18).

Inicialmente, las pruebas serológicas utilizadas para diagnosticar la fasciolosis se basaron en un antígeno somático (SA) obtenido de trematodos adultos recolectados de los conductos biliares de las vacas en los mataderos (20). Este método fue menos específico que otras pruebas más modernas. Posteriormente, se desarrollaron pruebas ELISA para detectar anticuerpos en sueros humanos y animales, utilizando antígenos excretores-secretores (ES) de Fasciola sp. Estos antígenos, que son excretados y secretados por la platija hepática, son inmunogénicos y pueden modular las respuestas inmunes del huésped. Los métodos de prueba más recientes han utilizado antígenos recombinantes de Fasciola y se han desarrollado pruebas ELISA para detectar anticuerpos en sueros humanos y animales (21). La estandarización en la preparación de proteínas recombinantes es importante en estos casos para aumentar la producción. La producción de antígeno recombinante también es más rentable que la preparación de CE (21, 22).

En los últimos años, se ha elegido, clonado y producido una amplia gama de genes específicos de F. hepatica en varios sistemas de expresión del huésped (bacterias y levaduras) utilizando diferentes condiciones de expresión para lograr una prueba de diagnóstico ideal para la fasciolosis humana. El antígeno 2 de la proteína 2 similar a la saposina recombinante (rSAP-23) (25-26), la leucina aminopeptidasa recombinante (rLAP) (27), la glutatión S-transferasa recombinante (28, 1) y la catepsina recombinante L1 (rCL-21) (22, 29, 30) son los antígenos más inmunodominantes. Los trematodos secretan una gran familia de proteasas de cisteína (1) que incluyen catepsina L1 (CL-2), catepsina L2 (CL-3), catepsina L3 (CL-5) y catepsina L5 (CL-30) (31, <>).

El análisis proteómico de las secreciones de F. hepatica identificó las enzimas catepsina L1 como los principales componentes involucrados en la virulencia (32). Pueden escindir varios sustratos del huésped en la sangre del huésped para la alimentación del parásito, la migración a través de los tejidos del huésped, la formación de cáscaras de huevo y la excystment (30). Las proteínas de catepsina se pueden encontrar en trematodos hepáticos juveniles y adultos (18, 30). Las proteasas de catepsina L son los componentes más predominantes de los antígenos ES, que se utilizan a nivel mundial como herramientas de inmunodiagnóstico para diagnosticar infecciones por trematodos hepáticos en humanos y animales (33).

Comprender el papel de las principales proteasas involucradas en la invasión del huésped por F. hepatica es el primer paso hacia el desarrollo de pruebas de diagnóstico serológico para humanos y animales. En el caso de los seres humanos, ya se han desarrollado pruebas de inmunoensayo de flujo lateral (LFI) para la fasciolosis (33). Las pruebas ELISA y LFI utilizan proteínas F. hepatica como antígenos para identificar anticuerpos en sueros o heces humanas y animales (22, 29, 34-36). Por lo tanto, realizamos un metanálisis de la literatura utilizando los términos «antígenos (nativos y recombinantes) con potencial inmunogénico» utilizados en pruebas serológicas para identificar anticuerpos contra F. hepatica en humanos, bovinos y ovinos. Los objetivos principales fueron evaluar la calidad de los artículos seleccionados y luego realizar un metanálisis para identificar las mejores opciones de antígenos.

2. Materiales y métodos

2.1. Fuentes de información y selección de estudios

Para la revisión sistemática (RS), se utilizaron las bases de datos Google Scholar y PubMed hasta noviembre de 2022. No se impusieron restricciones en las fechas de publicación de los estudios. El gráfico 1 muestra la estrategia de búsqueda, los términos del índice y los criterios de inclusión y exclusión utilizados. También se analizaron las referencias de las publicaciones elegidas para identificar artículos adicionales. El protocolo fue incluido en el registro PROSPERO (ID:412565).

GRÁFICO 1. Estrategias de búsqueda y criterios de inclusión y exclusión aplicados en la RS de péptidos con potencial inmunogénico utilizados en ensayos serológicos para identificar anticuerpos frente a F. hepatica en humanos y rumiantes.

2.2. Evaluación de las limitaciones y posibles sesgos

Se utilizó la herramienta Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies (QUADAS) para evaluar la calidad de la publicación (38, 39). Esta herramienta contiene 14 criterios, ocho de los cuales se consideran aplicables a este estudio (ver Gráfico 2). Se incluyeron tres preguntas adicionales de la lista de verificación Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy (STARD) (40) para proporcionar información esencial al evaluar estudios y métodos epidemiológicos, como lo sugieren varios autores (38, 39). Por lo tanto, los artículos seleccionados fueron leídos y analizados utilizando la combinación de ocho criterios QUADAS y tres STARD.

