El plasma atmosférico frío de argón erradica patógenos in vitro que se asocian con la queratitis bacteriana canina

El plasma atmosférico frío de argón erradica patógenos in vitro que se asocian comúnmente con la queratitis bacteriana canina

El plasma atmosférico frío de argón erradica patógenos in vitro que se asocian comúnmente con la queratitis bacteriana canina

Anne Helene Marx1 Hilke Oltmanns2 Jessica Meißner2 Jutta Verspohl3 Thomas Fuchsluger4 Claudia Busse1*
  • 1Departamento de Medicina y Cirugía de Pequeños Animales, Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Fundación, Hannover, Alemania
  • 2Departamento de Farmacología, Toxicología y Farmacia, Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Fundación, Hannover, Alemania
  • 3Departamento de Microbiología, Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Fundación, Hannover, Alemania
  • 4Departamento de Oftalmología, Universidad de Rostock, Rostock, Alemania

Propósito: Investigar el efecto antimicrobiano del plasma atmosférico frío (NAC) sobre patógenos asociados a la queratitis bacteriana canina.

Materiales y métodos: Se sometieron a pruebas las cepas de Pseudomonas aeruginosaStaphylococcus pseudintermedius y Streptococcus canis, obtenidas de perros con queratitis infecciosa. Para cada especie, se cultivaron cuatro aislados y una cepa de referencia en agar sangre de oveja Columbia y se trataron con la pluma de plasma kiNPen Vet de Neoplas GmbH, Greifswald, Alemania. Se aplicaron varias duraciones de tratamiento continuo (0,5, 2 y 5 min), junto con un tratamiento de 0,5 min repetido cuatro veces a intervalos cortos. Estos tratamientos se realizaron a distancias de 3 y 18 mm entre la superficie del agar y la pluma.®

Resultados: El tratamiento con NAC redujo el crecimiento bacteriano en las tres especies. La duración más efectiva del tratamiento fue de 5 min a una distancia de 3 mm, lo que resultó en zonas de inhibición que oscilaron entre 19 y 22 mm para P. aeruginosa, 26-45 mm para S. pseudintermedius y una reducción general del crecimiento bacteriano para Str. canis. Las zonas de inhibición fueron más pequeñas, con disminución de la duración del tratamiento y mayor distancia. Los tiempos de tratamiento de 30 s repetidos cuatro veces y 2 min mostraron resultados comparables. El tratamiento con argón solo no condujo a una reducción visible del crecimiento bacteriano.

Conclusión: El plasma atmosférico frío de argón demostró un potente efecto antimicrobiano in vitro sobre las cepas de P. aeruginosa, S. pseudintermedius y Str. canis, siendo esta última la que mostró la mayor sensibilidad.

Introducción

El plasma atmosférico frío (CAP) es una herramienta relativamente nueva en medicina que ha ganado mucha atención debido a sus efectos biológicos sobre los microorganismos y los tejidos vivos, capaz de estimular los procesos de cicatrización de heridas en las células eucariotas y erradicar las células procariotas (1, 2).

El CAP es un gas parcialmente ionizado que consta de moléculas cargadas y neutras, campos electromagnéticos, moléculas reactivas libres y es capaz de emitir radiación en el rango visible y ultravioleta (3). El CAP, también denominado plasma no térmico, funciona a temperaturas bien toleradas por el tejido de los mamíferos. Las fuentes plasmáticas más relevantes en medicina son las descargas de barrera dieléctrica y los chorros de plasma a presión atmosférica (1, 4). El principio de este último dispositivo se basa en la ionización de un gas de trabajo entre dos electrodos. Los componentes generados durante este proceso son expulsados de la pluma por el flujo de gas del gas de trabajo en forma de chorro de plasma (5). La exposición a este «cóctel de plasma» a las dianas biológicas genera especies reactivas de oxígeno y nitroso (ROS, RNS) que desempeñan un papel dominante en el impacto sobre las dianas (6). Las ROS y las RNS, que son mediadores importantes en los procesos de señalización, estimularán los procesos relacionados con el redox dentro de las células (7), o pueden causar daño celular al alcanzar concentraciones superiores a las capacidades antioxidantes al inducir estrés oxidativo (8).

Las aplicaciones actuales en el campo de la medicina comprenden principalmente la terapia de heridas crónicas que no cicatrizan (9, 10) y el tratamiento de infecciones de heridas, incluidas las infecciones multirresistentes (11). Los mecanismos identificados de efectos antibacterianos implican daños en la membrana o pared celular, en las proteínas intracelulares y en el ADN (1).

