Introducción

Todavía no se han establecido regímenes de alimentación óptimos para pacientes hospitalizados tanto veterinarios como humanos. La subalimentación es común durante la hospitalización y se asocia con inmunidad deprimida, aumento de las tasas de reingreso y aumento de la mortalidad (1-4). Sin embargo, también se ha demostrado que la sobrealimentación de pacientes en estado crítico tiene efectos nocivos (5-7). En particular, la hiperglucemia iatrogénica puede provocar un deterioro de la cicatrización de heridas, disfunción neuronal, aumento de la producción de las citocinas inflamatorias interleucina-6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral α (TNF-α), inhibición de la función leucocitaria, vasculitis y, en última instancia, un peor resultado clínico (8-13). Algunos de estos efectos pueden anularse cuando se normaliza la glucosa en sangre (9, 14). Por lo tanto, mientras que los médicos quieren proporcionar una nutrición adecuada a los pacientes hospitalizados, deben establecer los mejores medios para hacerlo, evitando al mismo tiempo la hiperglucemia.

Un régimen de alimentación potencialmente efectivo para lograr estos objetivos agnósticos es el ayuno intermitente. El ayuno intermitente es el proceso de reducir la frecuencia de las comidas con el fin de prolongar el período de ayuno entre comidas, pero sin restringir necesariamente la ingesta calórica total cuando se expresa durante un período de tiempo más largo. Se ha descubierto que extender el período de ayuno entre comidas aumenta la sensibilidad a la insulina, reduce la fructosamina sérica, reduce la proliferación de células cancerosas, reduce las concentraciones de citocinas proinflamatorias IL-6, IL-1β y TNF-α en circulación, retrasa el envejecimiento y mejora la reparación neuronal después de una lesión en comparación con la alimentación continua (15-25). En ratones sanos, las concentraciones de glucosa e insulina en sangre se redujeron después de un período de ayuno intermitente (21). Se han propuesto varios mecanismos, incluida la reducción de las especies reactivas de oxígeno derivadas de las mitocondrias, la activación de las sirtuinas y la promoción asociada de la autofagia y la limpieza celular, y la disminución de la expresión de la proteína quinasa activada por mitógenos p38, un mediador de la apoptosis (18, 26-28). Estos mecanismos potenciales permitirían una reducción del estrés oxidativo y una respuesta de reparación más personalizada después de una lesión.

Un régimen de ayuno intermitente es de particular interés en pacientes con enfermedad de la columna vertebral, ya que se ha demostrado que reduce el tamaño de la lesión y mejora la recuperación en modelos de lesiones de la columna vertebral en roedores en comparación con la alimentación diaria (21-23). Las cetonas, que aumentan durante el período de ayuno, regulan al alza la sirtuina 3 dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y la superóxido dismutasa, aumentan la expresión de la proteína promotora de la autofagia O3a y reducen la lesión neuronal en la corteza cerebral de las ratas después de la hipoglucemia inducida experimentalmente (29, 30). Además, la grelina, un péptido orexigénico secretado por el estómago en ayunas, protege a las neuronas de la isquemia y la lesión por reperfusión in vivo, y disminuye la expresión del TNF-α y la IL-1β de las células microgliales en cultivos de células neuronales mesencefálicas modeladas con Parkinson (31, 32). Por lo tanto, el ayuno intermitente puede ser una estrategia de alimentación que promueve la recuperación neuronal y, al mismo tiempo, evita la hiperglucemia.⁺

Aunque el ayuno intermitente tiene muchos beneficios potenciales, también hay posibles consecuencias perjudiciales. Se sabe que las funciones inmunes humorales y celulares disminuyen en un estado de ayuno, lo que es en parte el resultado de una caída en la adipoquina plasmática, la leptina (33, 34). La leptina aumenta la quimiotaxis de los neutrófilos y la fagocitosis de los macrófagos, y afecta a la maduración de las células T (35). El ayuno a corto plazo en varias especies reduce las respuestas mediadas por células T y el número de células inmunitarias esplénicas y periféricas (17, 36, 37). La inyección de leptina en ratones ob/ob en ayunas o deficientes en leptina revierte la supresión de la diferenciación de linfocitos, la fagocitosis de los macrófagos y las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado causadas por la deficiencia de leptina (34, 38, 39). Sin embargo, las ratas que consumen una dieta alta en grasas atenúan la caída de leptina durante el ayuno y aumentan la producción de cetonas entre comidas (40, 41). Además, la alimentación con triglicéridos de cadena media (MCT) promueve la formación de cetonas en el estado alimentado (42, 43). Después de comer, la mayoría de los ácidos grasos de cadena media se absorben a través de la circulación portal y son metabolizados por los hepatocitos en cetonas (44, 45). Por lo tanto, alimentar con una dieta alta en grasas enriquecida con MCT puede tener el doble beneficio de mantener la concentración sérica de leptina y, al mismo tiempo, promover la cetogénesis durante los cortos períodos de ayuno. Por lo tanto, el ayuno intermitente con una dieta alta en grasas enriquecida con MCT puede ser preferible.

