Introducción

Giardia duodenalis (sinónimo: Giardia lamblia, Giardia intestinalis) es el agente causal de la giardiosis y uno de los parásitos más comúnmente encontrados en perros en todo el mundo (1, 2). Los estudios moleculares han demostrado que G. duodenalis comprende al menos ocho ensamblajes genéticos distintos (A-H), de los cuales los ensambles C y D se encuentran exclusivamente en perros, mientras que los ensambles A y B de Giardia tienen potencial zoonótico (3-5).

La infección por G. duodenalis en perros tiene una distribución mundial con tasas de prevalencia que varían según la población de prueba, el método diagnóstico utilizado y la zona geográfica (6, 7). En Italia, los valores de prevalencia oscilan entre el 11,1 y el 28,9% en las regiones del norte (8-10), entre el 6,4 y el 21,4% en las regiones centrales (11-14) y entre el 7,7 y el 14,2% en las regiones del sur (15, 16).

El diagnóstico de la infección por Giardia en perros puede suponer un reto, debido a una baja dosis infecciosa y a la marcada persistencia de quistes en el medio ambiente, así como a una excreción fluctuante de los quistes en las heces que hace que el seguimiento de este parásito sea problemático (17, 18). Las herramientas tradicionales para la identificación de quistes de Giardia incluyen el frotis fecal, la técnica de flotación con sulfato de zinc (17, 19), el ensayo de inmunofluorescencia (IFA; el estándar de oro), la inmunocromatografía, los ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y los análisis moleculares que permiten distinguir los diferentes ensamblajes de G. duodenalis (17, 20, 21). Entre las técnicas copromicroscópicas, un estudio reciente reportó una alta sensibilidad y especificidad de la técnica FLOTAC con sulfato de zinc para el diagnóstico de la infección por quistes de Giardia en perros (19, 22).

Además, el control de la infección por Giardia en perros es propenso a una serie de problemas. Se han probado varios compuestos contra las infecciones por Giardia en perros, como los benzimidazoles, en particular el fenbendazol, y el metronidazol, que presenta actividad contra el parásito (23-28). Otros estudios informaron la eficacia del ronidazol, la nitazoxanida, la azitromicina, el tinidazol y el ipronidazol y otros fármacos como la quinacrina y la furazolidona, para reducir los quistes de Giardia excrementados por los perros infectados (17, 29-32). Otra opción recomendada por el Consejo Científico Europeo de Parásitos de Animales de Compañía (ESCAAP) es la combinación de febantel (un profármaco metabolizado in vivo a fenbendazol)/pirantel/praziquantel a la dosis estándar de desparasitación (15,0 mg/kg de febantel, 14,4 mg/kg de pirantel, 5,0 mg/kg de praziquantel) repetida una vez al día durante 3 días (33). Recientemente, el secnidazol, una molécula que se utiliza para el tratamiento de la giardiosis en humanos, ha sido reportado como un fármaco eficaz para el tratamiento de la giardiosis canina clínica (34). Sin embargo, el fenbendazol y el metronidazol se utilizan de forma rutinaria para tratar la giardiosis en perros y son los únicos compuestos registrados en la mayoría de los países europeos.

A menudo se ha sugerido que la resistencia a los medicamentos antiparasitarios explica el fracaso del tratamiento debido a la eliminación incompleta del parásito después del tratamiento u otras enfermedades subyacentes (p. ej., enfermedades inflamatorias intestinales, sobrecrecimiento bacteriano, coinfección con otros organismos). También se recomienda lavar con champú a los perros (por ejemplo, con un producto que contenga digluconato de clorhexidina) al principio y al final del tratamiento antiprotozoario para reducir las reinfecciones a través de la materia fecal en el pelaje (30). A pesar de la recomendación de tratamiento con fenbendazol para la eliminación de quistes de Giardia en perros, actualmente, datos no publicados de clínicas veterinarias muestran una baja eficacia de este fármaco en la eliminación de la infección. Teniendo en cuenta que las Guías ESCCAP recomiendan el fenbendazol (1x/día, 50 mg/kg durante 3 días) y el metronidazol (2x/día, 25 mg/kg durante 5-7 días) para el tratamiento de las infecciones por Giardia en perros (33), el objetivo del presente estudio fue reevaluar la eficacia de estos dos fármacos específicos para el tratamiento de la giardiosis en perros con dueño. monitoreado durante 50 días en condiciones domiciliarias.

