1. Introducción

Las afecciones musculoesqueléticas degenerativas crónicas (MSK), como la osteoartritis (OA), causan una morbilidad significativa en perros de trabajo y mascotas en el Reino Unido (1, 2). La osteoartritis, que afecta al 2,5% de la población canina del Reino Unido, es una de las causas más comunes de dolor crónico en perros (3). Aunque la OA es predominantemente una enfermedad de la articulación, con frecuencia resulta en patología asociada de tejidos blandos en la cápsula articular y estructuras de soporte a medida que la enfermedad progresa (4). Los cambios articulares provocan dolor y debilidad que causan la descarga de la articulación afectada con sobrecarga compensatoria en otras áreas del aparato locomotor y la columna vertebral (5-10). Sin embargo, sorprendentemente hay poca evidencia publicada que vincule la biomecánica alterada con las enfermedades musculoesqueléticas concurrentes (TME), pero la prevalencia de TME múltiple en un paciente es común (11). Aunque hay muchas afecciones degenerativas primarias que afectan el sistema MSK, los cambios secundarios con frecuencia complican el cuadro clínico. Muchos pacientes presentan patologías multifactoriales que involucran varios tipos de tejidos, lo que hace que estos casos sean difíciles de tratar, requieren un enfoque multimodal y pueden conducir a fracasos del tratamiento cuando el manejo de una afección no se aplica a otra. El manejo adecuado de la TME requiere un diagnóstico preciso para evaluar completamente la afección y un enfoque holístico del tratamiento y, como tal, una única opción terapéutica para la TME múltiple sería beneficiosa en medicina humana y veterinaria.

Los objetivos del tratamiento son reducir el dolor, disminuir la cojera y mejorar significativamente la calidad de vida (CV) del paciente. Las opciones quirúrgicas, que incluyen reemplazos articulares totales o parciales, artrodesis articular, intervenciones artroscópicas y tenotomias, destinadas a mejorar la función de las extremidades y reducir el dolor, tienden a ser procedimientos de rescate no curativos que tienen complicaciones potencialmente graves, especialmente en el caso de la displasia de codo (12-16). Las opciones de tratamiento adicionales, incluidos los analgésicos, los medicamentos antiinflamatorios y de anticuerpos monoclonales, así como los suplementos nutricionales, tienen una eficacia limitada, pueden causar efectos secundarios y no son curativos (17). En contraste, la medicina regenerativa (RM) que utiliza células estromales mesenquimales (MSC), que tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en múltiples tipos de células, se ha convertido cada vez más en un tratamiento clínico efectivo para MSD tanto en pacientes humanos como veterinarios (18-22). Además de su potencial reparador, poseen propiedades antiinflamatorias e inmunomoduladoras que les permiten controlar la inflamación y el dolor (23-27). Además, varios estudios de RM canina han incluido plasma rico en plaquetas (PRP) con MSC, ya que la combinación se considera sinérgica en términos de efectos regenerativos (22, 28).

Los estudios clínicos veterinarios que utilizan tratamientos intraarticulares de MSC en articulaciones osteoartríticas han demostrado resultados positivos y efectivos en términos de reducción de la cojera y el dolor, y han demostrado ser seguros, ver Voga et al. para una revisión exhaustiva (19). Sin embargo, el seguimiento a largo plazo, incluido el diagnóstico por imágenes de su potencial modificador de la enfermedad, carece de medicina humana y veterinaria (19).

Las medidas de resultado para los estudios ortopédicos incluyen medidas objetivas como el análisis de la placa de fuerza y la marcha cinemática, las medidas de distribución del peso (análisis de postura), el rango de movimiento articular (ROM) y la algometría de presión en casos de enfermedad lumbosacra (LSD). Si bien el análisis de la placa de fuerza y la marcha se utilizan con mayor frecuencia, una publicación reciente concluyó que los estudios que utilizan una plataforma de distribución de peso (análisis de postura) para monitorear la respuesta al tratamiento en perros con enfermedad ortopédica serían «clínicamente valiosos y útiles para establecer estándares de investigación» (29). Del mismo modo, la goniometría se ha sugerido como una técnica adecuada para la evaluación objetiva de resultados en estudios ortopédicos (30, 31). La algometría de presión (AP), o prueba nociceptiva mecánica (MNT), es una medida objetiva para cuantificar los umbrales nociceptivos y su uso en animales se ha descrito en varias publicaciones (32-37). Lane y Hill evaluaron la AF para medir el dolor muscular en la unión toracolumbar en perros (36). Concluyeron que hubo un aumento positivo en el TMN, que se relacionó con una mejor comodidad muscular en esta región, con el tiempo en los dos grupos de tratamiento, pero no en el grupo de control. Proponen que la AF es una medida válida de TMN en la región lumbar en perros y sirve como una medida objetiva del dolor muscular. Aunque no se ha definido un cambio clínicamente relevante en las lecturas de AF para ubicaciones anatómicas específicas en perros, cualquier aumento después del tratamiento sugeriría una reducción del dolor (38) que sería clínicamente significativa incluso si ese cambio fuera pequeño. Varios estudios han demostrado que los aumentos en el umbral del dolor por presión se asocian con mejores puntuaciones de dolor utilizando instrumentos de metrología clínica en humanos con dolor lumbar crónico en comparación con ensayos controlados con placebo (39, 40).

Además de las medidas de resultado objetivas que son útiles para diagnosticar la extremidad afectada y medir el cambio, hay una serie de instrumentos subjetivos de metrología clínica (CMI) de uso general. Estos toman la forma de cuestionarios completados por el propietario diseñados para medir la limitación funcional impuesta por la enfermedad e incluyen el Inventario de Dolor Breve Canino (CBPI), la Osteoartritis de Liverpool en Perros (LOAD), el Índice de Dolor Crónico de Helsinki (HCPI) y el Índice Ortopédico Canino (COI) (41).

Sin embargo, en 2006, el Programa de Medidas de Resultados Caninos (COMP), formado con la intención de proporcionar mecanismos y herramientas para mejorar la calidad y el impacto de los estudios clínicos en ortopedia veterinaria, publicó pautas que sugerían que, además de al menos un resultado funcional, como cinética, cinemática, monitores de actividad y / o un CMI informado por el propietario, todos los estudios deberían incluir una medida de resultado validada de calidad de vida relacionada con la salud (CVRS) (42).

Los instrumentos de calidad de vida relacionados con la salud pueden ser específicos, centrados en condiciones particulares (específicos de la enfermedad), o pueden ser genéricos, diseñados para su uso en una variedad de contextos. Los instrumentos específicos de la enfermedad pueden ser más sensibles al cambio clínico, pero los instrumentos genéricos se han utilizado con éxito para cuantificar una variedad de impactos relacionados con enfermedades específicas, incluida la OA, en personas (43). De los tres instrumentos genéricos caninos disponibles actualmente (44-46), solo VetMetrica™ (46) está validado para su uso en perros enfermos. VetMetrica™ es un instrumento de cuestionario estructurado basado en el comportamiento en línea, diseñado para ser completado en una computadora o cualquier plataforma móvil por el dueño del perro en aproximadamente 5 minutos (46). Genera un perfil de CVRS para el perro con puntuaciones en cuatro dominios de CV y se ha utilizado previamente para medir la mejoría en un grupo de perros con OA tratados con AINE (47), y con RM (48).

Si bien la mayoría de los estudios informan un cambio estadísticamente significativo después del tratamiento, la capacidad de respuesta en un instrumento de medición clínica es aquella propiedad que garantiza que el instrumento pueda detectar diferencias en el estado de salud que son importantes para el médico y / o para el paciente / dueño del perro y estas no necesitan ser estadísticamente significativas (41). La capacidad de respuesta se puede cuantificar calculando una diferencia mínima importante (MID) que se define como «la diferencia más pequeña en la puntuación en el resultado de interés que los pacientes informados o los representantes informados perciben como importante, ya sea beneficioso o perjudicial, y que llevaría al paciente o al médico a considerar un cambio en el manejo» (49). El MID ha sido publicado para cada dominio de CV en el instrumento VetMetrica™ (50). En aquellos instrumentos de medición en los que no hay MID publicado, la importancia clínica puede demostrarse mediante el cálculo de un tamaño del efecto entre los grupos control y tratamiento o entre los grupos pre y post-tratamiento (51).

A pesar de la extensa investigación y la considerable promesa mostrada por RM para el tratamiento de TME en pacientes caninos y equinos (19, 52), los orígenes, el procesamiento y la calidad de las células estromales y el PRP difieren entre los diversos protocolos de tratamiento, lo que dificulta la comparación de estudios, un problema destacado por Guest et al. (53). Además, no hay informes de grandes estudios en los que una variedad de razas de perros con TME natural fueron tratadas con RM. También faltan datos sobre protocolos, duración de las respuestas al tratamiento y uso en estados naturales de enfermedades como la OA en animales de compañía (19). El presente estudio aborda muchas de estas preocupaciones mediante el uso de varias medidas de resultado validadas en una gran muestra de perros propiedad del cliente con TME crónica que no responde registrada hasta 4 años. El objetivo de este estudio fue investigar la eficacia del tratamiento autólogo con MSC para la TME degenerativa crónica previamente no respondida en perros, mediante el análisis retrospectivo de los datos de los registros clínicos de una sola práctica veterinaria especializada en RM.¹ Como tal, este es un ejemplo de datos del mundo real (RWD) que es definido por la Asociación de la Industria Farmacéutica Británica como «datos que se recopilan fuera de las restricciones controladas de los ensayos clínicos aleatorios convencionales (RCT) para evaluar lo que está sucediendo en la práctica clínica normal» (54). Si bien los ECA proporcionan evidencia de eficacia, los estudios que usan RWD tienen una mayor generalización y brindan evidencia de efectividad en entornos del mundo real (55). Siguiendo el programa de Evidencia del Mundo Real (RWE) de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA), RWD se ha vuelto cada vez más importante en la atención médica humana para respaldar una amplia gama de decisiones regulatorias y de atención médica (56, 57). Además de los datos generados por una selección de medidas de resultado objetivas, se obtuvieron datos de CVRS informados por el propietario. Nuestra hipótesis fue que el tratamiento con RM produciría una mejoría estadística y clínicamente relevante significativa en la función de MSK y la CV en los perros afectados.

2. Materiales y métodos

2.1. Declaración ética

Este estudio se realizó de acuerdo con la política de investigación científica y compromiso de Marte (https://www.mars.com/about/policies-and-practices/scientific-engagement). Todos los dueños de perros dieron su consentimiento informado por escrito para que se utilizaran datos anónimos de mascotas en el estudio. El Panel de Revisión de Ética de RCVS aprobó el estudio.