El objetivo principal de este estudio fue determinar los efectos metabólicos e inmunológicos de un régimen de ayuno intermitente de 48 h en perros sanos. Nuestra hipótesis principal era que los perros sometidos a ayuno intermitente tendrían concentraciones plasmáticas más altas de β-hidroxibutirato y grelina, y concentraciones más bajas de glucosa, insulina y leptina en comparación con los perros alimentados diariamente. Nuestra hipótesis secundaria fue que los perros sometidos a un régimen de ayuno intermitente con una dieta alta en grasas enriquecida con triglicéridos de cadena media tendrían mayores concentraciones de β-hidroxibutirato y leptina en sangre en comparación con los perros que ayunaban intermitentemente con una dieta baja en grasas.

Materiales y métodos

Animales

Después de un examen físico completo, se utilizaron 10 perros adultos sanos de la Unidad de Nutrición Canina de la Universidad de Massey en este estudio. Los perros eran de dos razas: Harrier Hounds (n = 7) y New Zealand Huntaways (n = 3), y estaban compuestos por cuatro machos castrados y seis hembras espiadas. Los perros tenían una edad media de 7,1 (DE 2,1) años, un peso corporal medio de 27,8 (DE 3,1) kilogramos y una puntuación media de condición corporal (BCS) de 4,2 (DE 0,4). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Massey (MUAEC #16/130).

Diseño del estudio

Una semana antes del comienzo del estudio, todos los perros fueron sometidos a una dieta seca comercial alta en carbohidratos y baja en grasas para permitir la aclimatación. Los perros fueron alimentados para satisfacer sus necesidades energéticas de mantenimiento basándose en los datos históricos de la colonia. Después de este período de aclimatación, los perros fueron asignados al azar en uno de los tres grupos que se sometieron a cada régimen de prueba de alimentación en un diseño de 3 × 3 cuadrados latinos con una duración de «lavado» de una semana en el medio. Los tres regímenes de alimentación fueron los siguientes: (1) alimentación diaria con una dieta baja en grasas (LF) y alta en carbohidratos (BID), (2) ayuno intermitente (alimentación una vez cada 48 h) con la misma dieta LF (IF LF) y (3) ayuno intermitente (alimentación una vez cada 48 h) con una dieta alta en grasas (HF). Ambas dietas utilizadas en este estudio fueron formuladas para cumplir con los requisitos nutricionales para perros adultos definidos por la Asociación Estadounidense de Funcionarios de Control de Alimentos (AAFCO). Un alimento seco comercial¹ fue elegida como la dieta baja en grasas y alta en carbohidratos. La dieta alta en grasas se creó utilizando la misma dieta comercial seca con la adición de proteína de suero de leche en polvo, sebo de res, aceite de girasol, aceite de coco y una mezcla multivitamínica / mineral² para asegurar la suficiencia de la dieta total. La cantidad total de triglicéridos de cadena media (C8, C10, C12) del aceite de coco y del sebo de vacuno ascendió al 14,7% de las calorías totales de la dieta cuando se utilizó una energía de 6,8 kcal/gramo para los MCT (46). Los perfiles nutricionales de ambas dietas se presentan en la Tabla 1.

Cuando los perros estaban en el régimen de alimentación diaria, se les ofrecía su requerimiento de energía de mantenimiento dividido en partes iguales en dos comidas que se proporcionaban por la mañana y por la tarde. Cuando los perros estaban en el régimen de ayuno intermitente, se les ofreció el doble de su requerimiento de energía de mantenimiento por la mañana cada dos días. A los perros se les permitió hasta 3 h para consumir su comida, después de lo cual se retiró la comida y se pesó. Durante el período de lavado entre los regímenes de alimentación, todos los perros fueron colocados en la dieta seca comercial alta en carbohidratos y baja en grasas y alimentados dos veces al día durante 1 semana.

En los días 1, 3, 5 y 7 de un período de prueba, se recolectó una muestra de sangre en ayunas (12 ml en total) en heparina de litio y vacutainers rojos simples³ de todos los perros por venopunción yugular antes de que se les ofreciera comida. El día 1 representó una muestra basal en ayunas nocturnas, mientras que las muestras recolectadas en los días 3, 5 y 7 representaron un ayuno de 12 horas cuando los perros comían diariamente o un ayuno de 48 horas cuando los perros ayunaban intermitentemente. Inmediatamente después de la extracción de sangre, un inhibidor de la proteasa⁴ se añadió a la muestra en el vacutainer rojo liso para evitar la degradación de la grelina. Todas las muestras se colocaron en hielo hasta que se centrifugaron y se extrajeron el suero y el plasma. Se registró la ingesta diaria de alimentos, el peso corporal semanal y la puntuación de la condición corporal de todos los perros. Para comparar la ingesta calórica de los perros en los diferentes regímenes de alimentación, el total de calorías ingeridas cada 2 días (es decir, días 1 y 2, días 3 y 4, días 5 y 6) se dividió por el peso inicial semanal de cada perro a la potencia de 0,75 para expresar la ingesta como kcal por 48 h/kgBWT^0.75. Además, se midió la actividad diurna (de 5 a 20 horas) y nocturna (de 20 a 5 horas) de los perros mediante un acelerómetro triaxial⁵ ajustado a su cuello.

Después de la toma de muestras de sangre en el día 7, todos los perros fueron colocados en el régimen de alimentación de «lavado». Después de un lavado, cada grupo fue alimentado de acuerdo con su siguiente régimen de alimentación asignado, y se tomaron muestras de sangre como se describió anteriormente. Esto se repitió una vez más, de modo que todos los grupos se sometieron a cada uno de los tres regímenes de alimentación diferentes con un período de lavado en el medio.

