1 Introducción

La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad infecciosa altamente contagiosa y letal de los cerdos. El virus de la PPA (PPA), el patógeno etiológico, pertenece al género Asfivirus de la familia Asfiviridae. El virus de la PPA es un virus de ADN lineal de doble cadena, con un genoma de 170 a 193 kb de longitud y contiene entre 151 y 167 marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican más de 168 proteínas estructurales y no estructurales (1). La PPA es una enfermedad aguda, altamente infecciosa y mortal para los cerdos domésticos y los jabalíes, con una tasa de mortalidad de hasta el 100% (2). Los síntomas típicos y los cambios patológicos de la PPA se caracterizan por fiebre hemorrágica mortal, dificultad respiratoria, cianosis cutánea, trombocitopenia y sangrado extenso de los riñones, la mucosa gastrointestinal, los ganglios linfáticos y otros órganos (3, 4). La PPA se descubrió por primera vez en Kenia (África) en 1921 y, desde entonces, la PPA se ha diseminado en varios países del África subsahariana y se ha extendido a otros continentes fuera de África (5, 6). El primer brote de PPA en China se descubrió en 2018 en la provincia de Jilin, en el noreste de China, y luego se extendió rápidamente a casi todas las provincias del país en el plazo de un año, lo que provocó un golpe devastador para la industria porcina de China (7-9). Desde 2018, esta enfermedad altamente contagiosa se ha propagado rápidamente a muchos países del sudeste asiático y América (5, 10–12). Hasta la fecha, la PPA se ha descubierto en muchos países, principalmente en África, Asia, Europa y el Caribe americano (13, 14), y ha dañado seriamente la industria porcina en todo el mundo. La historia de la prevención y el control de la PPA en varios países muestra que, ante la ausencia de una vacuna específica y de medidas eficaces, la epidemia de PPA, una vez introducida, es muy difícil de erradicar en poco tiempo (15). En cuanto a China, la PPA es actualmente la enfermedad de máxima prioridad para la prevención y el control.

El virus de la peste porcina africana se puede clasificar en 24 genotipos sobre la base de la secuencia final 3′ del gen B646L del virus de la peste porcina africana (16, 17). Fuera de África, solo se han descubierto cepas de los genotipos I y II del virus de la PPA (6, 17, 18). En China, el virus de la PPA genotipo II se identificó por primera vez en 2018 y ha sido la cepa predominante que ha circulado en el campo a partir de entonces (19, 20). El virus de la peste porcina africana de genotipo I se descubrió por primera vez en 2020 y se ha confirmado en las provincias de Henan, Shandong y Guangxi en China (19, 21–23), pero su prevalencia y daño en todo el país requieren más investigación y evaluación. Recientemente, se descubrió en China la cepa naturalmente recombinante de los genotipos I y II, que demostró ser altamente virulenta y letal para los cerdos domésticos (24). Hoy en día, las cepas recombinantes de genotipo I, genotipo II y genotipo I y II del virus de la PPA prevalecen simultáneamente en China, y se han reportado coinfecciones de genotipo I y II (19, 23). Estas situaciones aumentan la complejidad de las cepas epidémicas y aumentan la dificultad de prevención y control, lo que inflige un daño significativo a la industria porcina de China (8, 9, 25). Por lo tanto, la detección e identificación rápida y precisa del genotipo circulante del virus de la PPA es de suma importancia para implementar medidas efectivas de prevención y control en la etapa temprana de la infección.

La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se ha utilizado ampliamente para detectar ácidos nucleicos virales en muchos laboratorios. Esta técnica molecular avanzada ha obtenido un reconocimiento y aceptación significativos debido a sus ventajas de baja probabilidad de contaminación, excelente precisión, sensibilidad superior, especificidad excepcional, conveniencia y eficiencia (26, 27). Sin embargo, las desventajas de la qPCR incluyen principalmente la fluctuación de los valores de Ct en función de la configuración del umbral, la alta sensibilidad a los inhibidores de la reacción y el complejo procedimiento de generación de curvas de calibración, lo que limita la aplicación de la qPCR. Por lo tanto, la PCR digital (dPCR) es una nueva y mejor opción para la detección de copias bajas de ácidos nucleicos virales. La dPCR es una tecnología emergente en el campo de la microbiología, y tiene como principales ventajas una alta especificidad y sensibilidad, una excelente repetibilidad, la capacidad de lograr una cuantificación absoluta sin necesidad de un gen de referencia, el valor de Ct y la curva estándar, y una fuerte tolerancia a los inhibidores de la PCR (28, 29). La dPCR se puede dividir en PCR digital de cristal (cdPCR) y PCR digital de gotas (ddPCR) (30, 31). Varios informes han establecido la dPCR para detectar el virus de la PPA (32-36), pero nunca se ha informado de una dPCR múltiple para detectar simultáneamente el virus de la PPA de genotipo I y genotipo II. Aquí, se desarrolló una cdPCR triplex para detectar y diferenciar el virus de la PPA genotipo I y el genotipo II, y se utilizó para analizar 1.275 muestras clínicas para validar su aplicabilidad en el campo.