2.2. Detalles del caso y criterios de inclusión

Se revisaron los registros médicos de los perros propiedad del cliente diagnosticados con TME crónica que fueron tratados con RM desde septiembre de 2017 hasta mayo de 2021. Los criterios de inclusión para la recolección de datos fueron los siguientes: perros con TME para los cuales la terapia convencional no había tenido éxito según el veterinario remitente; y cuyos propietarios habían completado al menos dos series de evaluaciones de CVRS; y al menos una medida objetiva de resultado. Todos los casos fueron manejados por un solo médico (autor AA) que tenía una amplia experiencia en RM habiendo tratado a más de 600 perros durante 9 años con MSC autólogas, asegurando una evaluación clínica consistente, tratamiento y resultados de medición objetivos. Para cada perro, todas las evaluaciones de CVRS fueron completadas por el mismo propietario.

En la presentación inicial, todos los perros se sometieron a un examen físico ortopédico y neurológico completo, incluido el análisis de la postura y la observación de la marcha. Se realizó radiografía y ecografía musculoesquelética (MSK US), que se realizó en articulaciones pareadas que permitieron comparar las mediciones y la ecogenicidad de las estructuras anatómicas entre miembros contralaterales, para llegar a un diagnóstico definitivo. La confirmación de que el tratamiento convencional para los pacientes con TME no había tenido éxito se determinó revisando la historia clínica y demostrando dolor persistente, cojera o discapacidad a pesar de los medicamentos analgésicos apropiados y las intervenciones previas.

La gravedad de la osteoartritis se calificó sobre la base de los hallazgos radiográficos con descripciones clínicas y ecográficas adicionales, utilizando criterios establecidos definidos por el autor AA (material suplementario 1). Cuando no había evidencia radiográfica de OA, pero la ecografía reveló un derrame articular y sinovitis, o defectos del cartílago, entonces estas articulaciones se clasificaron como con OA de grado 1.

Los hallazgos clínicos y diagnósticos se discutieron con los propietarios y varias opciones de tratamiento, incluida la cirugía, las terapias físicas y el manejo farmacológico alterado, explicaron. Cuando se decidió un plan de tratamiento que involucraba RM, el perro se sometió a la recolección de grasa para la extracción y cultivo de células madre. Los pacientes cuyo plan de tratamiento no incluía RM fueron devueltos al veterinario remitente para su manejo.

Para los pacientes que ya recibían fisioterapia (como fisioterapia o hidroterapia), esto se suspendió después de la cosecha de grasa y no se reanudó hasta después de los exámenes posteriores al tratamiento a las 12 semanas para tratamientos únicos y 18 semanas para dos tratamientos. Las terapias físicas no se iniciaron hasta que se logró una cicatrización suficiente en tendones y ligamentos (según lo evaluado por MSK US) y se determinó que el dolor estaba bajo control.

2.3. Recogida y preparación del MSC

2.3.1. Extracción de tejido adiposo y sangre

Los perros fueron anestesiados utilizando un protocolo estándar y, después de la preparación quirúrgica del sitio, se recolectaron al menos 5 g de tejido adiposo del ligamento falciforme a través de una incisión craneal de laparotomía craneal al ombligo. El tejido adiposo se colocó inmediatamente en un recipiente estéril con solución salina y se selló. Se recogió una muestra de sangre no coagulada, cuyo volumen se determinó por la cantidad de células madre necesarias para el cultivo y el peso corporal y el volumen sanguíneo del paciente, en condiciones asépticas de la vena yugular. El tejido adiposo y la sangre se empaquetaron en cajas frías con paquetes refrigerados (4-10 ° C), enviados a un laboratorio especializado en cultivo celular veterinario.² y procesado dentro de las 24 h de la cosecha.

2.3.2. Tratamiento de tejidos y cultivo de MSC

En el laboratorio, las MSC se extrajeron de las muestras de tejido adiposo descritas por Smitzi et al. (58). Una vez en cultivo en el paso 0 se incubaron a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ en medio de expansión (EM) (medio de Dulbecco’s Modified Eagles Medium de alta glucosa (DMEM, ThermoFisher Scientific, Swindon, Reino Unido) con 10% de suero fetal de ternera (FCS, TCS Biosciences, Buckingham, Reino Unido) y 1% de antibiótico y antimicótico (ABAM, ThermoFisher Scientific), que se cambió cada 2-3 días. Los cultivos se pasaron hasta que hubo suficientes MSC para el tratamiento, pero no se pasaron más allá del pasaje 4. Veinticuatro horas antes de la cosecha de los MSC, los matraces se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (DPBS, ThermoFisher Scientific) y se incubaron en un medio de pretratamiento durante 24 h como se describió anteriormente. Por razones de propiedad, no se describen los componentes del medio de pretratamiento.

Los viales de tratamiento se prepararon lavando las células adheridas con DPBS y luego incubando durante 5-10 min a 37°C en TrypLE^TM (ThermoFisher Scientific) hasta que las células estuvieron en suspensión. Las células suspendidas se lavaron en DPBS por centrifugación a 1500 g. El pellet celular final se resuspendió en suero autólogo con solución salina al 10% y sulfóxido de dimetilo al 10% (DMSO, Sigma-Aldrich, Gillingham, Reino Unido) a una concentración celular de más de 2,5 millones de células por ml para tratamiento intraarticular y 10 millones de células por ml para tratamientos epidurales. Las dosis intravenosas se crearon a una concentración solicitada por el veterinario tratante. Se colocaron dos mililitros de suspensión celular en un CellSeal^TM vial (Sexton Biotechnologies, Indianápolis, EE.UU.), sellado con un sellador de tubos, etiquetado y criopreservado con un CoolCell^TM (Azenta Life Sciences, Manchester, Reino Unido) en un congelador de −80 °C. Dos muestras de 50 μl de la suspensión MSC final se reservaron para el control de calidad. Los viales de tratamiento criopreservados se mantuvieron a -80 ° C durante el transporte y el almacenamiento (durante <4 semanas) en la clínica hasta que se requirieron para la inyección. El control de calidad interno ha confirmado que las células permanecen viables durante al menos un mes cuando se almacenan a -80 ° C.

2.3.3. Caracterización y control de calidad del MSC

La diferenciación del trilinaje se demostró con base en los métodos descritos por Russell et al. (59). Para la diferenciación condrogénica, las MSC en el pasaje 3 se sembraron a 2 x 10⁵ células en 0,1 ml de EM de baja glucosa por pocillo en una placa Nunc de 96 pocillos Nunc con fondo en U de baja adhesión (ThermoFisher Scientific) y se deja asentar en la incubadora como se describió anteriormente. Después de 48 h se eliminó el EM, los esferoides se lavaron dos veces con PBS y luego se agregaron 0,1 ml de medio de diferenciación de condrogénesis StemPro (ThermoFisher Scientific) por pocillo. Los pocillos de control se mantuvieron en EM de baja glucosa en todo momento. Las placas se mantuvieron en la incubadora durante 21 días con un cambio de medio cada 2-3 días. Los esferoides se tiñeron con azul de Alcian (ThermoFisher Scientific) después de la fijación con paraformaldehído, luego se lavaron con HCl 0.1 N (Sigma-Aldrich), se neutralizaron con agua destilada y se visualizaron bajo microscopía óptica. Los esferoides se montaron en portaobjetos de vidrio, se comprimieron bajo un cubreobjetos de vidrio y se tomaron imágenes.

Para la diferenciación osteogénica, las MSC en el pasaje 3 se sembraron en 2 x 10⁵ células por pocillo en 1 ml de EM de glucosa baja en una placa de 24 pocillos (Sarstedt, Leicester, Reino Unido) e incubadas como se describió anteriormente con el medio cambiado cada 2-3 días hasta que alcanzaron el 80% de confluencia. Se extrajo el medio, se lavaron las células con DPBS y luego se trataron pocillos de prueba con 1 ml de medio de diferenciación de osteogénesis StemPro™ (ThermoFisher Scientific) y pocillos de control con EM de glucosa baja durante 14 días con medio cambiado cada 2-3 días. La monocapa de células se fijó con formalina al 10% (Sigma-Aldrich), se lavó con agua desmineralizada y luego se añadió 1 ml de 40 nM de Alizarina Roja S (Sigma-Aldrich, Reino Unido) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min. La mancha se lavó con agua desionizada antes de la visualización con un microscopio invertido.

Para la diferenciación adipogénica, las MSC en el paso 3 se sembraron a 5 x 10⁴/bien en un cultivo de tejidos recubierto con una placa de 96 pocillos (Sarstedt) en 0,1 ml de StemMACS AdipoDiff Media (Miltenyi Biotec, Bisley, Reino Unido), se sembraron pocillos control a la misma densidad en EM de glucosa baja. La placa se incubó como se describió anteriormente y el medio se cambió cada 2-3 días. Después de 14 días, las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, se lavaron con DPBS y se tiñeron con Rojo Aceite (Sigma-Aldrich), se lavaron dos veces con agua desionizada y se visualizaron con un microscopio invertido.

El inmunofenotipado se llevó a cabo en base a los métodos descritos por Krešić et al. (60) e Ivanovska et al. (61). Brevemente, siete líneas celulares de MSCs (tomadas al azar del banco de MSCs almacenadas en el laboratorio) fueron cultivadas al paso 2 y cuando el 80% de confluentes fueron tripsinizadas como se describió anteriormente. El pellet celular se resuspendió en 1 ml de paraformaldehído al 4% (Sigma-Aldrich) durante 15 min y se lavó con DPBS. Para cada anticuerpo 1–2 x 10⁵ Las MSC para cada línea celular (n = 7) se transfirieron a tubos cónicos de Eppendorf. Las MSC fijas se resuspendieron en anticuerpos caninos diluidos 1:100 en albúmina sérica bovina al 2% (BSA, Sigma-Aldrich)/DPBS, se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con DPBS, se resuspendieron en DPBS helados y se leyeron en el citómetro de flujo BD C6 (BD Biosciences, Wokingham, Reino Unido) con un 1 x 10⁴ límite de eventos (ver Tabla 1 para los anticuerpos utilizados para el inmunofenotipado). Estos datos fueron analizados utilizando el software BD Accuri C6 Plus (versión 1.0.23.1; BD Biociencias). Las muestras se ejecutaron con controles no teñidos y los controles de isótopos correspondientes.

Los criterios de liberación para los viales de tratamiento de MSC requerían que todos los lotes (es decir, cada cultivo individual de MSC) pasaran la verificación morfológica final del cultivo, una prueba microbiológica de 4 días y una viabilidad post-criogénica y recuento de células. Los resultados de estas pruebas se proporcionaron al veterinario tratante (AA) en un certificado de análisis. Las pruebas de control de calidad se detallan en el material complementario 2.