β-hidroxibutirato, glucosa y metabolómica

Dentro de 1 h después de la recolección, se recolectó plasma de los vacutainers de heparina después de la centrifugación durante 10 min a 3,000 rcf a 4 °C. La glucosa plasmática se analizó con un glucómetro de mano⁶ que ha sido previamente validado para su uso en perros (47). El plasma restante se almacenó a -80 °C hasta su posterior análisis.

El β-hidroxibutirato se analizó en muestras de plasma de los días 3, 5 y 7 de cada régimen mediante un ensayo colorimétrico⁷ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de plasma descongeladas se desproteinaron inicialmente utilizando columnas de centrifugación de 10 kD⁸ y centrifugado a 10.000 rcf durante 10 min. A continuación, se prepararon las muestras y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas⁹.

La resonancia magnética nuclear (RMN) se utilizó para la metabolómica plasmática. Las muestras se prepararon con base en el protocolo descrito en un estudio previo (48). Brevemente, se desproteinaron 300 μL de plasma con 600 μL de metanol y se incubaron a -20 °C durante 30 min. A continuación, las muestras se centrifugaron a 13.400 rcf durante 30 min y el sobrenadante se retiró y se colocó en un evaporador rotativo durante 3,5 h a 20°C. Cualquier sobrenadante restante en las muestras se secó completamente mediante liofilización. A continuación, las muestras secas se almacenaron en viales con tapa de rosca¹⁰ a -80 °C hasta el análisis. El día del análisis, se preparó una solución tampón fosfato disolviendo 928,6 mg de NaH anhidro₂P0₄ y 320,9 mg de Na anhidro₂HPO₄ en 100 g de D₂0, y se utiliza con una modificación adicional del pH. Las muestras secas se reconstituyeron utilizando 600 μL de D tamponado con fosfato₂O, junto con dos patrones [0,5 mM de sal sódica de 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato (DSS)¹¹ y 5 mM de imidazol¹²] para permitir ajustes en los cambios químicos y el pH. A continuación, las muestras se transfirieron a tubos de RMN de 5 mm¹³ y se analizó utilizando un espectrómetro Bruker Avance de 700 MHz equipado con cyroprobe (Bruker Biospin, Rheinstetten, Alemania) que opera a 700,13 MHz. Las muestras se midieron a 25 °C utilizando una secuencia de pulsos 1D NOESY estándar con presaturación de la señal de agua residual. Los espectros se registraron utilizando 58k puntos y un tiempo de adquisición de 3,5 s, seguido de un retardo de relajación de 1,5 s. ¹Espectros de RMN H. La fase y la corrección de la línea de base de todos los espectros de RMN se verificaron manualmente.

Endocrinología

Los vacutainers rojos simples se centrifugaron durante 10 min a 3.000 rcf a 4 °C y se extrajeron el suero dentro de 1 h después de la recolección. El suero se almacenó a -80° C hasta el análisis. La leptina, la grelina y la insulina se analizaron mediante un inmunoensayo multiplex comercial¹⁴. Las muestras se prepararon siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 50 μL de suero a una placa de 96 pocillos a la que se añadió un tampón y perlas conjugadas con anticuerpos. Las placas se agitaron suavemente durante la noche a 4 °C. A continuación, se lavaron las placas, se añadieron anticuerpos de detección y, finalmente, se analizaron mediante un lector multiplex¹⁵.

Ensayos inmunológicos

La sangre entera de los vacutainers de litio se utilizó dentro de una hora después de la recolección. La fagocitosis leucocitaria y el estallido respiratorio se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un analizador celular¹⁶ y marcadores fluorescentes para fagocitosis¹⁷ y estallido oxidativo¹⁸. Se utilizó un protocolo modificado que se basó en trabajos publicados previamente (49, 50). Se prepararon cuatro tubos de citometría de flujo para cada muestra. En cada tubo, se incubaron 100 μl de sangre total a 37 °C durante 30 min con 10 μl de solución de DHR de 143 μM, 50 μl de pHrodo™, ambos compuestos o nada añadido. Después de la incubación, se añadieron 2,7 mL de agua desionizada para lisar los eritrocitos. A los 2 minutos de añadir el agua desionizada, se añadieron 300 μL de PBS 10X y las muestras se centrifugaron a 600 rcf durante 7 min. El sobrenadante se decantó y se repitió el proceso con 3 mL de PBS. A continuación, se añadió formaldehído al 3% en PBS y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min para su fijación. Finalmente, se añadieron 2 mL de PBS y las muestras se centrifugaron a 350 rcf durante 7 min. Se retiró el sobrenadante y se suspendió el gránulo en 200 μL de PBS con suero fetal de ternero (FCS) al 2% en tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 mL¹⁹. Las muestras se adquirieron con un citómetro de flujo²⁰ hasta que se recopilaron al menos 10.000 eventos. Las poblaciones de linfocitos, monocitos y neutrófilos se identificaron en función del tamaño y la granularidad en un diagrama de dispersión frontal y lateral (Figura 1). Los cuadrantes para células positivas simples y dobles se demarcaron utilizando el conjunto de muestras de control (Figura 2). Los resultados de las poblaciones cerradas se expresaron como el porcentaje positivo para las células sometidas a fagocitosis y/o estallido respiratorio, y su intensidad media de fluorescencia.