2 Materiales y métodos

2.1 Recogida de muestras clínicas

De marzo de 2023 a agosto de 2023, se obtuvieron un total de 1.275 muestras clínicas (incluidos pulmones, bazo, riñón, amígdalas y ganglios linfáticos de cada cerdo) de 1.275 cerdos muertos de diferentes 4 granjas porcinas, 6 plantas de tratamiento inocuas y 17 mataderos en la provincia de Guangxi, en el sur de China. Los cerdos muertos mostraron diferentes manifestaciones como fiebre, diarrea, tos y/o enrojecimiento, cianosis o sangrado en la piel. Se obtuvo el consentimiento por escrito de los propietarios de los animales, y el grupo de investigación se comprometió a no divulgar la información detallada sobre las granjas porcinas relevantes y la incidencia de enfermedades en las piaras de cerdos en este estudio. Estos tejidos se transportaron a ≤4 °C en 12 h al laboratorio y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

2.2 Obtención de cepas virales

El virus de la fiebre aftosa (virus de la fiebre aftosa, cepa O/Mya98/XJ/2010), el virus de la influenza porcina (VIS, cepa TJ), el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV, cepa JXA1-R), el virus de la peste porcina clásica (PPC, cepa C), el virus diarreico epidémico porcino (PEDV, cepa CV777), el virus de la pseudorrabia (PRV, cepa Bartha-K61) y el circovirus porcino tipo 2 (PCV2, cepa ZJ/C) se obtuvieron de una empresa comercial (Huapai Co., Ltd., Chengdu, China). Las muestras clínicas de los genotipos I y II del virus de la PPA se obtuvieron del Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades Animales (CADC) de Guangxi, China.

2.3 Diseño de cebadores y sondas

Se diseñaron tres conjuntos de cebadores y sondas específicos, tal como lo describieron Qian et al. en el informe anterior (23). Los cebadores y la sonda dirigidos al gen B646L se utilizaron para detectar los 24 genotipos diferentes del virus de la PPA, los dirigidos al gen F1055L se utilizaron para detectar específicamente el genotipo I del virus de la PPA y los dirigidos al gen E183L se utilizaron para detectar específicamente el genotipo II del virus de la PPA. Los cebadores y las sondas se muestran en la Tabla 1.

2.4 Extracción de ácidos nucleicos

Los tejidos clínicos fueron homogeneizados, liofilizados-descongelados, vortexados y centrifugados como lo describen Qian et al. (23). Los ácidos nucleicos totales se extrajeron de sobrenadantes de 200 μL utilizando el extractor automatizado de ácidos nucleicos GeneRotex 96 y el kit de aislamiento de ADN/ARN viral 4.0 (TIANLONG, Xian, China) de acuerdo con las construcciones del fabricante, y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