2.4. Procesamiento PRP

Dependiendo del peso corporal y la cantidad de PRP requerida, se recolectaron 25 o 50 ml de sangre anticoagulada y se determinaron los glóbulos blancos totales (WBC), los recuentos diferenciales, la concentración de glóbulos rojos (RBC) y la concentración de plaquetas utilizando un analizador de hematología Idexx Procyte interno (Idexx Laboratories, Westbrook, ME, EUA), calibrado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La sangre anticoagulada se procesó, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un sistema validado canino (PurePRP Kit, Companion Regenerative Therapies, Newark, DE, EUA). Se dispensaron de medio a 1 ml de PRP en jeringas de 1 ml para inyección y se analizó una muestra del PRP utilizando un analizador de hematología Idexx Procyte interno (Idexx Laboratories, Westbrook, ME, EUA) como antes. Se confirmó la composición del producto PRP para cada muestra. El aumento del recuento de células plaquetarias de sangre total se calculó dividiendo el recuento de plaquetas PRP por el recuento de plaquetas en sangre total para obtener un factor de concentración específico para cada paciente.

2.5. Protocolo de tratamiento

En la clínica, se permitió que los viales de tratamiento de MSC se descongelaran a temperatura ambiente. El número exacto de células requeridas para el tratamiento se determinó a partir del certificado de análisis que detalló el recuento de células en millones por mililitro, el porcentaje de viabilidad después del deshielo y los criterios de liberación aprobados.

Los perros fueron sedados con una combinación de medetomidina (Sedator, Dechra Veterinary Products, Shrewsbury, Reino Unido) y metadona (Comfortan, Dechra Veterinary Products, Shrewsbury, Reino Unido) administrada por vía intravenosa, o se les administró anestesia general, como antes, para el tratamiento con una combinación de células madre y PRP, o MSC solas en el caso de la inyección epidural de LS.

Los sitios de tratamiento se prepararon asépticamente y se realizaron inyecciones conjuntas utilizando enfoques estándar. Para el tratamiento intraarticular, se aspiró líquido para asegurar la colocación correcta de la aguja y eliminar el exceso de líquido antes de la inyección de células, y se utilizó MSK US para guiar los tratamientos para atacar patologías específicas en músculos, tendones o ligamentos. Las inyecciones epidurales de LS se realizaron con una aguja espinal utilizando un enfoque estándar y, en aquellos casos en que la espondilosis estaba presente en las regiones cervical y torácica, se infundieron células madre intravenosas además de la inyección epidural en la unión LS.

Para cada lesión articular o tendinosa, se inyectaron > 2,5 millones de células madre en cada ubicación. En el caso del LSD, se inyectaron > 10 millones de células en el espacio epidural en la unión LS y donde se administraron tratamientos intravenosos, se administraron 1 millón de células por kg de peso corporal mediante infusión intravenosa lenta. Las MSC y el PRP se combinaron y mezclaron de manera estéril inmediatamente antes de la inyección para tratamientos intraarticulares y tendinosos. Las MSC solas se inyectaron en el espacio epidural o cuando se requirieron tratamientos intravenosos. La reacción adversa a cualquier tratamiento se registró en la historia clínica.

Los sitios de tratamiento recibieron terapia con láser de clase IV (Companion Therapy Laser CTC-15, LiteCure, LLC, DE. USA) inmediatamente después de la inyección y otras cinco sesiones se completaron durante las siguientes 3-6 semanas. La terapia con láser (LT) se aplicó utilizando una bola de contacto con láser moviendo continuamente la cabeza en un patrón de cuadrícula sobre toda el área de tratamiento según las recomendaciones del fabricante. La potencia del láser y la duración del tratamiento se adaptaron a cada individuo dependiendo del peso corporal, la condición corporal, la longitud del cabello, el color del cabello y el color de la piel. La dosis proporcionada a cada área de tratamiento fue de 10 julios/cm².

Todos los perros fueron reevaluados clínicamente aproximadamente a las 6, 12 y 18 semanas después del tratamiento inicial y luego cada 3-6 meses. A las 12 semanas, en el caso de patología grave (es decir, OA de grado 3/5 o mayor) o donde los perros habían recibido intervención artroscópica quirúrgica del codo antes de la derivación al autor (AA), se administró un segundo tratamiento de MSC solas. Del mismo modo, a las 12 semanas se administró un tratamiento repetido con MSC donde MSK US indicó que la curación de las estructuras de tejidos blandos tratadas era incompleta. Se proporcionó un solo tratamiento de terapia con láser en el momento de la inyección en el área de tratamiento cuando se realizó un segundo tratamiento. En aquellos perros que recibieron tratamiento adicional más de 12 meses después de su tratamiento anterior, se siguió el protocolo de tratamiento inicial. El protocolo de tratamiento se ha resumido en la Tabla 2.

2.6. Diagnóstico por imagen

La ecografía musculoesquelética formó parte de todas las evaluaciones clínicas y se utilizó para evaluar músculos, tendones, ligamentos, discos intervertebrales lumbares caudales (IVD) y estructuras intraarticulares, incluida la cápsula articular, el volumen de líquido articular y los cambios en la membrana sinovial y la integridad de la superficie articular. Cuando los cambios patológicos fueron unilaterales, la comparación se realizó con estructuras contralaterales, utilizando vistas estándar. Los tendones y sus entesis se evaluaron para el agrandamiento midiendo sus áreas transversales en ubicaciones anatómicas específicas y comparándolas con la estructura contralateral. La elastografía se utilizó para obtener imágenes de las propiedades elásticas de los tendones para confirmar la presencia de fibrosis o tejido cicatricial. El IVD lumbar caudal se evaluó por comparación con discos adyacentes para medir el grosor del anillo fibroso y la ecogenicidad del núcleo pulposo. Cuando hubo mineralización extensa de estructuras de tejidos blandos, además de MSK US, se tomó una radiografía repetida del área afectada 12 semanas después del tratamiento inicial para determinar el alcance de cualquier mineralización anormal restante. Cuando la evaluación clínica indicó la necesidad de tratamiento adicional con RM, se tomaron radiografías y se realizó MSK US si correspondía, para establecer si se había desarrollado una patología adicional o alternativa.

2.7. Mediciones de resultados clínicos

Las medidas de resultado objetivas formaron parte de la evaluación previa al tratamiento y se repitieron en todas las evaluaciones clínicas posteriores. No se registraron todas las medidas de resultado para cada paciente en el que el examen clínico o el diagnóstico no lo justificaron. Por ejemplo, a los pacientes que no padecían LSD no se les realizaba PA y a los pacientes que solo sufrían de LSD no se les realizaba goniometría articular.

2.7.1. Análisis de posturas

Se utilizó una plataforma de distribución de peso (analizador de postura Companion, LiteCure LLC, Newark, Delaware, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para medir el porcentaje de distribución del peso a través de cada una de las cuatro extremidades. Se consideró que la distribución normal del peso (objetivo) era del 30% para cada miembro torácico y del 20% para cada miembro pélvico (29). Dado que muchos perros en el estudio tenían TME bilateral, se calculó una desviación general de la carga de peso normal sumando las desviaciones absolutas registradas de los valores objetivo para cada extremidad. Por lo tanto, cero representaría el peso normal y los valores más grandes aumentarían la desviación de lo normal. Este valor no solo da un valor de descarga, sino también de sobrecarga compensatoria y proporciona una mejor medida cuando hay TME en múltiples extremidades.

2.7.2. Goniometría

El perro se colocó en reclinación lateral, y se utilizó un goniómetro de plástico universal de tamaño apropiado para medir la flexión y extensión completa de la articulación afectada. El punto de pivote del goniómetro se colocó sobre el centro de movimiento de la articulación y sus brazos alineados a lo largo de los ejes óseos proximal y distal a la articulación que se estaba midiendo. El brazo proximal del goniómetro se mantuvo in situ mientras la articulación estaba completamente flexionada y extendida. Los valores fueron leídos en grados desde el goniómetro y registrados en la historia clínica. La ROM se calculó restando el ángulo de flexión del ángulo de extensión. Más información sobre los puntos de referencia anatómicos para la colocación del goniómetro se detalla en el material suplementario 3 y las imágenes de la colocación correcta se han publicado anteriormente (30).

2.7.3. Algometría de presión

Cuando se detectó dolor lumbosacro durante el examen físico por palpación directa, flexión lumbosacra e hiperextensión en la cola, un medidor de presión (Force Ten FDX compact digital force gauge. Wagner instruments, Greenwich, CT, EUA) se utilizó para cuantificar el umbral de dolor por presión. La unión LS se identificó palpando los procesos espinosos dorsales de las vértebras L7 y S1. La presión se aplicó a una velocidad constante a la unión lumbosacra dorsal (LS) (L7-S1) en ángulo recto con la piel y la fuerza máxima (PSI) aplicada para provocar una respuesta al dolor (cualquiera de las siguientes: alejarse del instrumento, girar la cabeza, vocalizar o lamer los labios) se registró como un promedio de tres mediciones y se redondeó al número entero más cercano.

2.7.4. Medición de la CVRS (VetMetrica™)

Se solicitó al mismo propietario para cada perro incluido en este estudio que completara las evaluaciones de VetMetrica™ antes del tratamiento, luego a las 2, 6, 12 y 18 semanas después del primer tratamiento; luego cada 6 meses a partir de entonces. Excepto por la evaluación de 2 semanas, que no coincidió con un examen clínico, los propietarios completaron su evaluación antes de cada examen clínico para minimizar el posible sesgo.

El instrumento de cuestionario estructurado basado en el comportamiento VetMetrica™ contiene 22 ítems (preguntas) para el propietario. Estos ítems son términos descriptivos simples, que son positivos (palabras asociadas con condiciones saludables) o negativas (palabras asociadas con condiciones no saludables). Cada descriptor está asociado con una escala de 7 puntos (0-6), que permite al propietario calificar el grado en que el término representa a su perro. Por ejemplo, para el término «lúdico», 0 representa «nada lúdico y 6 representa «no podría ser más lúdico». En consecuencia, en el caso de un ítem positivo como «lúdico», una puntuación de 6 implica una CVRS muy buena, pero la misma puntuación implica una CVRS muy pobre cuando el ítem es negativo, por ejemplo «letárgico». Un algoritmo codificado transforma automáticamente las respuestas del propietario a los 22 elementos en un perfil de CVRS para el perro que consiste en puntuaciones brutas (0-6) en 4 dominios de CV: Enérgico / Entusiasta (E / E), Feliz / Contenido (H / C), Activo / Cómodo (A / C), Tranquilo / Relajado (C / R). Los puntajes resumidos en bienestar físico (PWB) y bienestar emocional (EWB) se pueden calcular promediando los puntajes E / E Y A / C (PWB) y H / C y C / R (EWB) (Autor JR Personal Communication). Para ayudar a la interpretación, estos puntajes de dominio brutos se optimizan normalizándolos a la población de perros sanos relacionados con la edad, de modo que un puntaje de 50 en una escala de 0 a 100 representa el puntaje para el perro sano promedio relacionado con la edad. Además, el 70% de los perros sanos puntuarán por encima de un umbral establecido en 44.8 en la escala de 0 a 100 (50).