Los campos de interés más recientes incluyen la terapia del cáncer (12, 13), la odontología (14) y la oftalmología (15). Muchos estudios muestran que la NAC puede inducir la apoptosis de las células cancerosas in vitro (16-18). En odontología, se ganó mucha atención debido a la eficacia antibacteriana de la NAC (19-21). En oftalmología humana, la NAC es un área de interés también debido a su fuerte efecto antimicrobiano, demostrado contra diversos patógenos oculares, incluidas bacterias (2, 22, 23), hongos (24), protozoos (25) y virus (26), lo que lo convierte en un dispositivo potencial para la terapia de la queratitis infecciosa. Se estudió la seguridad de la aplicación de chorros de plasma y no causó daños significativos en el tejido ocular dependiendo de la dosis (15, 27). Reitberger et al publicaron la primera serie de casos que demuestran la aplicación de CAP de argón en el tratamiento de la queratitis infecciosa en personas refractivas a la terapia estándar. La adición de CAP de argón al régimen de tratamiento resultó en una mejoría sustancial de la enfermedad después de la tercera o cuarta aplicación (15).

La queratitis ulcerosa infecciosa es una enfermedad frecuente en pequeños animales (28). Se han identificado muchos patógenos corneales asociados con la enfermedad, sin embargo, la mayoría de las bacterias aisladas pertenecen a las especies Pseudomonas aeruginosaStaphylococcus pseudintermedius y Streptococcus canis (29-36). La terapia de elección es el tratamiento antimicrobiano tópico (37, 38). Si el tratamiento no logra controlar la infección, por ejemplo, debido a la elección incorrecta del agente antimicrobiano o a la participación de un aislado bacteriano multirresistente, la enfermedad puede progresar rápidamente con consecuencias que amenazan la vista y el globo (28, 37). Las especies de Staphylococcus aisladas de perros con queratitis infecciosa con frecuencia incluyen aislados resistentes a la meticilina (39). La creciente preocupación por el desarrollo de resistencias antimicrobianas entre los patógenos corneales caninos frente a los agentes antibióticos de uso común (30, 38, 40) y el uso legal restrictivo de los antibióticos por parte de la legislación de la Unión Europea (41), ponen de relieve la importancia de establecer modalidades alternativas de tratamiento antimicrobiano. Por lo tanto, investigamos la eficacia antibacteriana de la NAC de argón contra patógenos corneales aislados de pacientes caninos con queratitis bacteriana.

Materiales y métodos
Aislados bacterianos

Los aislamientos clínicos fueron recolectados por un laboratorio para diagnóstico clínico (LABOKLIN GmbH & Ko KG, Bad Kissingen, Alemania). Se obtuvieron muestras de intercambio de pacientes caninos diagnosticados de queratitis ulcerosa bacteriana con el fin de identificar especies y realizar pruebas de resistencia a los antimicrobianos. Se eligieron cuatro aislamientos de campo de cada una de las siguientes bacterias: Staphylococcus pseudintermedius (SP), Streptococcus canis (SC) y Pseudomonas aeruginosa (PA). Para cada bacteria se incluyó en el estudio una cepa de referencia (DSM 20373, DSM 20716, DSM 10880). Los criterios de inclusión para todos los aislamientos incluyeron la presencia de una úlcera estromal en el momento de la toma de muestras y los perfiles de susceptibilidad a los antimicrobianos disponibles, que se muestran en la Tabla 1. Se incluyeron dos aislamientos de SP resistentes a meticilina y dos no resistentes a meticilina. En el caso de los aislados incluidos en AP fueron resistentes o susceptibles a difloxacino y orbifloxacino, cada grupo también estuvo representado por dos aislados. Los patrones de susceptibilidad a los antimicrobianos entre los aislados SC incluidos fueron similares.

www.frontiersin.orgTabla 1. Susceptibilidad antimicrobiana de aislados clínicos.

Fuente de plasma

Los experimentos se llevaron a cabo utilizando un kINPenVet modificado fabricado por Neoplas GmbH, Greifswald, Alemania, que consta de un dispositivo operativo, una línea de suministro de gas y el bolígrafo de mano. La generación de plasma tiene lugar en los electrodos intermedios de la pluma de mano con un voltaje de alta frecuencia (1,0 MHz, 2-3 kV) cuando se aplica gas argón a un caudal de 4-6 SLM. Esto da como resultado plasma expulsado en forma de chorro de plasma, visible como un haz de aproximadamente 1 cm de longitud.®®

El dispositivo estaba equipado con un interruptor adicional para interrumpir la emisión de plasma. El plasma se genera dentro de la pluma durante la ionización del gas argón con un voltaje de alta frecuencia y luego es un haz puntual rosa de aproximadamente 1 cm de longitud en la punta de la pluma. Se colocó un espaciador transparente que mantiene una distancia mínima de 7 mm entre la punta de la pluma y la superficie tratada (Figura 1).

www.frontiersin.orgFigura 1. La ilustración esquemática muestra la exposición de bacterias en placas de agar con la pluma de plasma a una distancia entre el espaciador y la superficie de agar de 3 o 18 mm. Observe el efecto conductor del haz de plasma en la imagen de la izquierda: la intensidad del haz de luz aumenta y la luz se extiende sobre una pequeña parte del área tratada. Esto sucede cuando el plasma golpea directamente una superficie conductora.