Materiales y métodos

Experimentación con animales y diseño de estudios

En 2018-2019 se llevó a cabo un ensayo de campo realizado en condiciones domésticas en 24 perros con dueño infectados naturalmente por Giardia spp. y que vivían en la región de Campania, en el sur de Italia. Los perros incluidos en el estudio fueron remitidos al Laboratorio de Parasitología y Enfermedades Parasitarias del Departamento de Medicina Veterinaria y Producción Animal de la Universidad de Nápoles Federico II, para su análisis coproparasitológico. Los dueños de perros fueron informados sobre el protocolo del estudio y dieron su consentimiento para la inclusión de sus mascotas. Los animales se distribuyeron en grupos de forma aleatoria con el fin de obtener dos grupos de 12 animales cada uno con cargas parasitarias similares de quistes de Giardia: grupo A-fenbendazol (quiste medio por gramo de heces-CPG = 20.995) y grupo B-metronidazol (CPG = 18.580). Los quistes se enumeraron mediante un método de flotación fecal (Flotación, Traslación y Centrifugación) técnica FLOTAC (ver Análisis de Laboratorio). Además, los perros tenían las siguientes características: 11 machos (cinco perros de pelo largo y seis de pelo corto) y 13 hembras (seis perros de pelo largo y siete de pelo corto), con edades comprendidas entre los 2 meses y los 5 años, que vivían en el interior pero con acceso al exterior. Todos los perros incluidos en el estudio no vivían en el mismo hogar con otros animales. Los criterios de exclusión fueron animales tratados con cualquier fármaco antiparasitario en las 2 semanas previas, animales con cualquier comportamiento agresivo y animales que mostraran signos clínicos de cualquier otra enfermedad. Para cada animal incluido en el estudio, se registraron y analizaron los datos relativos a la edad, la longitud del pelaje, los signos clínicos y la consistencia de las muestras fecales. Por razones éticas, no se disponía de ningún grupo de control de animales no tratados. Los perros del Grupo A fueron tratados con comprimidos de fenbendazol (Panacur, Intervet Italia Srl) administrados a dosis de 50 mg/kg por vía oral una vez al día durante 5 días consecutivos. Los perros del Grupo B fueron tratados con comprimidos de metronidazol (Flagyl, Zambon Italia Srl) administrados por vía oral a dosis de 25 mg/kg, por vía oral, dos veces al día durante 5 días consecutivos. Todos los perros comenzaron el primer tratamiento en el día 0. Todos los perros que estaban excretando quistes de Giardia después del primer tratamiento fueron retirados (ya sea en el día 7 o en el día 14 o en el día 21) hasta que se obtuvo un resultado negativo con el mismo tratamiento. Además, todos los perros fueron reexaminados en el día 50. La eficacia del tratamiento se evaluó en función de la GPC media encontrada en las muestras fecales en el día 5 (pretratamiento) y en los días 7, 14, 21 y 50 (postratamiento). Además, cada perro fue sometido a un lavado con digluconato de clorhexidina al inicio y al final de cada tratamiento aplicado. Además, se sugirió a cada propietario que siguiera algunas reglas básicas para evitar la reinfección mediante la limpieza y el secado del ambiente, el uso de utensilios limpios para la alimentación y el agua y la eliminación adecuada de las heces (33).^®®