Para determinar la significación clínica de las mejoras en las puntuaciones del dominio CVRS, se calculó la diferencia en los valores medios entre el pretratamiento y cada ventana de tiempo posterior al tratamiento. Un cambio equivalente o mayor que la MID de 7 se consideró clínicamente significativo.

2.7.5. Evaluación clínica veterinaria

Programado para coincidir con la evaluación de CVRS de cada propietario, aparte de las 2 semanas posteriores al tratamiento inicial, el autor (AA) completó una evaluación veterinaria (material complementario 4) que estaba cegado a sus puntajes anteriores por el hecho de que los puntajes se ingresaron directamente en la base de datos VetMetrica™ en lugar del registro clínico. La evaluación veterinaria comprendió una lista de enfermedades caninas comunes que, cuando estaban presentes, se clasificaron como leves / moderadas / graves / etapa terminal. Se proporcionó una caja de forma libre para acomodar cualquier enfermedad no especificada en la lista. Las preguntas adicionales fueron las siguientes: «en una escala de 0 a 10, donde 0 es ningún impacto y 10 es el mayor impacto, evalúe cuánto está reduciendo el estado de salud del perro su calidad de vida (CV)», y «en una escala de 0 a 10 donde 0 es sin dolor y 10 siendo el dolor no podría ser peor, Por favor, indique qué cantidad de dolor siente que está sufriendo el perro».

2.7.6. Uso de analgésicos

El uso de analgésicos se comparó en dos períodos de tiempo: pretratamiento hasta 180 días (c.26 semanas) antes del primer tratamiento (pero excluyendo la fecha de tratamiento) y 24-48 semanas después del tratamiento. Cuando existían múltiples registros, se seleccionó el último en el período previo al tratamiento (más cercano a la fecha de tratamiento) y el más temprano en el período posterior al tratamiento (más cercano a 6 meses).

2.8. Tratamiento y análisis de datos

2.8.1. Recopilación retrospectiva de datos

Los datos de los pacientes incluyeron señalización, historia, diagnóstico, tratamientos previos (incluidos los tratamientos en la presentación inicial), terapia analgésica, hallazgos del examen físico, resultados de diagnóstico por imágenes y mediciones objetivas de resultados (distribución del peso en la postura, mediciones de goniometría del ángulo articular y lecturas de algometría de presión) se extrajeron del registro del caso. Los perros fueron excluidos del análisis de cada medida de resultado individual si no había datos suficientes registrados en el registro médico antes o después del tratamiento. Las puntuaciones normalizadas en cuatro dominios de la CV calculadas a partir de los cuestionarios de calidad de vida relacionada con la salud (CVRS) informados por el propietario de VetMetrica, y las puntuaciones de dolor veterinario y de impacto de la CV, se extrajeron de la base de datos VetMetrica™. Idealmente, las evaluaciones de CVRS se correspondieron con las visitas clínicas y las evaluaciones veterinarias, excepto a las 2 semanas cuando no hubo visita a la clínica. Sin embargo, las circunstancias individuales del propietario a menudo dictaban que esto no era posible. En consecuencia, un intervalo de 14 días se consideró un punto de corte razonable para maximizar la probabilidad de que el estado de salud del perro no hubiera cambiado entre las evaluaciones del propietario y las visitas a la clínica, por lo que todos los pares de evaluación que tenían >14 días entre ellos fueron excluidos del análisis de CVRS.

2.8.2. Análisis estadístico

Para determinar si hubo una mejoría en las medidas de resultado objetivas y el propietario informó la calidad de vida relacionada con la salud después del tratamiento con RM, los datos se dividieron en fase previa al tratamiento y luego en ventanas de tiempo 0-6 semanas, 7-12 semanas, 13-18 semanas, 19-24 semanas, 25-48 semanas, 49-78 semanas (18 meses) y 79-104 semanas (24 meses) después del primer tratamiento. Los datos más allá de las 104 semanas no se consideraron más debido a los números bajos.

Los datos se analizaron como un modelo mixto lineal con ventana de tiempo como efecto fijo y perro dentro de ventana de tiempo como efecto aleatorio. Este análisis tiene en cuenta que puede no haber valores o múltiples por perro por ventana de tiempo. Los efectos significativos (p < 0,05) se investigaron posteriormente mediante comparaciones múltiples de Tukey. Los datos para el dolor de LS se restringieron a aquellos perros con enfermedad de LS. Del mismo modo, las mediciones de ROM articular se restringieron a los perros que recibieron uno o más tratamientos en esa articulación. Para el análisis, los valores de ROM para las articulaciones derecha e izquierda se promediaron para proporcionar un valor ROM total para la articulación. Se disponía de datos más limitados para el rango de movimiento para el sofo, el corvejón y el carpo que para las otras articulaciones, por lo que su análisis se complementó con un análisis adicional que solo comparó las ventanas previas con las posteriores al tratamiento (a 104 semanas). Los resultados se presentan como diagramas de caja de datos sin procesar para cada ventana de tiempo.

Para determinar la relación entre el cambio en la postura y el cambio en las puntuaciones del dominio VetMetrica, así como las puntuaciones de dolor y de impacto de la CV, la desviación de la postura perfecta se comparó con las puntuaciones del dominio CVRS, el dolor veterinario y las puntuaciones de impacto de la CV si el intervalo entre ellas era de ≤ de 14 días. Para cada variable CVRS, dolor e impacto de la CV, se ajustó un modelo mixto lineal con perro como efecto aleatorio y cambio de postura como covariable.

La reducción de la medicación analgésica en dos puntos de tiempo definidos (antes y después del tratamiento) se probó mediante pruebas de rango con signo de Wilcoxon.

El tamaño del efecto de Cohen (d) se calculó para las medidas ROM y PA.

3. Resultados

3.1. Diferenciación de MSC e inmunofenotipado

Las MSC caninas aisladas y el cultivo ampliado para los perros en este estudio se ajustaron a los estándares de la Sociedad Internacional para la Investigación de Células Madre (58) y la Declaración de Posición para MSC Veterinarias (53) con respecto a todos los criterios, excepto la adipogénesis, que no ocurrió en las condiciones probadas. La Figura 1 muestra que tanto los cultivos de diferenciación osteogénica como los condrogénicos se tiñeron positivamente en comparación con los controles correspondientes, pero el cultivo adipogénico no se tiñó positivamente con Rojo de aceite en comparación con el control correspondiente. La Figura 2 muestra que las MSC fueron positivas para CD44 y CD90, mientras que fueron negativas para CD34, CD45 y MHCii.

3.2. Composición del PRP

En promedio, se encontró que el factor de concentración de plaquetas era 6.3 veces mayor que el de la sangre total con una reducción del 98% en los glóbulos rojos y una reducción del 92% en los neutrófilos en comparación con la sangre total del mismo paciente. Esto fue consistente con los hallazgos de otros investigadores que utilizaron el mismo sistema (62).

3.3. Población de estudio

Se recogieron datos de 245 perros, mediana de edad 6,3, rango 6 meses-14 años, 136 machos y 109 hembras de los cuales 72 y 76 respectivamente fueron castrados (material suplementario 5). Se representó una amplia gama de razas, que se detallan en la Tabla 3. Los perros fueron remitidos para tratamiento con RM debido a la gravedad y la naturaleza generalizada de su TME que no respondía a los tratamientos tradicionales. En la presentación, los perros estaban recibiendo múltiples medicamentos analgésicos, incluidos medicamentos adyuvantes y AINE, pero aún exhibían dolor y cojera. Veinticuatro perros tuvieron cirugía previa relacionada con la ruptura del ligamento cruzado craneal, 24 tuvieron intervención artroscópica quirúrgica previa para trastornos del desarrollo del codo y 2 recibieron tratamiento quirúrgico para la osteocondrosis (TOC) del hombro.

Doscientos treinta y cuatro perros fueron diagnosticados inicialmente con OA. Los grados de OA 1, 2, 3 y 4 fueron representados por 24, 99, 100 y 6 perros respectivamente; Otros cinco perros no fueron calificados en la presentación inicial. Los 11 perros restantes sufrían tendinopatías y/o LSD en ausencia de OA.

Los perros tuvieron entre 1 y 8 tratamientos con RM. La frecuencia y el porcentaje de perros que reciben tratamiento se muestra en la Tabla 4. De los 106 perros que recibieron solo dos tratamientos, el segundo tuvo lugar entre 70 y 126 días (10-18 semanas) para 40 perros y después de 126 días para 66 perros. El primer grupo comprende pacientes que recibieron dos tratamientos como parte del protocolo de tratamiento inicial y para el segundo grupo la media (DE) de los días entre tratamientos fue de 450,9 (321,4) con el segundo tratamiento administrado debido a la necesidad clínica. El material complementario 6 indica cuántos registros/perros estaban presentes en cada ventana de tiempo para cada análisis e incluye tablas de medias ajustadas para cada ventana de tiempo con códigos de letras de Tukey comparaciones múltiples tales que significa que no compartir una letra común son significativamente diferentes (p < 0.05).

La Figura 3 indica la proporción de perros que recibieron tratamiento en cada una de las seis articulaciones en al menos una ocasión, y la proporción de perros tratados en la región lumbosacra al menos una vez.

Los diferentes TME tratados en el grupo de estudio se enumeran en el material complementario 7.

3.4. Ecografía musculoesquelética

En general, las evaluaciones repetidas de los tendones tratados y otras estructuras de tejidos blandos realizadas con MSK US a las 12 semanas posteriores al tratamiento demostraron mejoras considerables en los patrones de fibras tendinosas y una reducción o eliminación del cambio inflamatorio, la fibrosis y la mineralización, como se muestra en la Figura 4B. Antes del tratamiento, el tendón SS y su entesis estaban severamente degenerados con una pérdida del patrón de fibra lineal, infiltración fibrótica y áreas de mineralización extensa, pero a las 12 semanas después del tratamiento el tendón había reanudado un patrón de fibra normal y la entesis se remodeló a una apariencia normal de «aleta de tiburón» con resolución de las porciones fibróticas y mineralizadas y ecogenicidad normal. La Figura 4A muestra evidencia radiográfica de resolución de mineralización anormal en la inserción del tendón SS en el mismo paciente en los mismos puntos temporales. En contraste, la Figura 5 es un ejemplo de curación incompleta después del tratamiento en un Border Collie de 4 años con una lesión del tendón del hombro relacionada con los deportes. La imagen de la izquierda muestra una tendinopatía crónica del bíceps y un desgarro parcial del tendón subescapular con alteración completa de las fibras. A las 12 semanas después del tratamiento, hubo una mejora considerable en el patrón de fibra, fibrosis y ecogenicidad del tendón del bíceps y su entesis. La integridad del tendón subescapular había mejorado, pero hubo una curación incompleta. Después de un segundo tratamiento, el tendón subescapular se había curado completamente con un patrón de fibra normal, sin fibrosis / tejido cicatricial y sin fibras tendinosas flotantes visibles en el compartimiento medial del hombro.