GRÁFICO 2. Criterios QUADAS para evaluar la calidad de los estudios incluidos en este RS sobre péptidos o proteínas recombinantes con potencial inmunogénico utilizados en ensayos serológicos para identificar anticuerpos frente a F. hepatica en humanos y rumiantes.

Los criterios QUADAS y STARD se presentan en los gráficos 2, 3, respectivamente:

GRÁFICO 3. Criterios STARD para evaluar la calidad de los estudios incluidos en este RS sobre péptidos o proteínas recombinantes con potencial inmunogénico utilizados en ensayos serológicos para identificar anticuerpos frente a F. hepatica en humanos y rumiantes.

Para ambos análisis, las respuestas a las preguntas se clasificaron como «sí», «no» o «poco claras». El método de análisis de calidad siguió el descrito por De Oliveira et al. (38), con algunas modificaciones. En el análisis de TADAS, los estudios que cumplieron de cuatro a cinco criterios (correspondientes a 50-60% de respuestas afirmativas) se consideraron de calidad «regular» o «buena». Se utilizó un punto de corte del 75%, donde se cumplieron al menos seis criterios, para definir un estudio de «buena» calidad. Para STARD, se consideraron estudios de buena calidad que cumplieron los tres criterios STARD. Los criterios de calidad fueron aplicados independientemente por dos investigadores; los desacuerdos fueron resueltos por un tercer revisor que participó en el análisis de los criterios específicos en cuestión.

2.3. Metanálisis

Los artículos se organizaron en 13 grupos según las características de la especie huésped y del antígeno parásito para verificar la posibilidad de realizar un metanálisis. Esto incluyó seis grupos humanos: humanos que usaban proteínas secretoras excretoras de F. hepatica (Fh ES), antígenos somáticos humanos (Fh SA), ferritina recombinante humana (Fh rFtn-1), proteína asociada al tegumento humano (Fh TP16.5), saposina recombinante humana (Fh rSAP-2) y catepsina recombinante (FhrCL-1); dos grupos de bovinos: bovinos Fh ES y bovinos FhrCL-1; y cinco grupos ovinos: ovino Fh ES, ovino Fh SA, ovino Fh rCL-1, proteína recombinante de unión a ácidos grasos de oveja (Fh rFAB) y proteína recombinante glutatión S-transferasa de oveja (FhrGST). Los metanálisis se realizaron sólo si había más de dos estudios elegibles en cada grupo.

Se aplicó al metanálisis el modelo binomial bivariado de efectos aleatorios de Chu y Cole (41). La sensibilidad y la especificidad se modelaron conjuntamente con las estimaciones de cada estudio. Se asumió que variaban, pero provenían de una distribución subyacente común con una matriz de covarianza no estructurada entre los estudios (42). Todos los modelos fueron equipados sin covariables. Se utilizaron los parámetros de la característica operativa del receptor de resumen jerárquico (HSROC) para dibujar los gráficos de características operativas del receptor de resumen (SROC). El porcentaje de las ponderaciones del estudio se calculó utilizando la metodología de Burke et al. (43). Los análisis de sensibilidad se realizaron mediante la eliminación de los estudios evaluados como de baja calidad. Esto no dio lugar a cambios significativos en el patrón de los resultados obtenidos.

Al considerar el número de estudios, la heterogeneidad se evaluó mediante la inspección visual de los diagramas de bosque y los intervalos de confianza (IC) de la sensibilidad y la especificidad de los estudios primarios. Los análisis se realizaron en el programa MetaDTA (44). El gráfico 4 enumera los artículos utilizados para el metanálisis en cada grupo.

GRÁFICO 4. Artículos incluidos en el rendimiento del metanálisis en relación con la sensibilidad, la especificidad y la odds ratio diagnóstica por grupos, relacionados con las características de las especies hospedadoras y del parásito antígeno: proteínas excretoras secretoras (Fh ES) de Fasciola hepatica humana y antígeno somático de Fasciola hepatica humana (FhSA); bovinos Fh ES y Fasciola hepatica catepsina L-1 recombinante (FhrCL-1); y ovejas FhES.

3. Resultados

La primera búsqueda arrojó 1.073 de PubMed y 1.436 artículos de Google Scholar. Después de revisar los títulos, 612 estudios cumplieron con los criterios de inclusión. Estos artículos fueron analizados de acuerdo con la estrategia de búsqueda, y después de eliminar duplicados (93), quedaron 519 títulos, 249 de los cuales fueron excluidos después de la lectura del resumen, quedando 270 artículos. De estos, 169 fueron ignorados cuando discutieron F. gigantica, y otros dos estudios fueron excluidos para discutir F. magna. Treinta y tres artículos discutieron otras especies animales, y ocho publicaciones no pudieron ser accedidas en línea. De los 58 artículos de texto completo restantes evaluados para la elegibilidad, 25 fueron excluidos por no utilizar una prueba ELISA. En consecuencia, se incluyeron 33 estudios en la síntesis cualitativa y 27 artículos en el metanálisis (Figura 1).

Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de selección del estudio (37).

3.1. Evaluación de la calidad de los estudios incluidos

Veintiséis artículos cumplieron al menos seis (75%) de los ocho criterios QUADAS y se consideraron artículos de buena calidad. Seis artículos cumplieron con los criterios 4-5/8 (50-60%) y se clasificaron como estudios regulares. Sólo uno alcanzó los criterios QUADAS de 4/8, lo que sugiere que era de menor calidad.

Para STARD, sólo dos estudios cumplieron los tres criterios y se consideraron estudios de buena calidad. Quince se clasificaron como que cumplían dos criterios STARD, y 16 estudios se clasificaron como que cumplían solo un criterio STARD (Gráficos suplementarios S1, S2).

3.2. Antígeno diana del ELISA

El metanálisis consideró siete antígenos nativos y recombinantes utilizados para el diagnóstico serológico de la fasciolosis en diferentes animales, incluidos los humanos. Los estudios seleccionados mostraron que el antígeno más común utilizado en las pruebas ELISA fue FhES. Los segundos más comunes fueron la catepsina recombinante L1 y la saposina recombinante. Otras proteínas también aparecieron en esta revisión, como las SA nativas de F. hepatica, así como otros antígenos recombinantes, a saber, ferritina recombinante, proteína recombinante de unión a ácidos grasos y proteína recombinante glutatión S-transferasa.

La mayoría de los estudios se centraron en humanos (20 artículos) utilizando Fh ES, FhrCL-1 y otros antígenos. Nueve artículos discutieron los antígenos FhES para el diagnóstico serológico de la fasciolosis humana. Se han desarrollado varias pruebas dirigidas a anticuerpos contra el FhrCL-1 (n = 3) descrito anteriormente en humanos y ganado. Otras proteínas recombinantes (Fh rFtn-1, Fh rFAB y FhrGST) también se utilizaron para el diagnóstico serológico de la fasciolosis en humanos, bovinos y ovinos.

Las más altas sensibilidades y especificidades para el diagnóstico de fasciolosis se obtuvieron utilizando muestras humanas. Las pruebas serológicas ELISA que utilizaron proteínas Fh ES, Fh rCL-1, Fh SA y FhrSAP-2 dieron resultados similares para humanos, ganado vacuno y ovino. Se informaron falsos positivos para todos los antígenos (nativos y recombinantes) y no se relacionaron con ninguna infección parasitaria en particular. No se reportó reacción cruzada para ningún antígeno (nativo o recombinante) para ninguna de las especies analizadas.

3.3. Resultados del metanálisis

De los 13 grupos, sólo cinco contenían más de dos estudios que podían utilizarse para el metanálisis. Se trataba de los humanos Fh SA y Fh ES, los bovinos Fh ES y Fh rCL-1, y los ovinos FhES (cuadro suplementario S3).

Las tablas 1-5 muestran los valores de sensibilidad, especificidad y odds ratio diagnóstico (DOR) combinados en los metanálisis bivariados por grupo de papel. Para cada grupo, se presentan parcelas SROC, parcelas forestales de sensibilidad y parcelas forestales de especificidad (Figuras 2-5), excepto para los grupos Fh SA y FhrCL-1, para los cuales no se pudieron producir parcelas SROC, ya que solo contenían tres documentos cada una.

Tabla 1. Valores de sensibilidad, especificidad y odds ratio de diagnóstico combinados en el grupo de papel de metanálisis bivariados para proteínas FHES humanas.

Tabla 2. Valores de sensibilidad, especificidad y odds ratio de diagnóstico combinados en el grupo de papel de metanálisis bivariados para proteínas FHSA humanas.

Tabla 3. Valores de sensibilidad, especificidad y odds ratio de diagnóstico combinados en los metanálisis bivariados para el grupo de papel de proteínas FHES del bovino.

Tabla 4. Valores de sensibilidad, especificidad y odds ratio de diagnóstico combinados en los metanálisis bivariados para el grupo de papel de proteínas FhrCL-1 de ganado.

Tabla 5. Valores de sensibilidad, especificidad y odds ratio de diagnóstico combinados en el grupo de papel de metanálisis bivariados para proteínas FHES de ovejas.

Figura 2. Diagramas de bosque para el grupo de papel de proteínas FHES humanas. (A) Metanálisis de efectos aleatorios para el grupo de papel de proteínas excretoras secretoras humanas. El tamaño de los círculos determina el peso del estudio. (B) Sensibilidad de parcela de bosque para el grupo de papel de proteínas excretoras secretoras humanas. *Esto corresponde a un segundo enfoque de Espinosa et al. (47), en el mismo artículo, en investigación de campo. (C) Especificidad de parcela de bosque para el grupo de papel de proteínas excretoras secretoras humanas.