2.5 Generación de las construcciones plásmidas estándar

Las construcciones plásmidas estándar se generaron de acuerdo con Qian et al. (23) con modificaciones menores. Los ácidos nucleicos totales de las muestras positivas para el virus de la peste porcina africana se utilizaron como plantillas para amplificar los fragmentos diana mediante PCR utilizando los cebadores diseñados (Tabla 1). Los productos de amplificación se purificaron utilizando el kit de purificación de fragmentos de ADN MiniBEST Ver.4.0 (TaKaRa, Dalian, China), se clonaron en el vector pMD18-T (TaKaRa, Dalian, China) y luego se transformaron en células de E. coli DH5α (TaKaRa, Dalian, China). Los clones positivos se cultivaron a 37 °C durante 22-24 h, y las construcciones de plásmidos estándar recombinantes se extrajeron utilizando el kit de extracción de plásmidos MiniBEST Ver.5.0 (TaKaRa, Dalian, China). Los plásmidos se enviaron a IGE biotechnology LTD (Guangzhou, China) para su secuenciación utilizando el método de secuenciación Sanger, y las secuencias de los fragmentos insertados se confirmaron mediante el análisis BLAST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).¹ A continuación, las construcciones plásmidas correctas se denominaron p-dASFV-B646L, p-dASFV-F1055L y p-dASFV-E183L, respectivamente, y se utilizaron para establecer la cdPCR triplex.

Las construcciones plásmidas estándar se midieron utilizando el espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE.UU.) a 260 nm y 280 nm, y determinaron sus concentraciones utilizando la siguiente fórmula: número de copias (copias/μL) = (concentración de constructo plásmido × 10⁻⁹ × 6.02 × 10²³)/ (660 Dalton/bases × longitud del ADN).

2.6 Determinación de las condiciones de reacción

El sistema de cristal de zafiro Naica™ (Stilla Technologies™, Villejuif, Francia) se utilizó para optimizar varios parámetros de la cdPCR, es decir, la temperatura de recocido, los ciclos de reacción y las concentraciones de cebador y sonda. El sistema de reacción de cdPCR triplex se fijó en 25 μL. Estas condiciones se optimizaron para maximizar la precisión y fiabilidad de la reacción para una detección precisa y sensible de los analitos objetivo. Los procesos de la cdPCR triplex, incluida la preparación de los chips de zafiro, la amplificación de partición y PCR, la adquisición de imágenes de fluorescencia a tres colores y el análisis de los cristales de gotas, se realizaron de acuerdo con el manual de operación proporcionado por el fabricante (Stilla Technologies™, Villejuif, Francia).

2.7 Generación de las curvas estándar

Para generar las curvas estándar, se mezclaron tres construcciones de plásmidos estándar y se diluyeron en serie 10 veces, y las mezclas con concentraciones de reacción final que oscilaron entre 1,0 × 10⁴ a 1.0 × 10⁰ copias/μL se utilizaron como plantillas.

2.8 Evaluación de la especificidad

Para evaluar la especificidad se utilizaron los ácidos nucleicos totales de los siguientes virus: genotipos I y II de PPA, PCV2, PRV, PRRSV, PEDV, FMDV, CSFV y VIS. El agua destilada libre de nucleasa y las muestras de tejido negativas se utilizaron como controles negativos.

2.9 Evaluación de la sensibilidad

Las mezclas de tres construcciones plásmidas se diluyeron en serie 10 veces. Las mezclas con concentraciones de reacción final que oscilan entre 1,0 × 10⁵ a 1.0 × 10⁻² Se utilizaron copias/μL como plantillas, y los límites de detección (LOD) se determinaron mediante análisis de distribución de Poisson.

Además, se utilizaron como plantillas las mezclas con concentraciones de reacción final que oscilaron entre 250 y 0,25 copias/reacción, y los LOD se analizaron mediante regresión PROBIT en el software SPSS 26.0.² y las cifras relacionadas se generaron utilizando el software Statacorp stata 17.³

2.10 Evaluación de la repetibilidad

Para evaluar la repetibilidad, se utilizaron las mezclas de tres construcciones plásmidas a concentraciones finales de 1,0 × 10⁴, 1.0 × 10³y 1,0 × 10² se utilizaron copias/μL para realizar las pruebas intraensayo e interensayo, y se calcularon los coeficientes de variación (CV).

2.11 Evaluación de las muestras clínicas

La cdPCR triplex desarrollada y la qPCR triplex reportada por Qian et al. (23) se utilizaron para analizar 1.275 muestras clínicas obtenidas en la provincia china de Guangxi. Se evaluó la sensibilidad clínica y la especificidad de la cdPCR triplex y se determinaron las tasas de concordancia de los resultados de detección entre ambos métodos mediante el programa SPSS 26.0 (ver nota 2).