3.5. Medidas de resultado

3.5.1. Análisis de posturas

Hubo 855 registros de 228 perros hasta la semana 104. Los resultados se muestran en la Figura 6. Los resultados del análisis del modelo mixto mostraron que hubo efectos de ventana de tiempo significativos (p < 0,001); Todas las medias posteriores al tratamiento fueron significativamente menores en comparación con el tratamiento previo.

3.5.2. Goniometría

Hubo 925 registros de 234 perros con un número variable de registros / perros para cada medida, truncados a las 104 semanas. La figura 7 representa la ROM en las articulaciones torácicas y pélvicas de las extremidades, desde el pretratamiento hasta las 104 semanas.

El análisis de las articulaciones individuales indicó que hubo efectos significativos de ventana de tiempo (p < 0,001) con mejoría en todas las ventanas de tiempo en comparación con el período previo al tratamiento para hombro y cadera; en todas las ventanas de tiempo, excepto durante 104 semanas para el carpo y el codo (p < 0,001); y sólo en las semanas 18 y 104 para sofocar (p = 0,003). Los efectos de la ventana de tiempo para el corvejón no alcanzaron significación (p = 0,062). Para aquellas articulaciones menos bien registradas en las que se realizó un análisis previo y posterior al tratamiento, todas fueron significativas; Carpo y sofocar ambos p < 0,001, corvejón p = 0,020. La mejora máxima en ROM fue de 12, 14, 20 y 22 grados para el hombro y la estípula, la cadera, el carpo y el codo, respectivamente.

En cuanto al tamaño del efecto, los cambios en la ROM entre el pretratamiento y las primeras 6 semanas después del tratamiento tuvieron un tamaño del efecto de Cohen (d) que varió de 1,05 a 2,14.

3.5.3. Algometría de presión

Hubo 568 registros de dolor de LS de 171 perros con LSD hasta la semana 104. Hubo efectos de ventana de tiempo significativos (p < 0,001) y todas las medias posteriores al tratamiento mejoraron significativamente en comparación con el pretratamiento (Figura 8). El tamaño del efecto de Cohen (d) fue de 2,20 para el mismo período de tiempo que la ROM.

3.5.4. Medición de la CVRS (VetMetrica™)

Se registraron un total de 954 evaluaciones de calidad de vida (CdV) de propietarios en cuatro dominios de 212 perros que tenían tanto CdV como detalles de tratamiento hasta la semana 104. La Figura 9 muestra las puntuaciones de CVRS a lo largo del tiempo en los cuatro dominios. En E/E hubo efectos de ventana de tiempo significativos (p < 0,001) con todas las medias de ventana de tiempo después de 6 semanas siendo significativamente mayores que antes del tratamiento. En H/C y C/R todas las medias post-tratamiento fueron significativamente mayores que en el pre-tratamiento después de 12 semanas (p < 0,001). En el aire acondicionado, todas las medias posteriores al tratamiento fueron significativamente mayores que en el pretratamiento (p < 0,001), con una ligera reducción en las ventanas de tiempo posteriores.

De 13 a 78 semanas, todas las mejoras en las puntuaciones medianas para E/E, H/C y A/C se consideraron clínicamente significativas sobre la base de que excedieron la MID de 7 (material suplementario 8).

3.5.5. Evaluación clínica veterinaria

El dolor veterinario y las puntuaciones de impacto de la CV se registraron 906 veces desde 223 perros hasta la semana 104. La figura 10 muestra las puntuaciones a lo largo del tiempo para el dolor veterinario y el impacto de la CV. Hubo efectos significativos de ventana de tiempo (p < 0,001) con todas las medias posteriores al tratamiento que mejoraron significativamente desde el pretratamiento, pero con un deterioro en las ventanas de tiempo posteriores.

3.5.6. Relaciones entre el cambio de postura y el cambio en VetMetrica y los puntajes de la evaluación veterinaria

Hubo registros de cambio de 123 perros donde la desviación de la postura perfecta se comparó con los puntajes de dominio de CVRS dentro de un período de 14 días. Estos datos mostraron que hubo una relación significativa (p < 0,001) entre la mejora en la postura y la mejora en los puntajes de CVRS en los cuatro dominios. Del mismo modo, la relación entre la mejora de la postura y la disminución del dolor evaluado por el veterinario (Figura 11) y las puntuaciones de impacto de la CV fue significativa (p < 0,001).

3.5.7. Uso de analgésicos

Un total de 118 perros tenían registros analgésicos tanto en períodos previos como posteriores al tratamiento. Las fechas medias de los registros fueron 41 días antes del tratamiento (rango 1-159 días antes) y 225 días después del tratamiento (rango 170-336). La proporción de perros que recibieron AINE disminuyó de 74 a 50%, el cambio fue significativo (p < 0,001) basado en una prueba de rango con signo de Wilcoxon. La proporción de perros que recibieron adyuvantes (como paracetamol, gabapentina, codeína, amantadina y tramadol) disminuyó del 80 al 35%, y el número medio de adyuvantes por perro disminuyó de 1,58 a 0,64. Ambos fueron significativos (p < 0,001) utilizando las pruebas de rango con signo de Wilcoxon.

3.6. Acontecimientos adversos

Se registró un pequeño número de reacciones adversas leves, incluidas irritaciones de la piel después del recorte y la preparación quirúrgica de la piel. También se notificaron brotes articulares transitorios de corta duración (<36 h) después de la inyección intraarticular en el <1% de la población del estudio.

4. Discusión

Este artículo es el primero en informar la duración de la mejora que se puede lograr con múltiples aplicaciones de MSC autólogas de cultivo expandido y de calidad controlada para tratar la TME generalizada que afecta articulaciones, tendones, ligamentos y patología de la región LS, en una gran muestra (245) perros que presentaban dolor y cojera a pesar de recibir múltiples medicamentos analgésicos, incluyendo fármacos adyuvantes, así como AINE. En contraste, Sanghani-Kerai et al. informaron los resultados de 25 perros que recibieron inyecciones intraarticulares de MSC y PRP en una sola ocasión como parte de su manejo de OA, y solo tres de los 25 perros tuvieron más de una articulación tratada, con resultados registrados durante solo 24 semanas (63). Además, este estudio es el primero en utilizar un protocolo terapéutico estandarizado que incluía LT además de MSC y PRP. En comparación con el enfoque estándar de utilizar medidas de resultado objetivas para definir el impacto funcional del tratamiento, este estudio se mejoró mediante la adición de una evaluación validada de la CVRS y mediante el uso del tamaño del efecto d de Cohen para cuantificar la significación clínica además de la significación estadística.

Los autores consideran que la RM es un enfoque de tratamiento dirigido que requiere un diagnóstico holístico de TME para tratar todas las áreas de la patología simultáneamente con el fin de lograr los mejores resultados. Además de un examen ortopédico y neurológico completo, se utilizó la imagen diagnóstica para llegar a un diagnóstico definitivo en todos los casos. Se utilizaron radiografías para evaluar los cambios óseos y articulares y MSK US para evaluar las estructuras de los tejidos blandos. Las radiografías del hombro no son diagnósticas para las tendinopatías del hombro a menos que haya una mineralización extensa, por lo que MSK US permitió una mayor detección de tendinopatía que si la radiografía se hubiera utilizado sola. Además, debido a que MSK US proporciona un medio para evaluar la patología de la cápsula articular (hipertrofia y sinovitis), así como el derrame articular y la superficie articular, agrega valor a la clasificación de la OA (64-73). Los osteofitos pequeños, que pueden pasarse por alto en radiografías simples, se pueden visualizar dentro de la articulación, lo que permite una detección más temprana de la patología articular. Según el conocimiento de los autores, aunque se ha propuesto como una herramienta útil para clasificar la OA humana (67), este es el primer ejemplo de MSK US que contribuye a la clasificación de OA en perros.

La mayoría de los perros tenían OA en múltiples articulaciones en más de una extremidad y había una alta prevalencia de LSD. De hecho, este estudio es el primero de su tipo en evaluar los protocolos de tratamiento que abarcan TME multifocal que involucran articulaciones, estructuras de soporte de tejidos blandos y la columna vertebral. La articulación tratada con mayor frecuencia fue el hombro, seguido de las caderas y luego los codos con carpi, los sofocantes y los corvejones menos. Los perros perdigueros de Labrador estuvieron sobrerrepresentados en la población de estudio, representando el 32% de los casos. En consecuencia, la alta prevalencia de enfermedad del desarrollo de cadera y codo en esta raza puede haber influido en la incidencia de articulaciones tratadas. La displasia de codo con OA secundaria también fue una razón común para la presentación en esta raza, siendo la intervención artroscópica previa una característica regular. En estos casos, la experiencia clínica ha demostrado que se requería un tratamiento más agresivo con RM e incluso entonces, la duración del efecto parecía más corta que en los pacientes sin intervención quirúrgica previa (comunicación personal AA). En consecuencia, todos los perros con displasia de codo que se sometieron a una cirugía artroscópica previa recibieron un tratamiento repetido de MSC a las 12 semanas como una cuestión de rutina.

Es interesante que la articulación tratada con mayor frecuencia fue el hombro. Dado que las inyecciones intraarticulares de MSC y PRP no afectarán a las estructuras fuera de la cápsula articular, se realizó una inyección guiada por ultrasonido dirigida a estructuras extracapsulares, con la patología identificada por primera vez por MSK US. En consecuencia, los tratamientos del hombro comprendieron inyección intraarticular y/o tratamiento guiado por ultrasonido de los tendones del hombro (comúnmente tendones supraespinosos y bíceps), con predominio del tratamiento tendinoso, lo que indica una prevalencia muy alta de tendinopatías del hombro. Esto concuerda con un estudio reciente que informó que el 55% de los perros con enfermedad del desarrollo del codo tenían tendinopatías concurrentes del hombro (10). Cuando la curación de una tendinopatía fue incompleta a las 12 semanas, se inyectó un segundo tratamiento de MSC en las lesiones restantes. Esto fue más comúnmente requerido en el caso de la tendinopatía supraespinosa debido a la gravedad, cronicidad y naturaleza impermeable de la entesis tendinosa donde la inyección de terapéutica requiere una técnica de fenestración. Esto, combinado con áreas de fibrosis y mineralización, limita el volumen de MSC y PRP que se pueden infundir y aumenta la probabilidad de que se requiera un segundo tratamiento. Sin embargo, la resolución de la mineralización del tendón supraespinoso y la restauración de una entesis normal después de uno o dos tratamientos, fue un ejemplo de la capacidad regenerativa de la terapia MSC en combinación con PRP y LT.