Figura 3. Diagramas de bosque para el grupo de papel de proteínas FhSA humanas. (A) Sensibilidad de parcela de bosque para el grupo de papel de antígenos somáticos humanos. (B) Especificidad de parcela de bosque para el grupo de papel de antígenos somáticos humanos.

Figura 4. Parcelas forestales para el grupo de papel de proteínas FhES del ganado. (A) Metanálisis de efectos aleatorios para el grupo de papel de proteínas excretoras secretoras de ganado. El tamaño de los círculos determina el peso del estudio. (B) Sensibilidad de parcela forestal para el grupo de papel excretor-secretor de ganado. (C) Especificidad de la parcela forestal para el grupo de papel de proteínas excretoras secretoras de ganado.

 

3.3.1. Exactitud diagnóstica de los antígenos seleccionados en el metanálisis

Se incluyeron diez estudios para el grupo de proteína FHES humana (Figuras 2B, C). Las estimaciones de sensibilidad para el grupo de CE Fhfueron altas y similares en todos los artículos analizados (0,968), y los valores de IC del 2,5% y (97,5%) fueron 0,931 y 0,985, respectivamente. Para las estimaciones de especificidad, el IC del 2,5% y el IC del 97,5% fueron 0,989, 0,959 y 0,997, respectivamente. La Tabla 1 muestra el DOR. Dos estudios del grupo de antígeno FHES humano mostraron una sensibilidad y especificidad del 100% con la prueba ELISA. Todos los artículos que discutieron las pruebas de antígeno FHES y ELISA mostraron un alto nivel de sensibilidad, y cuatro artículos tuvieron una sensibilidad del 100%. En un artículo, la especificidad fue inferior al 90%. Cuatro estudios mostraron una especificidad del 100% cuando se utilizó el antígeno FhES para el diagnóstico sérico de F. hepatica en humanos (Figuras 2B, C). El Índice de Verosimilitud sumario positivo estimado para este grupo fue de 88.000, que se sitúa como el valor más alto entre los antígenos analizados en el metanálisis (Tabla 1).

La Figura 2 resume la precisión diagnóstica general del grupo de proteínas FHES humanas. La curva HSROC tenía una forma curvilínea (Figura 2A), lo que indica similitud entre los artículos incluidos en el metanálisis, con círculos que muestran un formato similar. El punto SROC se encuentra cerca de la esquina superior izquierda de la curva.

Para el grupo de proteína FhSA humana (FHSA humana), se incluyeron tres estudios en el metanálisis (Figura 3). En este caso, no se produjeron parcelas SROC. Las estimaciones de sensibilidad para el grupo humano de FHSA fueron 0,991, y los valores de IC del 2,5% y del IC del 97,5% fueron 0,938 y 0,999, respectivamente. Los valores de IC 2,5% e IC 97,5% para las estimaciones de especificidad fueron 0,965, 0,928 y 0,983, respectivamente. El DOR se muestra en la Tabla 2. Entre los estudios incluidos en el análisis, los grupos centrados en la proteína FhSA humana y la proteína FhrCL-1 del ganado exhibieron los valores de razón de verosimilitud resumidos negativos más mínimos, lo que sugiere una probabilidad favorable de diagnóstico negativo preciso (Tablas 2, 4).

Se incluyeron seis estudios en el grupo de proteína FHES del ganado bovino (Figuras 4B, C). La Figura 4A proporciona una visión general de la precisión diagnóstica general del grupo de proteínas FEES del ganado. La curva HSROC resumida no fue curvilínea, lo que sugiere una distribución heterogénea entre los artículos. Los círculos muestran un formato similar. Las estimaciones de sensibilidad para el grupo de CE Fhdel ganado bovino fueron 0,977, y los valores de IC 2,5% e IC 97,5% fueron 0,844 y 0,997, respectivamente. Los valores de IC 2,5% e IC 97,5% para las estimaciones de especificidad fueron 0,956, 0,806 y 0,991, respectivamente. Dos artículos que utilizaron el antígeno FhES para el diagnóstico sérico de F. hepatica en bovinos mostraron una sensibilidad del 100%, y la especificidad varió entre 85 y 99% (Figuras 4B, C). Cuatro estudios presentaron más variación en la sensibilidad y la especificidad. La Tabla 3 muestra el DOR. El grupo de proteína FhES del ganado bovino demostró valores positivos y negativos de razón de verosimilitud resumida de 22.200 y 0.020, respectivamente (Tabla 3).