3 Resultados

3.1 Generación de plásmidos patrón

Los fragmentos diana de los genes B646L, F1055L y E183L del virus de la PPA se obtuvieron mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores de la Tabla 1, seguida de purificación y ligadura en el vector pMD18-T, y luego se transformaron en células competentes para E. coli DH5α. Se cultivaron los clones positivos y se extrajeron las construcciones plásmidas. Finalmente, se determinó que las concentraciones de tres construcciones plásmidas estándar denominadas p-dASFV-B646L, p-dASFV-F1055L y p-dASFV-E183L fueron de 3,69 × 10¹⁰, 1,81 × 10¹⁰y 1,0 × 10¹⁰ copias/μL, respectivamente. Todas las construcciones plásmidas se diluyeron a 1,0 × 10¹⁰ copias/μL, y almacenado a -80 °C hasta su uso.

3.2 Determinación de las condiciones de reacción

La cdPCR triplex se desarrolló utilizando el sistema de cristal de zafiro Naica™ (Stilla Technologies™, Villejuif, Francia). Después de experimentos para optimizar combinaciones de cebadores y sondas a diferentes concentraciones, temperaturas de recocido y ciclos de reacción, se obtuvieron las condiciones óptimas de reacción y se estableció una cdPCR triplex (Figura 1). El sistema de reacción contenía PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, EE. UU.), sal sódica fluoresceína (1 μM) (Apexbio Biotechnology, Beijing, China), tres cebadores y sondas, las mezclas de tres construcciones de plásmidos y agua libre de nucleasas (Tabla 2). El procedimiento de amplificación: 95 °C durante 30 s, 45 ciclos de 95 °C durante 5 s y 56 °C durante 30 s. Después de la amplificación, los chips Sapphire (Stilla Technologies, Francia) se trasladaron al Naica™ Prism3 (Stilla Technologies, Francia), y la concentración absoluta de cada muestra se informó automáticamente con 3 imágenes de alta resolución.

3.3 Generación de las curvas estándar

Para obtener las curvas estándar de la cdPCR triplex, el plásmido estándar construye p-dASFV-B646L, p-dASFV-F1055L y p-dASFV-E183L en concentraciones finales de 1.0 × 10⁴ a 1.0 × 10⁰ Se utilizaron copias/μL como plantillas. Los resultados mostraron que las pendientes y R² fueron 0,982 y 0,9996, 0,9 y 0,9972, y 0,931 y 0,9973, para los genes B646L, F1055L y E183L, respectivamente (Figura 2).

3.4 Análisis de especificidad

Para analizar la especificidad de la cdPCR se utilizaron los ácidos nucleicos totales del virus de la peste porcina africana genotipo I, el virus de la peste porcina africana genotipo II, el PCV2, el PRV, EL PRRSV, EL PEDV, EL FMDV, EL CSFV y el VIS. Los resultados mostraron que las gotitas positivas solo podían obtenerse de los genotipos I y II del virus de la PPA, pero no de los otros virus porcinos (Figura 3).

3.5 Análisis de sensibilidad

Con el fin de evaluar el LOD de la cdPCR triplex, se utilizaron las mezclas de tres construcciones plásmidas p-dASFV-B646L, p-dASFV-F1055L y p-dASFV-E183L de 1,0 × 10⁵ a 1.0 × 10⁻² Se utilizaron copias/μL (concentración final) como plantillas. Los resultados mostraron que el número de gotas positivas disminuyó en un gradiente a medida que disminuyeron las concentraciones de las mezclas. De acuerdo con la distribución de Poisson, los LOD de p-dASFV-B646L, p-dASFV-F1055L y p-dASFV-E183L fueron de 6,5, 4,5 y 5,75 copias/reacción, respectivamente (Figura 4).

Se utilizaron las tres construcciones de plásmidos mezcladas, p-dASFV-B646L, p-dASFV-F1055L y p-dASFV-E183L con un rango de 250 a 0,25 copias/reacción (concentración final) para determinar el número de gotas positivas y las tasas de acierto. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Los LOD de las tres construcciones de plásmidos analizadas mediante análisis de regresión PROBIT mostraron que los LOD de p-dASFV-B646L, p-dASFV-F1055L y p-dASFV-E183L fueron 5,120 (3,950-10,500 con un intervalo de confianza [IC] del 95 %), 4,218 (3,456-7,523 con IC del 95 %) y 4,588 (3,695-7,821 con un IC del 95 %), respectivamente (Figura 5).