Análisis de laboratorio

Los perros fueron identificados y verificados inicialmente como infectados con Giardia spp. y posteriormente analizados en el día-5 (pre-tratamiento) y en los días 7, 14, 21 y 50 después del primer tratamiento aplicado (día 0). Las muestras fecales analizadas en cada punto de muestreo fueron representadas por piscinas recolectadas diariamente durante 2 días (antes de la fecha de tratamiento). Los análisis se realizaron dentro de las 24 h posteriores al muestreo. En cada día de muestreo, las heces de todos los perros se analizaron para detectar la presencia de quistes de Giardia utilizando la técnica FLOTAC con una sensibilidad analítica de 1 quiste por gramo (CPG) de heces (19). Cada muestra se analizó utilizando sulfato de zinc (gravedad específica = 1,350).

Quince muestras recogidas en el día-5 se fijaron en bicromato de potasio al 2,5% (dilución 1:4) y se procesaron para estudios moleculares. Brevemente, el ADN genómico se extrajo utilizando el kit FastDNA SPIN para heces (MP Biomedicals, Solon, Ohio, EE. UU.). Se utilizó un ensayo de PCR anidado para amplificar un fragmento de 511 pb del gen beta-giardina de acuerdo con un protocolo publicado (35). El ADN de cultivos axénicos de cepas de Giardia duodenalis del ensamble A (WB, genotipo AI) y del ensamble B (GS, genotipo BIV) se utilizó como controles positivos en los ensayos de PCR. Los productos de PCR se purificaron utilizando columnas de centrifugación (kit de purificación de PCR QiaQuick –Qiagen) y se secuenciaron a partir de ambas hebras.

Eficacia del tratamiento

El porcentaje de eficacia de los tratamientos (A y B) se calculó en cada punto de muestreo del ensayo (días 7, 14, 21 y 50) de acuerdo con la siguiente fórmula [adaptada de (36)].

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el programa Windows SPSS (versión 17.0). Se utilizó la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney para determinar el nivel de diferencia significativa entre los grupos de tratamiento (A, B).^®

Criterios de evaluación y resultados clínicos

Se utilizó un sistema de puntuación arbitrario (de 1 a 4) y se asignó una puntuación a cada perro, en función de la consistencia fecal y los síntomas clínicos (actitud letárgica, retraso del crecimiento, pérdida de peso, vómitos y flatulencias) de la siguiente manera: (1) heces formadas y sin síntomas clínicos, (2) heces formadas y síntomas clínicos, (3) heces blandas y síntomas clínicos, y (4) diarrea y síntomas clínicos.

Resultados

En la Tabla 1 se muestran los datos del perro (sexo, edad, longitud del pelaje, puntuación clínica), quistes de Giardia por gramo (GPC) de heces (media, desviación estándar) y eficacia (%) del tratamiento con fenbendazol (Grupo A) y metronidazol (Grupo B) en los diferentes días de estudio (Día-5, Día 7, Día 14, Día 21 y Día 50).

TABLA 1. Grupos A-Fenbendazol y B-Metronidazol: datos del perro (sexo, edad, longitud del pelaje, puntuación clínica), quistes de Giardia por gramo (GPC) de heces (media, desviación estándar) y eficacia (%) del tratamiento en los diferentes días de estudio.

Los resultados parasitológicos al día 5 mostraron valores medios de 20.995 GPC de Giardia (mínimo 2.780 GPC, máximo 48.000 GPC) en el Grupo A (fenbendazol) y 18.580 GPC de Giardia (mínimo 10.848 GPC, máximo 32.178 GPC) en el Grupo B (metronidazol). El día 7, se encontraron quistes de Giardia spp. en el 33,3% (4/12; intervalo de confianza [IC] del 95% = 11,3-64,5) de los perros del grupo A y en el 41,7% (5/12; IC del 95% = 16,5-71,4) de los perros del grupo B.