Se incluyeron tres estudios (Figura 5) para el grupo de proteína FhrCL-1 del ganado. En este caso, no se produjeron curvas ROC. La estimación de sensibilidad para el grupo FhrCL-1 fue de 0,991, y los valores de IC del 2,5% y del IC del 97,5% fueron 0,925 y 0,999, respectivamente. Para la estimación de la especificidad, los valores de IC 2,5% e IC 97,5% fueron 0,973, 0,871 y 0,995, respectivamente. DOR se puede observar en la Tabla 4.

Se incluyeron siete estudios para el grupo de proteína FHES de ovejas (Figuras 6B, C); la precisión diagnóstica general se resume en la Figura 6A. La curva HSROC resumida fue curvilínea, lo que sugiere una distribución homogénea entre los artículos en el metanálisis, con círculos que muestran formatos similares. Las estimaciones de sensibilidad para el grupo de CE Fhfueron 0,982, y los valores de IC del 2,5% y del IC del 97,5% fueron 0,925 y 0,996, respectivamente. Los valores de IC 2,5% e IC 97,5% para las estimaciones de especificidad fueron 0,981, 0,639 y 0,999, respectivamente. La Tabla 5 muestra el DOR. De acuerdo con los resultados del DOR, los artículos que utilizaron antígenos FhES para el diagnóstico serológico de la fasciolosis en ovejas mostraron resultados similares a los de otras especies. La Tabla 5 presenta los valores positivos y negativos del cociente de verosimilitud como 51.680 y 0.020, respectivamente, enfatizando aún más la elevada precisión del antígeno.

Figura 6. Parcelas forestales para el grupo de papel de proteínas FhES de oveja. (A) Metanálisis de efectos aleatorios para el grupo de papel de proteínas excretoras secretoras de ovejas. El tamaño de los círculos determina el peso del estudio. (B) Sensibilidad de parcela de bosque para el grupo de papel de proteínas excretoras-secretoras de ovejas. *Esto corresponde a un segundo enfoque de Mezo et al. (60), en el mismo artículo, en la investigación de campo. (C) Especificidad de la parcela de bosque para el grupo de papel de proteínas excretoras-secretoras de ovejas.

Dentro de los cinco grupos seleccionados, los antígenos ES de F. hepatica fueron los más ampliamente estudiados. A pesar de que el grupo de FHES de ovejas tuvo solo un estudio y la especificidad más baja, los resultados generales fueron buenos. Este grupo mostró una gran variación en términos de especificidad. El grupo de ovejas FhES presentó resultados similares entre estudios que otras especies.

En general, los artículos revisados dieron resultados consistentes, con algunos estudios que indican similitudes entre las pruebas serológicas de ELISA utilizando diferentes antígenos y la detección coprológica de huevos de F. hepatica en heces humanas, bovinas y ovínas. Entre los antígenos analizados, el ganado vacuno FhrCL-1 exhibió resultados homogéneos, con buena precisión para el diagnóstico serológico de fasciolosis mediante pruebas ELISA. Otros antígenos nativos incluidos en el metanálisis fueron el grupo de antígeno FhSA humano, que mostró una baja variación en sensibilidad y especificidad en comparación con la identificación de huevos de F. hepatica en heces humanas y de ganado. Para el grupo de antígeno FHES de ovejas, el metanálisis de efectos aleatorios fue más heterogéneo que otros grupos de antígenos nativos y recombinantes. Con base en los resultados del DOR, los estudios que utilizaron FHES en humanos y bovinos como antígenos para el diagnóstico serológico de la fasciolosis en humanos, bovinos y ovinos mostraron buenos resultados en comparación con la detección coprológica de los huevos de F. hepatica en las heces.

4. Discusión

Hasta donde sabemos, este es el primer metanálisis basado en el diagnóstico serológico de la fasciolosis hepática en humanos, vacas y ovejas. Se incluyeron treinta y tres estudios y se realizó un metanálisis en 27 de ellos. En general, los estudios fueron de calidad metodológica moderada y clínicamente heterogéneos. Todos los estudios analizados en este metanálisis utilizaron muestras de suero de ganado y fasciolosis confirmada a través del análisis fecal, que se considera la prueba estándar de oro para diagnosticar esta enfermedad. En general, los antígenos Fh rCL-1, Fh ES y FhSAP-2 presentaron los mejores resultados de sensibilidad y especificidad para el diagnóstico sérico de la fasciolosis animal y humana. La calidad de los artículos se evaluó en base a los criterios descritos en QUADAS o STARD. Estos criterios abarcaron la caracterización de las muestras, el tiempo transcurrido entre el estándar de referencia y la prueba índice, y las características demográficas de la población animal en estudio. Después de evaluar los resultados, se encontró que ninguno de los artículos cumplió con todos los criterios QUADAS y STARD.