3.6 Análisis de repetibilidad

Las mezclas de tres construcciones plásmidas con la concentración final de 10⁴, 10³y 10² Se utilizaron copias/μL como plantillas. Los resultados mostraron que los CV intraensayo fueron del 1,24 al 2,01 % y los CV entre ensayos del 1,30 al 2,53 % (Tabla 4).

3.7 Ensayo de las muestras clínicas

Se utilizó la cdPCR triplex establecida para evaluar las 1.275 muestras clínicas de la provincia de Guangxi. Los resultados mostraron que se detectaron un total de 118 (9,25%, 118/1.275) muestras positivas para el virus de la PPA, incluyendo 64 (5,02%, 64/1.275) muestras positivas de genotipo I, 41 (3,22%, 41/1.275) muestras positivas de genotipo II y 13 (1,02%, 13/1.275) muestras positivas de coinfección con genotipos I y II (Tabla 5). Se muestra que los diagramas de puntos 3D muestran los datos de coinfecciones en muestras clínicas mediante el uso de diagramas de dispersión tridimensionales para permitir una visualización inmediata (Figura 6).

Las 1.275 muestras clínicas también se analizaron mediante la qPCR triplex reportada por Qian et al. (23). Los resultados mostraron que se detectaron un total de 105 (8,24%, 105/1.275) muestras positivas para el virus de la PPA, incluyendo 58 (4,55%, 58/1.275) muestras positivas de genotipo I, 36 (2,82%, 36/1.275) muestras positivas de genotipo II y 11 (0,86%, 11/1.275) muestras positivas de coinfección con genotipos I y II (Tabla 6). Además, la sensibilidad clínica y la especificidad clínica de la cdPCR triplex fueron de 100 y 98,89%, respectivamente (Tabla 7). Las concordancias entre la cdPCR triplex y la qPCR triplex fueron superiores al 98,98% (Tabla 6).

4 Discusión

La PPA ha causado importantes pérdidas económicas a los cerdos domésticos y a los jabalíes debido al curso agudo de la enfermedad y a la elevada tasa de mortalidad (2). La Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) identifica la PPA como una de las enfermedades de la lista. La peste porcina africana era endémica en el continente africano antes de 1957, pero se extendió fuera de este continente a partir de entonces. La PPA de genotipo II, altamente patogenética, se detectó por primera vez en China en 2018 (7), y la PPA de genotipo I, relativamente menos virulenta, se descubrió por primera vez en 2020 (21). Desde el 2018, se han notificado casos de PPA en muchos países asiáticos (5, 10, 11). Hasta la fecha, la PPA se ha fundado en una multitud de países de África, Asia, Europa y América (10-14). Aunque la PPA es epidémica en todo el mundo, los genotipos I y II del virus de la PPA fueron los dos únicos genotipos de los 24 genotipos del virus de la peste porcina africana que se han identificado fuera del continente africano hasta ahora (16-18). Sin embargo, debido al aumento uniforme del comercio mundial y al volumen de animales y productos animales importados y exportados, siempre existe el riesgo de que el virus de la PPA se propague desde el continente africano a otros continentes (37-39). El desarrollo de un método rápido, fiable y preciso para la detección, vigilancia y diagnóstico del virus de la PPA es muy urgente para los países en los que circula la PPA. La qPCR se ha utilizado ampliamente para detectar ácidos nucleicos virales en muchos laboratorios, ya que esta técnica es conocida por su alta sensibilidad, excelente especificidad y fiabilidad. Permite la identificación precisa y eficiente de las infecciones virales, lo que permite intervenciones oportunas y específicas para la prevención y el control de la enfermedad (29, 30). Varios informes han desarrollado qPCR para detectar el virus de la peste porcina africana y distinguir los genotipos I y II del virus de la peste porcina africana (23, 40-43). Sin embargo, la qPCR tiene las desventajas de la fluctuación de los valores de Ct en función de la configuración del umbral, la alta sensibilidad a los inhibidores de la reacción y el complejo procedimiento de generación de curvas de calibración. Por lo tanto, la dPCR es una nueva y mejor opción para la detección de ácidos nucleicos virales. La dPCR tiene las ventajas de la cuantificación absoluta de la plantilla independiente de los valores de Ct y las curvas estándar, la excelente sensibilidad y precisión para cargas bajas de plantillas y la baja sensibilidad a los inhibidores de la PCR. En varios informes se ha establecido la dPCR para la detección del virus de la PPA (32-36), pero no se ha establecido ninguna dPCR para detectar simultáneamente los genotipos I y II del virus de la PPA. En este estudio, se desarrolló una cdPCR triplex para detectar y diferenciar el virus de la PPA genotipo I y el genotipo II. Además de las ventajas mencionadas anteriormente de la cdPCR, la cdPCR múltiplex puede hacer un uso completo del aparato para detectar varios virus en una reacción al mismo tiempo, lo que disminuye drásticamente la tasa de detección. De acuerdo con nuestro cálculo anterior, cuesta alrededor de US $ 17.67 / muestra por la dPCR singleplex, US $ 7.86 / muestra por la dPCR múltiplex y US $ 3.83 / muestra por la qRT-PCR múltiplex [33]. Esto ayuda a que la cdPCR triplex establecida en este estudio se aplique para la detección de alto rendimiento de muestras clínicas, especialmente para las muestras clínicas de baja carga viral.