La proliferación linfocitaria se realizó en sangre total heparinizada. Para cada muestra, se transfirieron 25 μL de sangre a ocho pocillos en una placa de 96 pocillos en U. A continuación, se añadieron 200 ng/mL de solución de enterotoxina B (SEB)/lipopolisacáridos (LPS) de Staphylococcus a cuatro de los pocillos. A continuación, las placas se incubaron a 37 °C con 5 % de CO₂ atmósfera humidificada durante 3 días. A continuación, se utilizaron 50 μL de ³A cada pocillo se le añadió H-timidina de una solución madre de 10 μCi/mL. La placa se incubó durante 4 h a 37°C en CO al 5%₂ atmósfera humidificada durante 4 h y luego almacenada a -80 °C hasta el análisis. A continuación, las células se cosecharon y contaron mediante centelleo líquido.

Tamaño de la muestra

Se realizó un análisis de potencia a priori utilizando una diferencia de medias deseada y desviaciones estándar publicadas previamente para metabolitos y hormonas clave. La diferencia de medias y la desviación estándar (DE) utilizadas en el análisis de potencia fueron: β-hidroxibutirato 0,05 (DE 0,01 mmol/L), grelina 75 (DE 53 pg/mL), leptina 3.000 (DE 3.000 pg/mL) e insulina 220 (DE 150 pg/mL). Esto indicó que sería necesario un tamaño de muestra de 10 perros para un nivel de significación (α) de 0,5 y un poder del 80% para detectar una diferencia en β-hidroxibutirato, grelina, leptina e insulina.

Análisis estadístico

Metabolómica

Para el análisis, los espectros de RMN se dividieron en cubos espectrales de 0,04 ppm, donde se excluyeron las regiones correspondientes al agua y al DSS (4,68 a 4,88, -0,1 a 0,1 ppm, respectivamente), junto con las siguientes regiones adicionales 5,51 a 5,84, 5,92 a 6,07 y 6,11 a 6,31. Todos los espectros fueron normalizados por intensidad total.

La relación entre los grupos de dieta y el metaboloma se exploró mediante el análisis de componentes principales (ACP), el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) se realizaron mediante SIMCA v13.0 (Umetrics, Suecia). Estos métodos estadísticos pueden revelar la agrupación de muestras en diferentes agrupaciones en función de las diferencias de las concentraciones de metabolitos en la población de la muestra. La PCA es un método no supervisado y es quizás el más robusto. PLS-DA y OPLS-DA son los llamados métodos supervisados y utilizan un conocimiento a priori de la pertenencia al grupo para ajustar los datos y maximizar la separación de los datos de estos grupos. Se utilizó la escala de Pareto para los modelos supervisados y los modelos PLS se validaron mediante pruebas de permutación para descartar el sobreajuste. Los cubos espectrales que contribuyeron a la mayor varianza en las muestras se identificaron a partir de parcelas de carga y posteriormente se asignaron a sus metabolitos asociados utilizando la biblioteca de metabolitos Chenomx v8.3 (Chenomx Inc., Alberta, Canadá). A continuación, las concentraciones de metabolitos se cuantificaron mediante el ajuste manual de los picos espectrales en la suite de RMN de Chenomx. Las concentraciones plasmáticas de β-hidroxibutirato medidas por el ensayo colorimétrico se compararon con las concentraciones obtenidas a partir de los espectros ajustados utilizando el paquete «BlandAltmanLeh» v0.3.1 (51) en el software estadístico R Studio v1.1.456 (52).

Modelado

Se utilizó el paquete «lme4» (53) del software estadístico R Studio v1.1.456 (54) para realizar un análisis lineal de efectos mixtos de la relación entre las variables de resultado [cambio en el peso, la ingesta, la actividad, la glucosa, el β-hidroxibutirato, la leptina, la grelina, la insulina, la evaluación del modelo homeostático (HOMA), los metabolitos de la RMN, la proliferación de linfocitos y los resultados de la citometría de flujo] y las variables fijas (tiempo, dieta, edad, sexo y BCS). Se ajustaron modelos separados para cada variable de resultado. El perro se incluyó como un efecto aleatorio para tener en cuenta las medidas repetidas. Las interacciones entre las variables fijas, y entre la dieta y la secuencia de la dieta, no fueron significativas, por lo que no se incluyeron en los modelos finales.

Si la inspección visual de los gráficos cuantil-cuantil residual y la prueba de Shapiro-Wilk de los residuos indicaban una desviación de la normalidad u homocedasticidad, se realizaban transformaciones de la variable dependiente en un intento de mejorar la consistencia de los supuestos del modelo. Sin embargo, la transformación no condujo a un cambio en la interpretación de los modelos ni en nuestras conclusiones. Por lo tanto, para simplificar, los gráficos y el modelo final se informan con los datos no transformados.

Se realizó una comparación post-hoc por pares de las medias marginales estimadas con la corrección de Tukey cuando la dieta fue significativa en el modelo final. Los resultados de los modelos de efectos mixtos se presentan como las medias y el error estándar de las medias. P ≤ 0,001 se consideraron indicativos de evidencia muy sólida, p ≤ 0,01 de evidencia sólida, p ≤ 0,05 de evidencia moderada, p ≤ 0,1 de evidencia débil y p ≤ 0,1 de evidencia insuficiente (55).