La fasciolosis es una enfermedad tropical desatendida diagnosticada a través de métodos coprología y serológicos (1). Se utilizó un gran número de antígenos (tanto nativos como recombinantes) en las pruebas ELISA descritas en los artículos. Entre los artículos incluidos en el metanálisis se estudió el grupo de antígenos FHES humanos. FhLas CE se han empleado para diagnosticar la fasciolosis humana y bovina en las pruebas ELISA y han demostrado ser altamente efectivas (47-50). FhLos antígenos ES desempeñan un papel en ayudar a la migración del parásito a través del tejido del huésped. Por lo tanto, las inmunoglobulinas para este antígeno se pueden detectar en la infección temprana por F. hepatica (21, 24, 36). Las pruebas serológicas para el diagnóstico de la fasciolosis humana mostraron una buena eficacia cuando se detectaron anticuerpos humanos y animales para F. hepatica utilizando el antígeno FhES en las pruebas ELISA. Sin embargo, la purificación de la cisteína proteinasa es un proceso complejo y lento (18, 22, 34) que puede dificultar la producción de una prueba ELISA comercial.

4.1. Antígeno nativo de Fasciola hepatica

Las preparaciones antigénicas utilizadas en este estudio, incluido el grupo de proteínas FhSA humanas, se obtuvieron principalmente de extractos de gusanos adultos y productos de excreción, así como fracciones parcialmente purificadas (51-53). Los ensayos de detección de anticuerpos fueron preferidos para el diagnóstico inmune de fasciolosis (27, 29) debido a su relativa simplicidad y seroconversión temprana durante las infecciones primarias (3). Dado que F. hepatica es la principal causa de fasciolosis humana y animal, la mayoría de los estudios que investigaron el diagnóstico de esta enfermedad se centraron en subunidades purificadas de antígenos Fh SA o FhES específicos de esta especie de trematodos (27, 51, 54). Para los grupos de antígenos humanos (Fh SA y FhES), solo tres artículos proporcionan una caracterización exhaustiva de la población de estudio (46, 47, 52). La mayoría de los artículos que investigan los antígenos Fh SA y FhES en humanos utilizan muestras de hospitales (23-25, 27, 48-51, 53). Como resultado, es difícil determinar el momento de la infección, pero es probable que se trate de infecciones crónicas. Sólo un artículo menciona la detección de infección aguda por F. hepatica (47).

Se incluyeron seis estudios en el metanálisis que evaluó el grupo de proteína FHES del ganado. Los productos excretores-secretores (ESP) son los antígenos que se usaron más comúnmente junto con los métodos ELISA para la detección de anticuerpos. Se sabe que los antígenos FhES de F. hepatica utilizados en las pruebas ELISA son inmunodominantes en bovinos expuestos naturalmente a la infección por F. hepatica (3, 35, 57). Los antígenos nativos de F. hepatica pueden recogerse en mataderos bovinos y utilizarse en el laboratorio para pruebas ELISA. Este metanálisis está en línea con estudios previos, que mostraron que un grupo de proteína FHES del ganado juega un papel valioso en un sistema ELISA para el serodiagnóstico de la fasciolosis bovina (22, 54, 55). Sobre la base del grupo de antígenos FHES del bovino, se han utilizado pruebas ELISA para detectar infecciones experimentales en bovinos de la tercera a la quinta semana después de la infección (22, 35, 56). Sin embargo, aunque estos estudios tienen buenos diseños experimentales, están limitados por la falta de información clínica y epidemiológica sobre los animales. Para el grupo de papel de proteínas FhES del ganado, un artículo tuvo una buena caracterización de la muestra (22). Se seleccionaron artículos con infecciones naturales y experimentales en bovinos. Se utilizaron aproximadamente 100 metacercarias en estudios experimentales de infección en ganado (22, 35, 56). En artículos con infecciones experimentales, la detección de anticuerpos ocurrió entre 2 y 4 semanas después de la infección (22, 56).

Para el grupo de ovejas FhSA, sólo se seleccionaron dos artículos y no se realizó un metanálisis. Estos trabajos informaron una sensibilidad del 80% y una especificidad del 90% (59, 60), que fue relativamente baja en comparación con otros antígenos (21, 24, 25). Otro estudio que utilizó FhSA como antígeno en una prueba ELISA informó una sensibilidad y especificidad cercanas al 100% (20). El uso de los antígenos nativos Fh SA y FhES para pruebas de laboratorio de diagnóstico de rutina presenta algunos desafíos, incluida la dependencia de la disponibilidad de trematodos vivos y el hecho de que es una mezcla de antígenos sujeta a variaciones debido a condiciones naturales (24, 25). Sin embargo, los laboratorios pueden obtener antígenos recombinantes, y se ha demostrado que grandes cantidades de antígenos recombinantes de F. hepatica altamente puros con plegamiento correcto juegan un papel vital en la mejora de la antigenicidad y la precisión de los métodos de serodiagnóstico (22, 24, 25, 36). Para las proteínas FhES de las ovejas, se encontraron artículos sobre infecciones naturales y experimentales. Las muestras se obtuvieron de granjas y mataderos (57-59). Sin embargo, ninguno de los estudios proporcionó una caracterización exhaustiva de la muestra. En los artículos con infecciones experimentales, la detección de anticuerpos ocurrió entre 1 y 3 semanas después de la infección (60). Las ovejas fueron los huéspedes donde el anticuerpo se identificó más temprano (36, 60).