De acuerdo con la declaración de posición publicada por Guest et al. (53), las publicaciones veterinarias que involucran MSC deben describir la fuente de tejido, el método de preparación, el método de cultivo, el número de paso y el método de almacenamiento de las células, así como el tipo de células, la antigenicidad, la dosis celular, el esquema de dosificación, el vehículo de entrega y el método de administración. Las MSC utilizadas aquí fueron MSC autólogas derivadas de tejido adiposo, cultivo expandido utilizando protocolos estandarizados, criterios de liberación y estricto control de calidad en un laboratorio de cultivo celular autorizado por la Dirección de Medicamentos Veterinarios, cumpliendo así con la Declaración de Posición (53). Además, también se cumplieron las recomendaciones posteriores de Ivanovska et al. en la fabricación de MSC para el tratamiento de la OA en pacientes caninos (61). Las MSC se diferenciaron en condrocitos y osteocitos, pero no en adipocitos, a pesar de derivarse del tejido adiposo. Sin embargo, según Sasaki et al. (73) las MSC caninas no siempre se diferencian en adipocitos cuando son inducidas por un medio optimizado para la diferenciación de adipocitos MSC humanos y, por lo tanto, este hallazgo no es inusual (73-75). Mientras que inicialmente se consideró que la eficacia de las MSC se debía a su capacidad para diferenciarse en linajes musculoesqueléticos como condrocitos y osteocitos, más recientemente se cree que sus acciones inmunomoduladoras y paracrinas, que influyen en el entorno inflamatorio a través de la liberación de factores de crecimiento y citoquinas, son de mayor importancia (25, 75-77). A pesar de esta falta de claridad con respecto al mecanismo de acción definitivo de las MSC, este estudio ha demostrado que los perros con TME grave y sin respuesta mejoraron sustancial y rápidamente con el protocolo RM utilizado y que esto se mantuvo hasta por 2 años en algunos perros. La respuesta inicial al tratamiento puede atribuirse a los efectos antiinflamatorios de la MSC y el secretoma plaquetario, pero los efectos posteriores de la remodelación, la curación y la formación de nuevos tejidos ocurren durante un período de tiempo más prolongado. Dado que existe evidencia de que las MSC pueden persistir en el sitio de inyección durante más de 10 semanas en las articulaciones de OA (78) y más de 24 semanas en los tendones (79), esto podría explicar la mejora sostenida prolongada después del efecto antiinflamatorio inicial.

Este estudio analizó las respuestas al tratamiento en los procesos naturales de la enfermedad y proporciona información impactante sobre la estandarización de los productos y protocolos de células biológicas caninas. Esto es importante para los tratamientos veterinarios y también confirma el potencial de aplicaciones traslacionales en medicina humana. Tanto Ivanovska et al. como Webb et al. han abogado por el uso de enfermedades caninas naturales, tratadas con protocolos estandarizados de RM, como un área importante de investigación para cerrar la brecha entre los estudios in vitro y los ensayos clínicos en humanos (61, 80).

Para todos los tratamientos intraarticulares y tendinosos, las inyecciones de MSC fueron acompañadas por PRP y seguidas por un programa de tratamiento con láser. Este protocolo fue diseñado para optimizar la eficacia de las MSC, ya que responden positivamente a los factores de crecimiento liberados por las plaquetas y LT a través de PBM (81, 82). El PRP utilizado aquí fue óptimo para tratamientos antiinflamatorios porque contenía un bajo número de neutrófilos y eritrocitos y altas concentraciones de plaquetas en comparación con la sangre total (62). Se ha demostrado que los glóbulos rojos y los neutrófilos son perjudiciales en ambientes intraarticulares a través de la producción de mediadores proinflamatorios y causan la muerte de sinovitas (83). La concentración media de plaquetas en el PRP preparado fue 6,3 veces la concentración en sangre total, pero dado que las inyecciones de RM fueron una mezcla 1: 1 de suspensión de MSC y PRP, la concentración plaquetaria total fue aproximadamente 3 veces la concentración fisiológica de plaquetas en sangre total. Esta concentración está en línea con las dosis de plaquetas reportadas como más efectivas en estudios clínicos en humanos y estudios en modelos animales (84-86). La inyección de MSC con PRP ha demostrado ser clínicamente efectiva en una variedad de enfermedades inflamatorias (22, 28, 87). Los factores de crecimiento liberados por las plaquetas atraen y estimulan a las MSC para que proliferen e inicien respuestas de cicatrización de heridas (88). Los autores sugieren que estas acciones, junto con la formación de un coágulo de fibrina que actúa como un andamio para las MSC dentro de los tejidos lesionados e inflamados, promovieron la curación evidente en las articulaciones y tendones reportados en este estudio.

Para tratar el LSD se consideró que las MSC deben inyectarse sin la adición de PRP para permitir que las células migren a todas las áreas de patología (89). Este proceso migratorio, en teoría, podría estar limitado por la formación de coágulos de fibrina y citoquinas quimiotácticas producidas por plaquetas que dirigen las MSC a persistir en el espacio epidural, limitando así los efectos más generalizados en la región LS. Las MSC tienen un potente efecto antiinflamatorio pero, más importante en el caso de la estenosis LS, es su capacidad para revertir la fibrosis, deshacer la compresión nerviosa y aliviar el dolor neuropático (90, 91).

Illien-Junger et al. demostraron la localización de MSC derivadas de médula ósea humana en discos bovinos degenerados y un aumento posterior en la síntesis de proteoglicanos dentro del disco que demuestra su capacidad migratoria y regenerativa en la enfermedad del disco intervertebral (IVDD) (92). En un artículo de revisión de Oehme et al. (93), cuatro estudios en perros con IVDD lumbar inducida experimentalmente tratados con trasplante de células madre y células progenitoras demostraron efectos positivos en los discos intervertebrales (93-99). Si bien la enfermedad inducida experimentalmente puede diferir notablemente de la que ocurre naturalmente, estos estudios son alentadores y apoyan la aplicación clínica descrita en este estudio.

La implantación epidural de MSC en la unión LS proporcionó una ubicación repetible para la colocación, lo que permitió la migración local en la región lumbar posterior. No se registraron reacciones adversas en la historia clínica de los tratamientos iniciales o posteriores. Este perfil de seguridad, combinado con la accesibilidad de la unión LS, hace que la terapia repetida y el manejo a largo plazo del LSD sean realistas. Este es el primer estudio que informa una mejora significativa en las lecturas de la algolometría de presión junto con un tamaño de efecto de Cohen (d) muy grande y demuestra que la inyección epidural de MSC es un tratamiento seguro, mínimamente invasivo y efectivo para el LSD. En contraste, Salmelin et al. reportan una incidencia del 8,6% de los efectos secundarios en 150 perros tratados con esteroides epidurales para LSD (100). Tal manejo médico no es completamente efectivo para controlar el dolor LS y, además, los pacientes quirúrgicos pueden desarrollar signos clínicos y dolor después de las mejoras iniciales (101).

En perros con enfermedad espinal como enfermedad del disco intervertebral (IVDD) o espondilosis en las regiones lumbar torácica, cervical y craneal, la inyección IV de MSC se incluyó en el protocolo junto con las MSC epidurales. Las células madre administradas por vía intravenosa pueden alcanzar estructuras donde la implantación directa no es posible o donde la administración epidural que no sea en la unión LS conlleva el riesgo de lesión iatrogénica de la médula espinal. En un modelo de roedor, se ha demostrado que las células madre intravenosas migran a áreas de daño de la médula espinal con efectos terapéuticos positivos (94), incluido el tratamiento del dolor neuropático (91). Además, la administración IV de MSC ha demostrado ser segura, incluso en grandes cantidades (2,5 x 10⁸ células/kg de peso corporal), en personas y mamíferos (95). Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para evaluar los efectos de la combinación de MSC epidurales e intravenosas y sus posibles efectos sinérgicos sobre la reducción del dolor espinal y neuropático.

La terapia con láser, una parte integral del protocolo de tratamiento, se ha utilizado ampliamente para tratar lesiones y dolor ortopédico y de tejidos blandos en animales, pero hay poca información para apoyar su aplicación junto con las MSC (102). Los estudios in vitro han demostrado que la LT tiene efectos beneficiosos sobre la proliferación de células madre (103) y también han indicado que el preacondicionamiento de células madre con fotobiomodulación (PBM) puede aumentar la función celular, lo que lleva a una mejor cicatrización de heridas (104) y huesos (105). Amaroli et al. han revisado los efectos de PBM en las MSC y han mostrado múltiples ejemplos de efectos positivos relacionados con su acción antiinflamatoria, viabilidad y proliferación y el cambio de la diferenciación del linaje celular y el secretoma (106).

Los estudios experimentales llevados a cabo in vivo han demostrado que la combinación de PBM con terapia con células madre conduce a mejores resultados y que, contrariamente a la creencia común, no hay necesidad de un lapso de tiempo entre el tratamiento con células madre y la terapia con láser (107-109). Si bien estos estudios experimentales han demostrado los efectos beneficiosos de la terapia combinada en la curación de tejidos blandos, el uso de LT de Clase IV utilizado simultáneamente con la inyección de MSC caninas expandidas en cultivos en MSD naturales no se ha descrito previamente, lo que hace que este estudio sea el primero en utilizar este protocolo combinado. Sin embargo, dado que todos los perros recibieron MSC y PRP, así como LT, no se pudieron definir los efectos positivos atribuibles a LT. Sin embargo, Alves et al., utilizando la misma dosis de LT y puntos de tiempo que nuestro estudio, demostraron un efecto positivo sobre la ROM de la articulación de la cadera y el dolor en perros con OA, pero encontraron aumentos máximos medios en la ROM de cadera de 8 ° en comparación con 14 ° descritos en nuestro estudio (110). Upchurch et al. midieron los cambios en la ROM de cadera después del tratamiento con MSC (fracción vascular estromal) y PRP solo y encontraron un aumento medio máximo en ROM de 11 ° en los 6 meses posteriores al tratamiento (111). Aunque estos estudios no son directamente comparables, sugieren que las mejoras superiores en la ROM de cadera observadas en nuestro estudio podrían deberse a un efecto sinérgico de combinar MSC, PRP y LT, pero se requieren más estudios para corroborar esto.