Resultados

Ingesta, peso corporal, puntuación de condición corporal y actividad

No hubo diferencias en ninguno de los parámetros basales antes de que los grupos comenzaran su régimen de alimentación asignado en ninguna de las semanas de tratamiento (P > 0,5). Todos los perros se mantuvieron en un BCS de 4 o 5 de 9 durante todo el estudio. Cuando se alimentaron diariamente, los perros tuvieron una mayor ingesta de alimentos en comparación con cuando se alimentaron de forma intermitente (P < 0,001), sin embargo, no hubo diferencia en la ingesta entre los perros cuando se alimentaron intermitentemente con las dietas LF o HF (P = 0,395, Tabla 2). Los perros machos consumieron más comida por kgBWT^0.75 que las perras (media 277 ± 67 vs. 226 ± 50 kcal/kgBWT^0.75). Los perros perdieron más peso cuando ayunaron intermitentemente con una dieta baja en grasas, pero no hubo diferencias en el porcentaje de cambio de peso corporal cuando los perros fueron alimentados diariamente en comparación con cuando ayunaron intermitentemente con un régimen de dieta alta en grasas (Tabla 2). Además, cuando los perros fueron alimentados diariamente, fueron más activos por la noche en comparación con cuando fueron alimentados intermitentemente con la dieta LF (P = 0,028) y la dieta HF (P = 0,012).

Metabolitos

Metabolómica

El análisis de componentes principales indicó cierta separación entre los grupos de dieta, siendo los dos primeros componentes principales los que explicaron el 45,6 y el 9,1% de la varianza, respectivamente. Los análisis posteriores con un modelo discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales supervisados mostraron una separación completa del grupo alimentado diariamente y los grupos con ayuno intermitente, y un agrupamiento de los dos grupos con ayuno intermitente (Figura 3). Los metabolitos asociados a los cubos espectrales que separaron los diferentes regímenes de alimentación fueron el β-hidroxibutirato, lactato, alanina y glucosa.

Ensayo de β-hidroxibutirato a través de un kit y RMN

Las concentraciones plasmáticas de β-hidroxibutirato en los días 3, 5 y 7 fueron más altas cuando los perros fueron ayunados intermitentemente con la dieta HF, y más bajas cuando los perros fueron alimentados diariamente (Figura 4). No hubo efecto del día. El ayuno intermitente aumentó las concentraciones plasmáticas de β-hidroxibutirato independientemente de la dieta administrada, y una puntuación más alta de la condición corporal se asoció con una disminución del β-hidroxibutirato plasmático (Tabla 3). No hubo asociación entre la pérdida de peso y las concentraciones plasmáticas de β-hidroxibutirato (P = 0,198). Hubo una concordancia razonable entre las concentraciones de β-hidroxibutirato obtenidas del kit colorimétrico y de la RMN (Figura 5, Bland Altman).

Lactato y alanina por RMN

Tanto las concentraciones de lactato como las de alanina fueron más bajas cuando los perros fueron ayunados intermitentemente con una dieta alta en grasas (Figura 6). Además, las concentraciones de lactato disminuyeron con el tiempo (P = 0,009; Tabla 3).

Glucosa

Las concentraciones de glucosa en sangre aumentaron con el tiempo desde el día 3 hasta el día 7, y fueron más altas en los perros alimentados diariamente (Figura 7). No hubo diferencias en las concentraciones de glucosa cuando los perros fueron ayunados intermitentemente con las dietas LF e HF (P = 0,98). Tampoco hubo efecto de la BCS sobre la glucemia (P = 0,24; Tabla 3).

Hormonas Insulina, Leptina y Grelina, y HOMA

Tanto las concentraciones de insulina como las puntuaciones HOMA fueron más bajas cuando los perros fueron ayunados intermitentemente con una dieta alta en grasas (Figura 8). Una mayor condición corporal se asoció con menores concentraciones de insulina y puntuaciones HOMA (Tabla 4).

La concentración sérica de leptina fue más alta cuando los perros fueron alimentados diariamente (Figura 9). Además, hubo una disminución en las concentraciones de leptina a lo largo del tiempo (Tabla 4). En el caso de la grelina, los perros que ayunaron de forma intermitente con una dieta de IC tuvieron concentraciones séricas más bajas (Figura 9).

Inmunoensayos

Proliferación de linfocitos

La proliferación de linfocitos no fue significativamente diferente durante ninguno de los regímenes de alimentación.

Fagocitosis y estallido respiratorio

Cuando los perros fueron ayunados intermitentemente con una dieta LF, tenían un menor porcentaje de neutrófilos y un menor MFI en macrófagos que sufrieron tanto fagocitosis como oxidación (Figura 10; Tabla 5). Además, cuando estaban en el régimen de alimentación de IF LF, los perros también tenían un menor porcentaje de linfocitos que sufrieron un estallido oxidativo respiratorio (Figura 10; Tabla 5).