4.2. Antígeno recombinante de Fasciola hepatica

En términos de grupos humanos que usaron el antígeno FhrFtn-1, solo se seleccionó un artículo. En este trabajo, la sensibilidad y la especificidad fueron cercanas al 100% (61). FhrFtn-1 se expresa durante el desarrollo del parásito y se ha demostrado que es altamente reactivo con sueros de animales de experimentación con infecciones agudas o crónicas. Sin embargo, es importante destacar que el antígeno FhrFtn-1 presentó reactividad cruzada para otros parásitos (61), comprometiendo así la efectividad de la prueba ELISA.

El antígeno FhrGST tiene altos títulos de anticuerpos durante las infecciones activas de ovejas, lo que indica que estas moléculas están expuestas repetida y eficazmente al sistema inmune del huésped. Se puede observar reactividad cruzada entre fasciolosis y equinococosis con los antígenos Fh rGST y FhrFAB utilizados en las pruebas ELISA (28); se necesitan resultados y ajustes consistentes para la prueba ELISA utilizando los antígenos Fh rGST y FhrFAB para su comercialización.

El grupo humano que utilizó FhrTP 16.5, un pequeño antígeno del tegumento de F. hepatica expresado en bacterias, mostró una sensibilidad y especificidad cercanas al 90% (61). La superficie tegumental de F. hepatica es una estructura sincitial única que sirve como interfaz entre el parásito y el huésped. Los antígenos FhrTP se liberan fácilmente para estimular la respuesta inmune del huésped y, por lo tanto, se consideran antígenos de diagnóstico (3, 61). El antígeno FhrTP se encuentra en la superficie del parásito y tiene reactividad cruzada con otros parásitos (62), comprometiendo la calidad de las pruebas ELISA. Además, los métodos parasitológicos actuales dependen de la experiencia del técnico, ya que los huevos de F. hepatica pueden confundirse con los de otros helmintos (4, 13).

Entre los antígenos de subunidades, la catepsina-L, un componente de los antígenos de Fasciola ES, atrajo una atención significativa. Las pruebas serológicas han demostrado que son altamente precisos en el diagnóstico de la fasciolosis humana, bovina y ovina. La prueba de catepsina L1 recombinante utiliza procatepsina L1 recombinante y se dirige a anticuerpos contra la catepsina, una proteasa de cisteína, para diagnosticar la fasciolosis causada por F. hepatica. Del mismo modo, otros estudios no han encontrado reacciones cruzadas en las pruebas ELISA basadas en catepsina (21) y han reportado un buen rendimiento. La prueba ELISA arrojó mejores resultados con FhES, un antígeno nativo recolectado de F. hepatica obtenido en un matadero bovino. El segundo antígeno más importante utilizado en las pruebas ELISA fue FhrCL-1, un antígeno recombinante expresado en bacterias y levaduras. Un artículo tuvo una buena caracterización de la muestra para el grupo de papel de proteína FhrCL-1 del ganado (22). En la infección experimental en bovinos, se identificaron anticuerpos contra F. hepatica 3 semanas después de la infección (22, 36).

Sólo se seleccionaron dos artículos para grupos humanos que utilizaron FhrSAP-2, por lo que fue imposible realizar un metanálisis. Estos antígenos se expresan en E. coli (24, 25). Los artículos que utilizaron el antígeno FhrSAP-2 para el diagnóstico sérico de F. hepatica en humanos mostraron una sensibilidad del 100% y una especificidad superior al 95% (24, 25). Estudios previos también han demostrado que FhrSAP-2 es altamente inmunogénico y puede detectar la fase aguda de la fasciolosis (24, 25, 28). En ovejas FhrCL-1, se seleccionaron dos estudios y no se realizó ningún metanálisis. La sensibilidad y la especificidad fueron muy altas para FhrCL-1 (28, 29). El análisis de diferentes métodos de clonación y variaciones de purificación ha demostrado diversos niveles de sensibilidad, especificidad y precisión en las pruebas de diagnóstico. Para el último grupo humano que utilizó FhrCL-1, solo se seleccionaron dos artículos y no se realizó un metanálisis (21, 24); En estos artículos, la sensibilidad y la especificidad fueron cercanas al 100%. El antígeno FhrCL-1 se localiza en proteínas excretoras y secretoras y no tiene reactividad cruzada con otros parásitos (21, 24). Una buena prueba diagnóstica debe distinguir entre F. hepatica y otras enfermedades parasitarias.