Faltan pruebas publicadas para apoyar las electroterapias y las fisioterapias en combinación con RM y, en consecuencia, su uso, aparte de la LT, se restringió en el tratamiento inicial. Cuando los perros recibían fisioterapia en la derivación, estas se suspendieron en el momento del diagnóstico y la recolección de grasa con fisioterapia o hidroterapia se reanudó después de que el control de 12 semanas demostrara una curación suficiente. Para los pacientes que recibieron un segundo tratamiento con RM a las 12 semanas, las terapias físicas no se reanudaron hasta 18 semanas después del tratamiento inicial. Por lo tanto, las mejoras significativas en las medidas objetivas antes de las 12 semanas posteriores al tratamiento no pueden asociarse con las terapias físicas.

Las medidas de resultado utilizadas en este estudio constituyeron parte de la evaluación del paciente ayudando en el diagnóstico de TME y midiendo el cambio clínico. La información obtenida se utilizó para informar tratamientos adicionales en los que el dolor y los parámetros funcionales se deterioraron después del tratamiento inicial.

Aunque el análisis de la marcha canina utilizando datos de la placa de fuerza se ha utilizado ampliamente en estudios que involucran resultados de cirugía ortopédica, varias variables como la velocidad al caminar, la posición de la cabeza, la posición del manejador y los cambios en el peso corporal entre las mediciones repetidas pueden afectar los datos cinemáticos y de la placa de fuerza en perros normales (112, 113). Estos pueden influir en la fiabilidad de estos datos y se agravan cuando un paciente tiene múltiples anomalías en la marcha de las extremidades, como fue el caso en nuestro estudio. Por el contrario, si bien la relevancia clínica de la descarga estática de las extremidades no se ha informado en la misma medida, Clough et al., informaron una buena sensibilidad y especificidad para la detección tanto de la enfermedad ortopédica como de la cojera objetiva, y sugirieron que el análisis de la postura es clínicamente valioso para medir la respuesta al tratamiento (29). Además, se ha demostrado que no hubo diferencias en la sensibilidad de las fuerzas de reacción del suelo y la distribución estática del peso corporal para medir el dolor articular de la cadera y evaluar el uso de las extremidades después del tratamiento (114), de ahí nuestra decisión de utilizar el análisis de postura en este estudio.

El análisis de postura determina la distribución del peso mientras el perro está de pie sobre una placa de presión, y descargará una extremidad dolorosa y redistribuirá su peso como mecanismo compensatorio. En consecuencia, cualquier patología musculoesquelética se reflejará en la postura, lo que hace que el análisis de la postura sea una medida ideal de los efectos globales de la TME. Sin embargo, hay poca evidencia publicada que utilice datos de análisis de postura al informar los efectos del tratamiento mediante RM. Skangals encontró cambios beneficiosos, pero no estadísticamente significativos, en la distribución del peso y la ROM articular en 10 perros con OA unilateral del codo tratados con una sola inyección intraarticular de MSC alogénicas (115). El estudio encontró mejoras significativas en las medidas de resultado subjetivas informadas por el propietario, pero no para las medidas objetivas, lo que contrasta marcadamente con los datos informados aquí. Debido a que los pacientes tenían varias extremidades comprometidas, a menudo con compromiso articular y espinal múltiple, no fue posible comparar las extremidades afectadas con las no afectadas. En cambio, se calculó una medida de la desviación absoluta de una distribución normal del peso. La mejoría y normalización de la distribución del peso después del tratamiento con RM fue extremadamente rápida (de 6 semanas) y se mantuvo hasta las 104 semanas. Los autores creen que la mejora resultó de una reducción del dolor, con la consiguiente disminución de la descarga. De hecho, el hecho de que la mejora en la postura se correlacionó con la disminución en las puntuaciones de dolor veterinario, como se muestra en la Figura 11, da peso a esa hipótesis. Una característica de este estudio fue el reporte de significación clínica y estadística. En el caso de VetMetrica (50) esto se demostró cuando se alcanzó la MID de 7 en E/E, H/C y A/C en puntos de tiempo entre 13 y 78 semanas. La demostración de una relación significativa entre el cambio de postura y el cambio en la CVRS indicó que el cambio de postura también fue clínicamente significativo.

La ROM de las articulaciones tratadas se midió antes y después de los tratamientos intraarticulares con MSC y PRP. Se ha publicado una ROM normal para un pequeño número de razas (30, 116-118), pero no se dispone de un rango canino estándar de ángulos de flexión y extensión. Sin embargo, después del tratamiento, el aumento de ROM en este estudio fue a menudo dramático con muchas articulaciones recuperando lo que el autor AA consideró que era una ROM clínicamente normal. En las articulaciones de la cadera y el hombro, todas las mediciones posteriores al tratamiento fueron estadísticamente significativamente más altas que los niveles previos al tratamiento. Lo mismo fue cierto para el carpo y los codos, excepto por la ventana de tiempo de 104 semanas. Esto muestra que la ROM en el carpo y los codos comienza a reducirse aproximadamente 2 años después del tratamiento inicial. En el sofocante y corvejón la enfermedad unilateral fue más común, lo que resultó en un bajo número de muestras, y los autores consideran que esto puede haber contribuido a la falta de cambio estadísticamente significativo en estas articulaciones. Además, las mediciones totales de ROM se promediaron entre las articulaciones pareadas contralaterales en cada punto de tiempo, lo que resultó en una lectura promedio de ROM reducida en casos de tratamiento unilateral. Se tomaron registros de goniometría previos al tratamiento mientras el animal estaba bajo AG, negando el efecto del dolor limitando la extensión o flexión, pero los ángulos posteriores al tratamiento se registraron en el paciente consciente. Dado que Clark et al. encontraron que la ROM total en el codo aumentó hasta 11 grados bajo sedación o GA en comparación con cuando el perro estaba consciente (119), los resultados posteriores al tratamiento informados en este estudio pueden ser una subestimación del aumento real en la ROM total. Sin embargo, los aumentos reportados en la ROM total fueron significativos en la mayoría de las articulaciones tratadas. Estos hallazgos apoyan el potencial regenerativo de las MSC ya que, para que una articulación obtenga una ROM total mayor, debe haber alguna remodelación del hueso nuevo osteoartrítico, cambios en el grosor y elasticidad de la cápsula articular o la longitud músculo-tendón, lo que está restringiendo la flexión o la extensión.

Un estudio reciente investigó la ROM conjunta en 20 perros policía de trabajo con OA de cadera antes y después de la terapia PBM (110). Este estudio prospectivo, controlado positivamente, doble ciego mostró que PBMT redujo los niveles de dolor y mejoró los hallazgos clínicos en perros con OA de cadera en comparación con el meloxicam AINE hasta 90 días después del tratamiento (110). El aumento de la ROM total en el grupo tratado fue menor que el encontrado en el presente estudio después del tratamiento con MSC, PRP y terapia PBM. Aunque los estudios no son directamente comparables y difieren en el momento de los tratamientos PBM, los niveles terapéuticos de LT (10 j/cm²) eran idénticos. Esto proporciona evidencia para sugerir que las mejoras en la ROM total de cadera son mayores cuando las MSC y el PRP se combinan con PBM. Carr et al. encontraron un aumento medio en la ROM del codo de 6° en perros con OA del codo tratados con PRP solo a los 90 días después del tratamiento en comparación con un aumento de 2° en el grupo control en una pequeña cohorte de labradores (120). Esto es considerablemente menor que el aumento de 22 ° en la ROM del codo observado en un número mucho mayor de perros con OA del codo en este estudio, lo que sugiere que la combinación de MSC y LT con PRP tiene un mayor efecto en el aumento de ROM que el PRP solo.

La algometría de presión se ha utilizado con éxito en numerosos estudios en humanos (121-123), pero este es el primer estudio que utiliza la técnica para medir objetivamente los cambios en los umbrales de dolor de LS en perros en un entorno clínico. Más del 80% de los perros tratados recibieron inyecciones de MSC en el espacio epidural en la unión LS para el tratamiento del dolor lumbar asociado con LSD, además de patologías apendiculares concurrentes. La prevalencia de LSD sugiere que los cambios en la marcha y la distribución del peso causados por la TME apendicular pueden predisponer a una degeneración acelerada en la unión LS, secundaria a la biodinámica alterada de la columna vertebral. Los resultados de PA mostraron un aumento estadísticamente significativo en el umbral de dolor entre las mediciones previas al tratamiento y todas las mediciones posteriores hasta 104 semanas después de la inyección epidural de MSC y esto fue apoyado por una reducción significativa en el uso de analgésicos y antiinflamatorios después del tratamiento. La disminución de la necesidad de analgésicos fue estadísticamente significativa hasta las 32 semanas en promedio, destacando así las propiedades analgésicas del tratamiento con RM. Cabe destacar que las mediciones de PA previas al tratamiento se tomaron cuando los perros estaban recibiendo medicación analgésica, mientras que muchas de las lecturas posteriores al tratamiento se registraron cuando la medicación analgésica se había suspendido o reducido drásticamente, por lo que era probable que se subestimara el efecto analgésico de la inyección de MSC en la unión LS.

La importancia clínica tanto de ROM como de PA se demostró mediante el cálculo del tamaño del efecto entre el pretratamiento y las 6 semanas posteriores al tratamiento. A diferencia de la significación estadística, el tamaño del efecto medido por Cohen (d) es independiente del tamaño de la muestra y se considera una buena indicación de significación clínica (124). Un efecto se considera grande si d > 0,8 (125). En este estudio, el tamaño del efecto de Cohen (d) varió de 1.05 a 2.14 para ROM y 2.2 para PA, que se consideraría de grande a enorme según Sawilowsky (126).

Este estudio midió el dolor de LS después del tratamiento con RM, sin embargo, no se investigaron los cambios físicos en la unión LS. Sería interesante descubrir qué cambios regenerativos, si los hay, coinciden con la resolución del dolor después del tratamiento. Dado que no habría necesidad de anestesia, MSK US podría ser una opción no invasiva más económica que la resonancia magnética para controlar el cambio en la hidratación del disco mediante la determinación de su ecogenicidad y elastografía. Esta técnica ya ha demostrado la capacidad regenerativa de las MSC en tendones en este estudio al demostrar la reversión del tejido cicatricial, la fibrosis y la mineralización, la resolución del cambio inflamatorio, la curación completa de los desgarros parciales del tendón y la restauración de las entesis normales después del tratamiento. En consecuencia, la determinación del potencial regenerativo de las MSC en el cruce LS utilizando MSK US será el foco de estudios adicionales.