Discusión

El ayuno intermitente y la promoción de la formación de cetonas pueden ser un régimen de alimentación beneficioso para los perros hospitalizados, especialmente para los pacientes con columna vertebral. Nuestra hipótesis principal era que los perros sanos que ayunaban intermitentemente tendrían concentraciones más bajas de glucosa en sangre, insulina y leptina en ayunas, y mayores concentraciones de β-hidroxibutirato y grelina en ayunas en comparación con cuando comían a diario. Nuestra hipótesis secundaria fue que los perros en ayunas intermitentes que consumen una dieta alta en grasas enriquecida con triglicéridos de cadena media tendrán concentraciones más altas de β-hidroxibutirato y leptina en sangre en comparación con los perros en ayunas intermitentes que consumen una dieta LF. Encontramos que los perros en ayunas durante 48 h con una dieta de IC enriquecida en triglicéridos de cadena media promovieron concentraciones más altas de β-hidroxibutirato en sangre y concentraciones de insulina más bajas que cuando se alimentaron diariamente o ayunaron con una dieta LF. La leptina no se mantuvo durante el ayuno intermitente mediante el uso de una dieta de IC; sin embargo, no hubo diferencia en los parámetros inmunológicos estudiados entre el momento en que los perros fueron alimentados con la dieta HF y el momento en que fueron alimentados diariamente. Las concentraciones de grelina en ayunas fueron más bajas cuando los perros fueron ayunados intermitentemente con una dieta de IC. En general, estos hallazgos indican que un régimen de ayuno intermitente en una dieta alta en grasas enriquecida en triglicéridos de cadena media aumenta las concentraciones plasmáticas de β-hidroxibutirato sin causar inmunosupresión, sin embargo, no anuló la caída de la leptina ni aumentó las concentraciones de grelina durante el ayuno.

En este estudio se eligió una croqueta LF disponible comercialmente como dieta de control. Cuando los perros comían la dieta LF de forma intermitente, consumían menos calorías y perdían más peso en comparación con cuando comían la dieta HF. Existen numerosos estudios en varias especies que también muestran este fenómeno (56). En un estudio, los perros alimentados ad libitum con una dieta alta en grasas (51% de energía proveniente de grasas) ganaron más peso que los perros alimentados ad libitum con una dieta baja en grasas (23% de energía de grasas) (57). Por lo tanto, para evitar la pérdida de peso en un régimen de ayuno intermitente, es probable que se requiera un alimento rico en grasas y denso en energía para garantizar que un perro consuma todos sus requerimientos. Sin embargo, existen asociaciones epidemiológicas entre el alto consumo de grasas en la dieta y la pancreatitis en perros (58). En los primeros modelos experimentales, los perros alimentados con una dieta alta en grasas frente a una dieta alta en proteínas y carbohidratos provocaron signos clínicos más graves y cambios patológicos en el páncreas (59, 60). Sin embargo, es poco probable que las dietas hayan sido raciones completas y equilibradas, por lo que otras deficiencias de nutrientes pueden haber confundido los resultados. Dar las sobras de la mesa y consumir alimentos desechados en la basura también se han identificado como factores de riesgo para el desarrollo de pancreatitis en perros (61). Sin embargo, es difícil especular cuál era el contenido de grasa de esos artículos. Por el contrario, alimentar a un grupo de perros sanos con dietas con diferentes contenidos de grasa, incluidos triglicéridos de cadena media, no tuvo un efecto sobre la inmunorreactividad sérica canina similar a la tripsina (cTLI), la inmunoactividad pancreática de la lipasa (cPLI) o las concentraciones de gastrina (62). Sin embargo, la dieta más alta en grasas en este estudio contenía solo ~ 40% de grasa sobre una base energética. Aún así, existen numerosos estudios e informes de dietas para perros de trineo en las que los perros fueron alimentados con una dieta con un contenido de grasa similar a nuestra dieta HF sin causar pancreatitis (63-68).

Las cetonas proporcionan una fuente alternativa de energía para las neuronas y se ha demostrado que reducen la degeneración neuronal y mejoran la recuperación en modelos de lesiones cerebrales y espinales en roedores (30, 69-71). Mientras que las concentraciones de β-hidroxibutirato fueron más altas en los perros cuando ayunaron intermitentemente con la dieta HF, las concentraciones obtenidas (media 0,061, DE 0,024 mmol/L) fueron mucho más bajas en comparación con los roedores (0,8-2 mmol/L) y los humanos (1,67 mmol/L) ayunados durante un tiempo similar (22, 72, 73). Nuestro hallazgo es consistente con otros estudios publicados en los que el perro no alcanza la misma concentración de cetonas en sangre que otras especies después de ayunos comparables (74-76). Sin embargo, se ha demostrado que la tasa de producción total de cetonas es similar entre perros y hombres después de un ayuno de 48 h (77, 78). Además, De Bruijne y Van den Brom (74) establecieron que los perros tienen una tasa más alta de aclaramiento de cetonas plasmáticas que el hombre. Por lo tanto, la concentración aparentemente baja de β-hidroxibutirato en los perros no se debe a la reducción de la producción de cetonas, sino más bien a las tasas más altas de utilización periférica en comparación con los roedores y los humanos. Además, aunque una sola muestra de sangre es indicativa de la concentración de un metabolito en ese momento, no describe su flujo (producción y utilización) (78). La concentración de β-hidroxibutirato en el cerebro y el líquido cefalorraquídeo (LCR) es proporcional a la concentración encontrada en el plasma, y aumenta a medida que continúa la duración del ayuno (72, 79, 80). Cuando está disponible, las neuronas utilizan preferentemente el β-hidroxibutirato sobre la glucosa, el lactato y el piruvato como sustrato energético (81). Por lo tanto, incluso un pequeño aumento en las concentraciones plasmáticas de cetonas podría proporcionar una gran contribución de energía para el cerebro y las neuronas.