Nueve de los 33 estudios analizados utilizaron antígenos recombinantes en la prueba ELISA. Losantígenos Fh rCL-1, Fh ES y FhrSAP-2 dieron los mejores resultados, con altos valores de sensibilidad y especificidad para el serodiagnóstico de fasciolosis en humanos y animales. El antígeno recombinante se puede utilizar en pruebas ELISA para muestras de leche no invasivas o a granel para estudios epidemiológicos. Los estudios serológicos son ahora el principal método de diagnóstico en uso, lo que permite el diagnóstico de la enfermedad incluso durante la etapa aguda y antes de que los huevos del parásito puedan identificarse en las heces. La serología tiene la ventaja de identificar infecciones mucho antes que la identificación del huevo fecal (alrededor de 4-5 semanas) (21, 25, 29). Los métodos serológicos, especialmente la prueba ELISA, son altamente sensibles y específicos en comparación con el diagnóstico de F. hepatica por métodos coprológicos (25, 27, 29). Las proteínas recombinantes permiten un mayor cribado masivo, facilitando el serodiagnóstico de fasciolosis en humanos y animales.

Nuestro metanálisis ha demostrado que los anticuerpos tempranos contra F. hepatica se pueden detectar tanto en animales como en humanos. Esta detección temprana es posible gracias al uso de antígenos nativos y recombinantes en pruebas ELISA (21, 22, 51, 54, 58). Sin embargo, los estudios incluidos en el metanálisis no distinguieron adecuadamente entre las infecciones por fasciolosis agudas y crónicas. A pesar de esto, los resultados obtenidos indicaron altos valores de sensibilidad y especificidad para varios antígenos tanto en animales como en humanos. Al emplear estos antígenos en las pruebas ELISA, es posible identificar con precisión los anticuerpos contra F. hepatica, reduciendo así la aparición de falsos positivos o falsos negativos. Sin embargo, a pesar de los hallazgos prometedores del metanálisis, la disponibilidad de antígenos en forma de pruebas ELISA para la identificación sistemática de fasciolosis en animales y humanos sigue siendo limitada (36, 47, 49). Actualmente, solo un pequeño número de antígenos nativos y recombinantes son comercialmente accesibles en forma de pruebas ELISA para uso generalizado (22, 47, 51, 52).

Nuestro estudio tiene algunas limitaciones que deben abordarse. En primer lugar, el número de estudios incluidos en el metanálisis es relativamente pequeño, lo que restringe la capacidad de realizar análisis de subgrupos relevantes, como la edad y el momento de la infección. Esta limitación es causada por la falta de datos consistentes encontrados en la literatura disponible. Sin embargo, esta limitación destaca la importancia de una mayor investigación en la literatura para recopilar más datos, con el objetivo de proporcionar evidencia científica de alta calidad para la incorporación de estas pruebas en la detección de enfermedades y el diagnóstico temprano. A pesar de estas limitaciones, es crucial reconocer la robustez y baja heterogeneidad de los datos obtenidos en nuestro estudio. Estos factores nos han permitido extraer conclusiones sólidas de los resultados que hemos obtenido hasta ahora. La investigación futura con un grupo de estudios más grande y diverso será valiosa para ampliar y corroborar nuestros hallazgos.

5. Conclusión

Los resultados del metanálisis mostraron ocho tipos de antígenos para el diagnóstico sérico de fasciolosis en humanos, vacas y ovejas. La mayoría de los artículos analizados utilizaron antígenos ES en humanos. Por lo tanto, se sugiere que Fh rCL-1, Fh ES y FhrSAP-2 podrían considerarse antígenos diagnósticos ideales para el diagnóstico sérico más temprano de la fasciolosis humana y animal. Se recomiendan estudios futuros con antígenos de F. hepatica para el diagnóstico serológico en otras especies animales y la necesidad de que la literatura incluya estudios más robustos y bien caracterizados.

Contribuciones del autor

GD: conceptualización, metodología y redacción de manuscritos. TV: conceptualización, metodología, redacción y revisión de manuscritos. VB: curación de datos, metaanálisis y revisión de manuscritos. MP: metaanálisis y revisión de manuscritos. JR y LM: revisión de manuscritos. FF: redacción, revisión y edición de manuscritos. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión presentada.

Reconocimientos

Los autores desean agradecer a la Fundação Osvaldo Cruz (FIOCRUZ–PR), a la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) y al Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) por la posibilidad de desarrollar esta investigación.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

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Material complementario

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Referencias