La eficacia del fenbendazol fue del 80,9% en el día 7, del 100% en el día 14, del 97,0% en el día 21 y del 95,0% en el día 50. La eficacia del metronizazol fue del 70,8% en el día 7, del 99,0% en el día 14, del 100% en el día 21 y del 97,1% en el día 50. En general, las eficacias de Fenbendazol y Metronidazol contra la infección por G. duodenalis no fueron significativamente diferentes (P = 0,686).

No se encontraron otras coinfecciones con parásitos intestinales en los exámenes copromicroscópicos. Brevemente, 6 perros del Grupo A y 5 perros del Grupo B permanecieron negativos hasta el día 50 después de recibir el primer tratamiento en el Día 0. Ocho perros (cuatro de cada grupo), recibieron el segundo tratamiento en el día 7 (después de la primera terapia en el día 0), y otros dos perros (uno de cada grupo) fueron retirados por segunda vez en el día 21 del Grupo A y el día 14 del Grupo B. Además, en el Grupo B, hubo un perro que recibió tres tratamientos durante el estudio en los días 0, 7 y 14. Finalmente, dos perros (uno de cada grupo), que habían recibido el primer tratamiento en el día 0, seguían excretando quistes de Giardia en el último día de estudio (día 50).

Criterios de evaluación y resultados clínicos

A los 5 días, las heces no estaban formadas a diarreicas en los perros pertenecientes a ambos grupos de tratamiento, pero no se observaron respuestas adversas debido a los medicamentos. El 33,3% de los perros obtuvieron una puntuación de 1, el 25% una puntuación de 2, el 25% una puntuación de 3 y el 16,7% una puntuación de 4. En cuanto a los perros que dieron positivo para Giardia después del tratamiento (13/24), cinco pertenecían a la primera categoría (38,6%), cuatro a la segunda (30,8%), uno a la tercera categoría (7,7%) y tres a la cuarta (23%).

Caracterización molecular

Giardia El ADN solo pudo amplificarse a partir de seis de las 15 muestras fecales analizadas, tres del Grupo A (números de identificación del perro = F1, F6, F8) y tres del Grupo B (números de identificación del perro = M4, M7, M11). Los productos de amplificación de beta-giardina se secuenciaron y compararon, utilizando BLAST, con todas las secuencias disponibles en la base de datos GenBank. Esto reveló una homología completa (por ejemplo, 100% con JN416550) con el ensamblaje específico canino D en los seis perros positivos. Es probable que la falta de amplificación en las muestras restantes se deba al daño del quiste resultante de las condiciones de almacenamiento.

Discusión

Durante los últimos 60 años, se han introducido varios agentes quimioterapéuticos que todavía se utilizan en la terapia para la giardiosis (37). Desafortunadamente, la mayoría de los medicamentos utilizados tienen efectos adversos considerables, como vómitos, diarrea sanguinolenta, aborto, disfunciones neurológicas, por lo que están contraindicados (38). En este contexto, los estudios sobre agentes quimioterapéuticos juegan un papel fundamental en la justificación del tratamiento de la giardiosis.

Varios benzimidazoles (39, 40), y en particular el fenbendazol (23), o las combinaciones de febantel/fenbendazol con otros compuestos demostraron ser eficaces (24, 25, 41). El metronidazol, un nitroimidazol y el fenbendazol se utilizan de forma rutinaria para tratar la giardiosis en perros (30). El ronidazol mostró un buen efecto antiprotozoario contra Giardia en perros (30) y el oxfendazol mostró una disminución significativa en el número de quistes (40).