En nuestro estudio, todos los perros tenían concentraciones de glucosa en sangre en ayunas dentro del rango normal de referencia, sin embargo, se obtuvieron valores más bajos cuando los perros estuvieron en ayunas durante 48 h frente a 12 h. Esto refleja la diferencia en la duración del ayuno más que la composición de macronutrientes de las dietas. De manera similar, en un estudio de perros que comían una dieta libre de carbohidratos o alta en carbohidratos, las concentraciones de glucosa en sangre eran las mismas después de un ayuno de 24 horas en ambos grupos de perros. Las concentraciones más bajas de insulina se observaron cuando los perros fueron ayunados intermitentemente con la dieta HF, lo que indicó una disminución en la producción de insulina y/o un aumento en la sensibilidad a la insulina. Las puntuaciones de resistencia a la insulina HOMA también fueron más bajas cuando los perros estaban en este régimen de alimentación, lo que es un reflejo de las bajas concentraciones de glucosa e insulina en ayunas. Tanto la restricción calórica como la reducción de la masa grasa mejoran la sensibilidad a la insulina en perros con sobrepeso (83-86). En nuestro estudio, los perros con ayuno intermitente que seguían una dieta HF perdieron menos peso que cuando ayunaban intermitentemente con una dieta LF y, sin embargo, tenían concentraciones de insulina más bajas. Por lo tanto, parece que el ayuno intermitente en una dieta alta en grasas puede reducir la producción de insulina o mejorar la sensibilidad a la insulina independientemente de la pérdida de peso.

La alanina y el lactato fueron dos metabolitos gluconeogénicos identificados por la OPLS como diferentes entre los regímenes de alimentación. Durante la etapa temprana del ayuno, la proteólisis del músculo libera alanina para la gluconeogénesis en los hepatocitos (87, 88). En un estudio de perros que consumieron una dieta libre de carbohidratos, la tasa de recambio de alanina y su conversión de alanina en glucosa plasmática aumentaron después de un ayuno de 48 horas (89). El lactato es transportado por los mismos transportadores de monocarboxilato (MCT) que las cetonas, y también sirve como fuente de energía para las células, incluidas las neuronas, en ayunas (90, 91). La alimentación de ratas con una dieta alta en grasas aumentó la expresión de MCT1 por parte de las células endoteliales cerebrales (92). Además, las concentraciones de lactato aumentan en el cerebro de los seres humanos en ayunas durante 2 días (72). Por lo tanto, la reducción tanto de la alanina como del lactato en los perros cuando ayunan intermitentemente con una dieta de IC puede deberse a un aumento de la absorción por parte del hígado, el cerebro y los riñones.

La adipoquina, la leptina, tiene muchas funciones en el cuerpo, incluida la activación de la fagocitosis por monocitos y la quimiotaxis de los neutrófilos y la generación de radicales oxidativos (93-95). En nuestro estudio, encontramos que las concentraciones de leptina eran más bajas en los perros que ayunaban intermitentemente, independientemente del contenido de grasa de la dieta. Se sabe que tanto el ayuno como la reducción de la masa grasa disminuyen la producción de leptina (96, 97). Durante el transcurso de nuestro estudio, los perros perdieron algo de peso; Sin embargo, no hubo diferencias en las concentraciones iniciales de leptina al comienzo de cada semana de estudio en ninguno de los perros. Por lo tanto, la reducción en las concentraciones de leptina fue el resultado del régimen de ayuno, y no de la pérdida de masa grasa. Además, aunque la leptina no se mantuvo durante el ayuno alimentándolos con una dieta de IC, no hubo diferencia entre los parámetros inmunológicos estudiados en esos perros y cuando los perros fueron alimentados diariamente. Sí encontramos una reducción en el porcentaje de leucocitos que sufrían fagocitosis y estallido respiratorio cuando los perros estaban en ayunas intermitentes con una dieta LF. Esto sugiere que los cambios inmunológicos no fueron mediados por leptina. Sin embargo, el efecto supresor no fue consistente en todos los parámetros inmunes estudiados, y se desconoce el significado clínico de esta reducción.

Limitaciones

Ambas dietas utilizadas en este estudio se formularon para cumplir con los requisitos de la AAFCO, y aunque se hicieron todos los intentos para crear perfiles de nutrientes similares excluyendo el contenido de grasas y carbohidratos, las dietas diferían entre sí en algunos micronutrientes. Además, cuando los perros fueron ayunados intermitentemente con la dieta LF, perdieron más peso que en los otros regímenes de alimentación, lo que indica que los perros estaban en un estado catabólico mayor. Sin embargo, un aumento en la proteólisis y la oxidación de ácidos grasos no se reflejó en un aumento en las concentraciones plasmáticas de alanina y cetonas de los perros durante el régimen de ayuno intermitente de la dieta LF. Además, la concentración plasmática de cetonas no se asoció con la pérdida de peso en este estudio. Se realizó una semana de lavado utilizando el régimen de alimentación de control entre cada período de estudio, y ninguno de los parámetros de resultado fue significativamente diferente en los perros al comienzo de cada período de estudio. Además, se examinó el orden de la dieta en el modelo multivariado que no mostró ningún efecto. Nuestros resultados sugieren que las diferencias en los perfiles de la dieta y una mayor pérdida de peso durante el régimen de ayuno intermitente de la dieta LF probablemente tuvieron un efecto mínimo, sin embargo, se requeriría un estudio más exhaustivo para determinar si ese es realmente el caso.