Muchos especialistas ortopédicos prefieren las medidas de resultado objetivas a las medidas de resultado informadas por el cliente (CROM), que incluyen CMI o medidas de CVRS, porque creen que los efectos placebo del cuidador, observados con medidas subjetivas, podrían comprometer la exactitud de sus resultados. Sin embargo, debido a que los CRM son reconocidos como importantes por la FDA y la EMA, estos se han convertido en una parte integral de los ensayos clínicos veterinarios. A pesar de que Cook estipuló que, en los ensayos ortopédicos, los CRM deberían incluir una medida de CVRS (42), todavía hay una tendencia de los investigadores a confiar en los CMI, tal vez porque los estudios en perros han demostrado que el análisis objetivo de la marcha y ciertos CMI producen resultados equivalentes (53). Es interesante observar que, en su Declaración de Posición, Guest et al. utilizan una puntuación CMI baja para indicar una «identificación insignificante del impacto en la calidad de vida» (53). Si bien esta inferencia puede ser cierta, es una asociación indirecta ya que los CMI no son medidas de CV. Mientras que los CMI miden solo la limitación funcional impuesta por la enfermedad, los instrumentos VetMetrica™ HRQL miden el impacto emocional y físico de la enfermedad, y además lo hacen en un continuo de la peor a la mejor CV (46).

Las evaluaciones de VetMetrica fueron completadas por los propietarios de acuerdo con el protocolo del estudio. En el dominio A/C, la mejoría en todas las ventanas de tiempo posteriores al tratamiento en comparación con el pretratamiento fue significativa, con un resultado similar en E/E después de 6 semanas y en H/C y C/R después de 12 semanas. Esto indicó que la mejora en el PWB precedió a la de ISF en 6 semanas. Esto contrasta con el tratamiento de la OA con AINE, donde a menudo se observa una mejoría en ISF antes que cualquier mejora en el PWB (47).

Actualmente faltan estudios que muestren una relación significativa entre la CVRS y las medidas objetivas, pero la mejoría en la CVRS observada aquí reflejó la observada en todas las medidas de resultado objetivas. De hecho, el análisis formal mostró que hubo una relación significativa entre el cambio en todas las puntuaciones del dominio CVRS y el cambio en la distribución del peso, medido por el análisis de postura, proporcionando evidencia de validez de constructo convergente para VetMetrica™. De todas las medidas objetivas utilizadas, el análisis de postura se consideró la medida más adecuada para correlacionar con las medidas de CVRS, ya que es una medida global de la función musculoesquelética. De manera similar, la relación entre el cambio en la postura y el cambio en las evaluaciones de la EFP reflejó la del cambio en la postura y el cambio en las puntuaciones de la CVRS, con relaciones significativas para las tres medidas subjetivas, lo que respalda la hipótesis de que las medidas subjetivas y objetivas pueden producir resultados equivalentes en los ensayos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que si las evaluaciones del impacto del dolor y la CV hubieran sido realizadas por médicos menos experimentados, la relación entre estos y la postura puede no haber sido tan sólida.

Es importante destacar que, además de que la mejoría en la CVRS fue estadísticamente significativa, la significación clínica se demostró por el hecho de que el cambio en las puntuaciones entre el pre y el post-tratamiento fue igual o mayor que el MID en E/E, H/C y A/C. Aunque este no fue el caso de C / R, el hecho de que este dominio se vea afectado por el temperamento del perro, puede haber sido un factor contribuyente.

Las evaluaciones veterinarias para el dolor y el impacto de la CV puntuadas en una escala de calificación numérica (NRS) de 0 a 10 proporcionaron medidas de resultado subjetivas adicionales en este estudio. El NRS es una escala ordinal y un inconveniente importante de su uso es la variabilidad entre observadores. Sin embargo, el hecho de que un solo observador completara todas las evaluaciones eliminó ese riesgo. Con respecto a la evaluación del dolor en individuos no verbales, la Guía de la FDA para la Industria (127) establece que un observador no puede atribuir válidamente una puntuación de dolor en nombre de otro individuo, pero puede observar comportamientos que indican dolor. En consecuencia, en este estudio, la pregunta de evaluación del dolor se redactó cuidadosamente para garantizar que la puntuación reflejara la cantidad de dolor que el observador sentía que el perro estaba sufriendo. En este caso, el observador (AA), un clínico muy experimentado que se ocupa solo de afecciones ortopédicas, estaba bien situado para hacer ese juicio. Existe el argumento de que no se aplicaría lo mismo para juzgar el impacto de la CV, ya que el médico no ve al perro en su entorno familiar, pero el resultado del análisis fue notablemente similar con efectos de ventana de tiempo altamente significativos (p < 0,001) y todas las medias posteriores al tratamiento fueron significativamente menores que antes del tratamiento. Esto puede haber reflejado el estrecho vínculo entre el autor AA, el perro y su dueño, formado durante un período considerable y facilitado por un extenso proceso de consulta complementado con actualizaciones muy regulares sobre el progreso.

Este estudio demostró una reducción significativa del dolor después del tratamiento con RM, medido por AP, análisis de postura (descarga debido al dolor), puntuaciones de dolor veterinario y una reducción significativa en el requerimiento analgésico. Las limitaciones del estudio incluyen la falta de un grupo de control, pero la naturaleza retrospectiva del estudio hizo imposible el informe de un grupo de control. Si hubiera sido posible, los autores habrían considerado que un grupo de control era inapropiado por la siguiente razón: la población del estudio consistía en perros propiedad del cliente con TME que no respondían a los tratamientos estándar en el momento de la derivación, por lo que continuar dicho tratamiento probablemente prolongaría el dolor y el sufrimiento. Sin embargo, cada perro era su propio control, ya que no respondía a los tratamientos convencionales antes de la demostración de mejoras significativas después de las terapias regenerativas dirigidas. Los autores consideran que una limitación adicional es el hecho de que el tamaño de cada grupo de medida de resultado objetiva fue diferente. Esto se debió al amplio espectro de patologías presentes dentro de la población de estudio y las omisiones de la historia clínica, sin embargo, todos los perros tenían al menos dos medidas de resultado registradas. De manera similar, el número de evaluaciones de CVRS se redujo porque la diferencia entre estas y las otras mediciones de resultado tenía que estar dentro de los 14 días de diferencia entre sí para ser incluidas en el análisis. Sin embargo, dado que hubo 954 evaluaciones de 212 perros hasta la semana 104, este número se consideró adecuado para el estudio. La falta de cegamiento del autor AA podría considerarse una limitación del estudio en vista de la evidencia de sesgo del cuidador (128). Esto sería una consideración seria en un ECA, pero no se informa como tal en los estudios de RWD donde los datos se recopilan de diversas fuentes, incluidos los registros electrónicos de pacientes, como fue el caso en este estudio (129).

5. Conclusión

Este estudio presenta los resultados de un estudio longitudinal realizado en una consulta veterinaria especializada en RM, para el tratamiento de una gran población de perros con TME natural que no respondía al tratamiento convencional. Es importante destacar que el estudio cumplió con los criterios mínimos para informar sobre las MSC en aplicaciones ortopédicas publicados recientemente por Guest et al. (53). Esto, junto con el uso de varias medidas de resultado validadas diferentes por un único veterinario experimentado, hacen de este un estudio de importancia única de la eficacia de RM en un entorno clínico. Los resultados han demostrado que el uso de un protocolo estandarizado de números conocidos de MSC derivadas de tejido adiposo autólogo, combinado con PRP pobre en leucocitos cuando corresponda, inyectado en todas las áreas de la patología MSK, dio como resultado efectos positivos rápidos y profundos en el estado de dolor del paciente (algometría de presión, puntuación veterinaria), función (análisis de postura, goniometría) y CV (herramienta de evaluación VetMetrica™ HRQL) durante un máximo de 2 años. Además, este estudio respalda el uso de VetMetrica™ en TME canina al demostrar una relación positiva significativa con una medida objetiva de la función de MSK, proporcionando evidencia para apoyar su valor en ensayos clínicos ortopédicos.

Los autores creen que este estudio exhaustivo a gran escala se suma considerablemente a la evidencia requerida para apoyar el uso de MSC en condiciones ortopédicas caninas y sienta las bases para futuras investigaciones sobre su potencial regenerativo. Además, la RM debe considerarse un componente importante en el enfoque multimodal para el tratamiento de las afecciones degenerativas crónicas de MSK en perros, aunque es imperativo tener cuidado al seleccionar los productos MSC y PRP más sólidos científicamente.

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo / material complementario, las consultas adicionales pueden dirigirse al autor correspondiente.

Declaración ética

El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Panel de Revisión Ética de RCVS. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones del autor

AA, JM y JR: conceptualización. TS: análisis estadístico. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión presentada.

Financiación

Linnaeus Veterinary Limited apoyó los costos de los cargos de publicación de acceso abierto.

Reconocimientos

Agradecemos a Luisa De Risio (Directora de Investigación Clínica y Excelencia de Linnaeus) y Christine Standen (Directora Clínica de Ciencias de la Terapia Celular) por su ayuda con la preparación del manuscrito. Los autores están agradecidos a todos los dueños de perros que voluntariamente proporcionaron datos para este trabajo.

Conflicto de intereses

JR es director de NewMetrica Ltd, la compañía que desarrolla los instrumentos VetMetrica™. JM es un director en Ciencias de la Terapia Celular que suministra las células estromales mesenquimales.

Los autores restantes declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2022.1014687/full#supplementary-material

Abreviaturas

Aire acondicionado, activo y cómodo; BSA: albúmina sérica bovina; CMI, instrumento de metrología clínica; COMP, Programa de medidas de resultados caninos; C/R, Tranquilo y relajado; CROM, medidas de resultado informadas por el cliente; DMEM, Dulbecco’s Modified Eagles Medium; DPBS: solución salina tamponada con fosfato; E/E, Enérgico y entusiasta; EM: Medio de expansión; EMA, Agencia Europea del Medicamento; ISF, Bienestar emocional; FCS: suero fetal de terneros; FDA, Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos; AG: Anestesia general; H/C, Feliz y contento; CVRS: Calidad de Vida Relacionada con la Salud; IV: Intravenosa; IVDD: enfermedad del disco intervertebral; LS Lumbosacral; LSD: enfermedad lumbosacra; LT: Terapia con láser; MID, Diferencia mínima importante; MNT: pruebas nociceptivas mecánicas; MSC: Célula estromal mesenquimal; MSK: Musculoesquelético; NRS: escala de calificación numérica; AINE: antiinflamatorios no esteroideos; OA: Osteoartritis; PA: Algometría de presión; PBM: fotobiomodulación; PWB, Bienestar físico; PRP: plasma rico en plaquetas; PSI: libras por pulgada cuadrada; CV: Calidad de vida; ECA: ensayo clínico aleatorizado; RM: Medicina regenerativa; ROM: rango de movimiento; RWD, datos del mundo real; RWE, evidencia del mundo real; DE: desviación estándar; SS: supraespinoso; US, Ultrasonido (diagnóstico).

Notas

Referencias