Los hallazgos del presente estudio no revelaron una diferencia significativa de eficacia entre los fármacos utilizados (fenbendazol 80,9% vs. metronidazol 70,8% al día 7). Además, después de aplicar el primer tratamiento, ambos fármacos no lograron eliminar los quistes de Giardia en todos los perros. La reaparición de los quistes en las heces podría atribuirse a una reinfección, al fracaso del tratamiento, a la medicación correcta administrada por los propietarios, a la dieta, así como a cuestiones biológicas relacionadas con la excreción intermitente de quistes de Giardia. Sin embargo, no hay información específica del entorno del perro en casa si el propietario hizo algún intento de limpiar las áreas contaminadas. Faure et al. (42), reportaron una diferencia significativa de eficacia entre fenbendazol y metronidazol (30,3% vs. 91,9%). En nuestro estudio, el fenbendazol mostró una eficacia inferior a la reportada por Zajac et al. (26), quienes obtuvieron una eficacia del 90% (26). Sin embargo, es importante destacar que en el presente estudio ambos fármacos mostraron una eficacia del 100% después de dos ciclos consecutivos de tratamientos, es decir, en el día 14 en el grupo A y en el día 21 en el grupo B.

Quince (62,5%) de los 24 perros tratados de ambos grupos (ocho perros del Grupo A y siete perros del Grupo B) dieron negativo para quistes de Giardia después de la primera terapia en el día 7. Además, había perros de los grupos A y B, mostrando así una infección persistente que ha sido eliminada al día 14 o al día 21 después de dos o tres tratamientos de 5 días cada uno. Podría ser posible, que algunas Giardia permanecieran en baja abundancia en el intestino de estos perros que seguían siendo positivos después del primer tratamiento aplicado, o para los perros que necesitaron ser tratados tres veces hasta obtener un resultado negativo, o tal vez nos encontráramos ante un fracaso del tratamiento debido a la resistencia a los medicamentos. Sin embargo, se necesitan investigaciones futuras, con el fin de establecer la disponibilidad de los fármacos en la sangre y la capacidad de estos para eliminar los quistes de Giardia por métodos in vitro.

Además, dos perros de cada grupo (A y B) permanecieron negativos después de la primera terapia (Día 0), hasta el Día 50, cuando resultaron positivos. En estos casos, se sugirió que las reinfecciones por el medio ambiente son la causa más común de fracaso del tratamiento (25, 30) considerando que el período prepatente puede ser tan corto como 4 días (33). Además, la presencia de quistes en el pelaje del animal, asociados a la resistencia del parásito a los desinfectantes (gluconato de clorhexidina en nuestro estudio) y a las condiciones ambientales y al estrés, puede explicar las reinfecciones (30). Dado que se trata de un ensayo de campo realizado en condiciones domiciliarias, no estábamos seguros de la falta de limpieza y baño debido a la falta de cumplimiento por parte del propietario, por lo tanto, el uso de medidas de higiene como el champú de digluconato de clorhexidina antes y después del tratamiento podría tener una influencia considerable en nuestros resultados, lo que representa un problema importante de este estudio. Morón-Soto et al. también informaron que los perros volvieron a eliminar quistes después de un breve período después del tratamiento antiparasitario cuando no se realizó la desinfección o limpieza de sus recintos (31).

Algunos estudios experimentales han evaluado también la eficacia de la administración oral de probióticos junto con albendazol (38), por lo que durante el tratamiento el veterinario puede recomendar la administración de probióticos que desempeñen un papel sinérgico con el fármaco regenerador de la flora intestinal. Sin embargo, en el presente estudio, ninguno de los perros recibió una dieta especial o suplementos probióticos durante y después de la terapia. Además, hay pocos estudios recientes que hayan demostrado que la diversidad microbiana no se vio alterada por la administración de fenbendazol, lo que contrasta con el metronidazol que alteró significativamente la estructura y la diversidad microbiana (43-47). La administración de metronidazol a perros sanos causó cambios significativos en el microbioma, algunos de los cuales persisten después de la interrupción del fármaco con efectos clínicos desconocidos. Además, algunos perros que toman metronidazol pueden sufrir neurotoxicidad (48, 49). Sin embargo, en el presente estudio, no se observaron respuestas adversas debidas a los medicamentos, incluyendo signos neurológicos transitorios debidos al metronidazol.