En nuestro estudio, no se observaron efectos nocivos cuando los perros fueron ayunados intermitentemente con la dieta alta en grasas. La alimentación aguda con una dieta alta en grasas en otras especies puede conducir a un aumento de las citoquinas proinflamatorias circulantes, como la interleucina 1β y la necrosis tumoral-α, pero esto no se ha demostrado de manera consistente (98). Curiosamente, se ha demostrado que un régimen de ayuno intermitente mejora la expresión de genes relacionados con la proinflamación en los hepatocitos durante la alimentación rica en grasas a largo plazo en ratones (99). Actualmente se desconocen los efectos del ayuno intermitente sobre los marcadores de inflamación durante la alimentación rica en grasas en perros. No medimos las citocinas inflamatorias en nuestro estudio, sin embargo, es posible que en estudios futuros deseen hacerlo. Además, una diferencia en la inmunidad entre los regímenes de alimentación fue evidente solo cuando los perros fueron ayunados intermitentemente con la dieta LF. Se desconoce la importancia de este efecto inmunitario, pero puede haber una mayor implicación de esto en un entorno clínico.

Para promover la formación de cetonas, el aceite de coco se utilizó en la dieta HF como una rica fuente de triglicéridos de cadena media. Sin embargo, el principal componente de triglicéridos de cadena media en el aceite de coco es el ácido dodecanoico (ácido láurico, C12), con el ácido decanoico (ácido cáprico, C10) y el ácido octanoico (ácido caprílico, C8) como el gran resto (100). Cuando se administra en cantidades iguales, la ingesta de ácido decanoico y ácido octanoico conduce a una mayor producción de cetonas postprandialmente que el ácido dodecanoico (101, 102). Por lo tanto, para aumentar el efecto de los triglicéridos de cadena media sobre la cetogénesis, se puede administrar un aceite concentrado con una mayor cantidad de ácido decanoico y octanoico en lugar de aceite de coco.

La evaluación del modelo de homeostasis (HOMA) se desarrolló para proporcionar una medida de la resistencia periférica a la insulina de la glucosa y la insulina en ayunas. Las puntuaciones se correlacionan bien con un modelo de pinza euglucémica en humanos, y se han utilizado para detectar mejoras en la sensibilidad a la insulina con la pérdida de peso y el ayuno en humanos (103-105). En nuestro estudio, los perros que ayunaron intermitentemente con una dieta de IC tuvieron la puntuación HOMA más baja en comparación con cuando fueron alimentados diariamente o ayunados intermitentemente con la dieta LF. Sin embargo, se ha encontrado que HOMA es variable confiable en animales de compañía para detectar la resistencia a la insulina (106-108). Por lo tanto, si bien encontramos una diferencia con las puntuaciones HOMA en los diferentes regímenes de alimentación, cualquier interpretación en la sensibilidad periférica a la insulina debe confirmarse utilizando una pinza euglucémica.

Conclusión

En este estudio, encontramos que el ayuno de hasta 48 horas en perros sanos no causa inmunosupresión, y que el ayuno con una dieta alta en grasas enriquecida con triglicéridos de cadena media promovió una mayor concentración de cetonas plasmáticas que cuando los perros ayunaron después de comer una dieta baja en grasas. Sin embargo, las concentraciones obtenidas en perros son significativamente menores que las reportadas en otras especies ayunadas durante un período de tiempo similar. Por lo tanto, se requiere un estudio de cinética de cetonas para obtener una comprensión más completa del flujo de cetonas en perros durante ayunas de diferentes duraciones, y si este régimen de alimentación podría ser factible en perros hospitalizados que se recuperan de una lesión neuronal. Además, los perros que ayunaron intermitentemente con una dieta baja en grasas, consumieron menos calorías y perdieron más peso que cuando se alimentaron con una dieta alta en grasas. Por lo tanto, cualquier aplicación práctica de este tipo de régimen de alimentación requeriría la modificación de la dieta en sí (por ejemplo, aumentar la densidad energética de la dieta para reducir el volumen y el llenado intestinal) y/o reducir el número de días o la duración del ayuno. En definitiva, aunque hemos demostrado la posibilidad de que este tipo de régimen de alimentación sea factible y produzca cetonas sin efectos nocivos en perros sanos, su aplicación en perros hospitalizados aún está por determinar.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos generados para este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

Declaración de Ética

El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Massey (MUAEC #16/130).

Contribuciones de los autores

YL y NC conceptualizaron y diseñaron el estudio. YL fue el investigador principal, con la ayuda de NC. YL organizó la recolección de datos, completó la preparación de laboratorio de las muestras de sangre, realizó el análisis estadístico y escribió el primer borrador del manuscrito. AH supervisó los ensayos inmunológicos. PE realizó el análisis de RMN. AG revisó el diseño del estudio y el análisis estadístico. TW contribuyó con la lectura y revisión del manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la revisión del manuscrito y aprobaron la versión enviada.

Financiación

Este trabajo descrito en este manuscrito fue financiado internamente.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Reconocimientos

Los autores desean agradecer a Brittnee Southland por su ayuda en la elaboración y distribución de las dietas y la recolección de muestras de sangre.

Notas

Referencias