En este estudio, se diseñaron tres pares de cebadores específicos y las sondas correspondientes basados en el gen B646L, el gen F1055L y el gen E183L, respectivamente. Los cebadores y la sonda dirigidos al gen B646L se utilizaron como cebadores y sondas universales para detectar 24 genotipos de PPA. Las construcciones plasmídicas sintetizadas de 24 genotipos de PPA se han utilizado para validar y confirmar la viabilidad de los cebadores y la sonda (23). Los cebadores y la sonda dirigidos al gen F1055L se utilizaron para amplificar específicamente el virus de la PPA genotipo I, y los cebadores y la sonda dirigidos al gen E183L se utilizaron para amplificar específicamente el virus de la PPA del genotipo II. Después de optimizar los parámetros de la reacción, como las concentraciones de cebadores y sondas, las temperaturas de recocido y los ciclos de reacción, se desarrolló con éxito una cdPCR triplex. El ensayo logró una especificidad notable, asegurando que solo se amplificaran y detectaran los ácidos nucleicos virales diana del virus de la PPA. La sensibilidad del ensayo se ha mejorado considerablemente, obteniendo los LOD de 5.120, 4.218 y 4.588 copias/reacción para los genes B646L, F1055L y E183L, respectivamente, mientras que la qPCR multiplex utilizando los mismos cebadores y sonda tuvo los LOD de 399.647, 374.409, 355.083 copias/reacción para los genes B646L, F1055L y E183L, respectivamente (23), lo que indica que la cdPCR triplex tuvo 78,06, 88,76, 77,39 veces mayor que las de la qPCR triplex, respectivamente. La excelente sensibilidad del ensayo le permite detectar cargas virales muy bajas, lo cual es crucial para la etapa temprana de la infección. El análisis de repetibilidad del ensayo fue excelente, con los CV intraensayo e interensayo entre 1,24 y 2,53%. La R² Los valores de las curvas estándar fueron ≥ 0,997, lo que indica una buena relación lineal entre las plantillas iniciales y los valores positivos de gota. El método cdPCR ofrece un LOD notablemente más bajo en comparación con la qPCR (23), lo que lo hace más adecuado para evaluar las muestras clínicas con cargas virales bajas. La cdPCR triplex tuvo una sensibilidad clínica y una especificidad de 100 y 98,89%, respectivamente, y concordancia superior al 98,98% con la qPCR triplex de referencia cuando se utilizaron para evaluar las 1.275 muestras clínicas. Estos avances han mejorado significativamente la precisión y fiabilidad de la cdPCR triplex desarrollada para la detección de ácidos nucleicos virales.