Ha habido dos informes que examinan los efectos del secnidazol en Giardia en perros. Uno, reportó una eficacia del 100% de la reducción de quistes en dos grupos de seis perros hospitalizados (50). El otro, mostró que a los 43 días después del primer tratamiento, se consideró que los 9 perros tenían heces normales, pero 4 de los 9 cachorros fueron positivos para el antígeno de Giardia (34). Teniendo en cuenta estos hechos, tal vez el secnidazol aplicado dos veces, con 2-3 semanas de diferencia, podría ser un tratamiento alternativo y más fácil, con un mejor cumplimiento también para tratar la infección por Giardia. Se necesitan más datos para demostrar su eficacia tanto en estudios de campo como experimentales.

Finalmente, el genotipado de Giardia demostró el ensamblaje D específico del huésped en todos los perros positivos, de acuerdo con otros estudios realizados en Italia (12, 35). Sin embargo, nuestro estudio presentó limitaciones debido al tamaño de la muestra y a las malas e inadecuadas condiciones de almacenamiento para asegurar el aislamiento efectivo del ADN de las muestras fecales. Por lo tanto, se necesita más investigación sobre las cepas distintivas de G. duodenalis, con el fin de realizar una estimación realista del riesgo zoonótico (51).

Sobre la base de los hallazgos, como se esperaba en un ensayo con un pequeño número de individuos en condiciones domésticas, y especialmente para un parásito con las características de Giardia (es decir, que tiene una infección directa y un período corto antes de la patente), los autores solo pudieron especular que el tratamiento por sí solo no es suficiente para controlar la infección por Giardia.

Una de las principales limitaciones de nuestro estudio se basa en el pequeño tamaño de la muestra (nº = 12 perros), la ausencia de un grupo control y la asignación de los animales en los dos grupos de tratamiento basada únicamente en la GPC individual de Giardia evaluada en el día-5. Sin embargo, el número limitado de perros en nuestro estudio se debió principalmente al tipo de estudio (prueba de campo en condiciones domiciliarias) que requiere un cumplimiento total tanto de los veterinarios como de los propietarios de perros. Las cuestiones éticas fueron las principales razones para no incluir un grupo de control en este tipo de ensayo de campo realizado en condiciones domiciliarias. En un estudio similar, Mirò et al. (52) evaluaron la eficacia de fenbendazol y mebendazol utilizando 10 por grupo. Como consecuencia, en la fase de asignación no pudimos considerar otros parámetros epidemiológicos clave como la edad, la longitud del pelaje y el estilo de vida. Diferentes hipótesis podrían explicar la reaparición de los quistes de Giardia en algunos perros después del tratamiento, por ejemplo, la reinfección del entorno doméstico, la medicación correcta administrada por los dueños, la dieta, así como el fracaso del tratamiento, pero también problemas biológicos relacionados con la excreción intermitente de quistes de Giardia. Por lo tanto, debido a los parámetros no controlados en este ensayo de campo realizado en condiciones domiciliarias, se justifican estudios futuros para producir evidencia concluyente para la evaluación de los enfoques integrados necesarios para el tratamiento de perros naturalmente infectados por Giardia.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración de Ética

Los animales utilizados en el presente estudio fueron muestreados tras la aprobación del comité de ética y bienestar animal de la Universidad de Nápoles Federico II (en italiano, Comitato Etico-scientifico per la Sperimentazione Animale dell’ Università di Napoli Federico II; número de protocolo PG/20170055343). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones de los autores

MG, LR, LC, LK, SMC, ARS y GC contribuyeron a la concepción y diseño del estudio. PP, AB, AV y MPM organizaron la base de datos y realizaron el análisis estadístico. MG, LR y LC escribieron el manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la revisión del manuscrito, leyeron y aprobaron la versión enviada.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Referencias