La cdPCR triplex desarrollada se utilizó para evaluar 1.275 muestras clínicas recogidas entre marzo de 2023 y agosto de 2023 en la provincia de Guangxi. Las tasas de positividad de los genotipos I, II y coinfección de los genotipos I + II fueron de 5,02, 3,22 y 1,02%, respectivamente, con una tasa de positividad total del 9,25% en las muestras clínicas, lo que indica que el virus de la PPA sigue siendo epidémico en la provincia de Guangxi. Sin embargo, en comparación con los datos anteriores notificados en la provincia de Guangxi (19, 22, 23, 33, 36, 44-46), la tasa de positividad del virus de la PPA en la provincia de Guangxi en este estudio disminuyó significativamente. En la provincia china de Guangxi, las tasas de positividad notificadas del virus de la PPA en muestras clínicas recogidas durante diferentes períodos fueron las siguientes: 57,14 % (192/336) de enero de 2019 a diciembre de 2020 (19), 45,58 % (232/509) de octubre de 2018 a diciembre de 2020 (22), 43,75 % (168/384) de octubre de 2018 a diciembre de 2019 (44), 30,10 % (87/289) de enero de 2018 a marzo de 2021 (33), 25,63% (293/1.143) de febrero de 2018 a marzo de 2021 (45), 14,17% (214/1.510) de enero de 2022 a diciembre de 2022 (36), 12,60% (534/4.239) de enero de 2021 a diciembre de 2021 (46), 8,16% (287/3.519) de marzo de 2019 a febrero de 2023 (23), 9,25% (118/1.275) de marzo de 2023 a agosto de 2023 (este estudio). En general, las tasas de positividad de la PPA en la provincia de Guangxi han disminuido gradualmente desde 2018, el año en que la PPA estalló por primera vez en China. Además, cabe destacar que la tasa de positividad del genotipo I fue mayor que la del genotipo II en este estudio, mientras que el genotipo II fue el genotipo predominante en los informes anteriores (19, 22, 23, 33, 36, 44-46), lo que indica que el genotipo I podría haberse convertido en el principal genotipo circulante en la provincia de Guangxi en 2023. lo que debe confirmarse a través de investigaciones epidemiológicas más amplias y prolongadas. Desafortunadamente, hay pocos informes sobre los resultados del monitoreo del virus de la PPA en varias provincias de China, por lo que no podemos conocer la situación epidémica actual en varias regiones. La disminución de la prevalencia del virus de la peste porcina africana en la provincia de Guangxi sugiere que las medidas de prevención y control llevadas a cabo en China fueron muy eficaces. Las principales medidas incluyeron una estricta bioseguridad, una detección precisa y un diagnóstico rápido, descartando a los cerdos positivos para el virus de la peste porcina africana en la fase muy temprana de la infección (47, 48). Por lo tanto, un método rápido, sensible y preciso para detectar el virus de la PPA es vital para identificar con precisión a los cerdos infectados en etapa temprana y eliminarlos de manera decisiva en los puntos designados. Este ensayo se puede utilizar para detectar de manera precisa y eficiente las cepas de los genotipos I y II del virus de la PPA, lo que permite intervenciones rápidas y específicas para prevenir una mayor propagación y mitigar el impacto en las poblaciones de cerdos.

5 Conclusión

Se desarrolló una cdPCR triplex rápida, sensible y precisa para detectar y diferenciar el virus de la PPA de genotipo I y el genotipo II. El ensayo altamente sensible, específico y reproducible es adecuado para la detección e investigación del virus de la PPA en muestras clínicas. Además, las cepas de genotipo I del virus de la peste porcina africana son las cepas circulantes más importantes que las cepas de genotipo II en la provincia de Guangxi en China en la actualidad.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración ética

Este estudio fue aprobado por el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades Animales (CADC) de Guangxi (No. 2020-A-01). El CADC de Guangxi fue aprobado por el Ministerio de Agricultura y Asuntos Rurales de China para la recolección y detección del virus de la PPA en muestras clínicas (número de aprobación: 2018-154-25). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales.

Contribuciones de los autores

KS: Redacción – revisión y edición, adquisición de fondos. XQ: Redacción – borrador original, Metodología. YS: Redacción – borrador original, Metodología. HW: Escritura – borrador original, Validación, Investigación. YP: Escritura – borrador original, software, curación de datos. FL: Redacción – borrador original, administración del proyecto. QZ: Escritura – borrador original, visualización. SM: Redacción, revisión y edición, administración de proyectos. LH: Redacción – borrador original, Validación, Investigación. ZL: Redacción, revisión y edición, adquisición de fondos.

Financiación

El/los autor/es declaran/n que se recibió apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Este estudio contó con el apoyo del Programa Clave de Investigación y Desarrollo (No. AB21238003) de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Guangxi (China) y el Programa de Ciencia y Tecnología Agrícola (Nº 202031) de la Oficina Agrícola y Rural de Guangxi (China).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Notas

Referencias