El caudal de gas se ajustó a 4,1 SLM a una presión de gas constante de 2,5 bar (la presión recomendada por el fabricante es de 2-3 bar). Decidimos disminuir el caudal de gas tanto como lo permitiera el dispositivo porque el caudal de gas de 5 SLM que se utilizó en pacientes humanos (15) resultó en la desecación de la superficie del agar (observaciones durante los experimentos preliminares). La modificación del dispositivo permitió apagar la producción de plasma sin modificar el caudal de gas.

Medición de temperatura

Para evaluar si se esperaban efectos térmicos sobre el crecimiento bacteriano, se midió la temperatura del chorro de plasma en la punta del chorro de plasma a través de un elemento de contacto de tipo k de un termómetro digital (MESTEK 800C). El elemento de contacto se expuso a la punta del chorro de plasma durante 5 minutos y se realizaron mediciones cada minuto.®

Experimentos

Los aislados bacterianos se cultivaron de forma rutinaria en agar sangre Columbia (con 7% de sangre de oveja; OXOID) durante un período de incubación de 20-24 h a 37 °C. Se preparó una suspensión bacteriana utilizando un densitómetro óptico (McFarland = 1,0). Se realizó una dilución adicional de 10 veces de la suspensión para cultivar aislados para los experimentos, ya que esto dio como resultado un crecimiento uniforme de bacterias en las placas de agar. Se utilizó la misma suspensión para todos los experimentos con el mismo aislado para eliminar las falsificaciones resultantes de las variaciones en la concentración bacteriana. Se realizaron dos diluciones seriadas para cada suspensión esparciendo 100 μL de suspensión sobre placas de agar por duplicado.

Las placas inoculadas se trataron con gas argón o plasma durante 0,5, 2, 5 y 4 × 0,5 min (con una pausa de 0,25 min entre ellas, que es el tiempo aproximado necesario para aplicar un colirio lubricante). Los tiempos de tratamiento se seleccionaron en función de los resultados del estudio de Reitberger et al. (15), que mostraron efectos antimicrobianos tras el tratamiento de patógenos corneales humanos durante 2, 5, 7 y 10 min utilizando el mismo dispositivo. Consideramos que el tratamiento de la superficie corneal de animales pequeños durante 7 y 10 min no era clínicamente aplicable con el dispositivo actual y no incluía tratamientos superiores a 5 min. Además, en el estudio mencionado anteriormente se seleccionó un tiempo de tratamiento de 0,5 min para la aplicación en experimentos in vivo. Por lo tanto, decidimos incluir 0,5 min en nuestro protocolo. En la Figura 1 se puede ver una descripción general del protocolo de tratamiento.

La pluma de plasma estaba estacionaria y la distancia entre el espaciador y la placa se ajustaba a 3 o 18 mm. Una distancia de 3 mm era la distancia más grande que aún resultaba en contacto entre el haz de plasma y la superficie, creando un modo conductor. Queríamos investigar los efectos de una distancia mayor que evitaría el contacto directo del chorro, lo que podría reducir los efectos del flujo de gas en el tejido corneal. Los estudios preliminares (no publicados) no mostraron resultados consistentes con la distancia utilizada previamente de 5 cm. Una distancia de 2 cm resultó en menos efectos de secado (datos no publicados) y por razones técnicas se utilizó una distancia de 18 mm. Como control, se repitieron todos los protocolos con gas argón solo. Todas las placas de agar se incubaron durante 19-21 h a 37 °C. Las diluciones seriadas se determinaron mediante el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC). Las placas tratadas se evaluaron para las zonas de inhibición que se midieron utilizando un calibre vernier de acero inoxidable (mm). En el caso de las zonas de inhibición de forma circular se midió el diámetro, en las zonas de forma irregular se tomaron dos mediciones: una en el ancho más ancho y otra en el ancho más pequeño de la zona. En el caso de márgenes mal definidos, se midieron las zonas donde era visible una reducción del crecimiento bacteriano. Se registró una reducción general del crecimiento bacteriano, pero no se clasificó más. Los experimentos se realizaron por duplicado y los resultados se dan como valores medios.

Resultados
Medición de temperatura

Los resultados de las mediciones de temperatura mostraron valores entre 39,8 y 40,1 °C durante todo el período de tratamiento.

Tratamiento de aislados

Todos los protocolos de tratamiento mostraron un claro efecto antimicrobiano visible como una zona de inhibición o una reducción general del crecimiento bacteriano en las placas de agar tratadas. No se observó ningún efecto antimicrobiano en las placas tratadas únicamente con gas argón. Las zonas de inhibición variaron en forma y definición de márgenes entre especies bacterianas, duración del tratamiento y distancia del espaciador a la superficie tratada. El tratamiento de los aislados de P. aeruginosa, S. pseudintermedius y Scanis dio lugar a zonas de inhibición con forma circular con márgenes distintos o indistintos, o con una forma irregular o reducción general del crecimiento bacteriano, respectivamente. Las zonas de inhibición se pueden ver en las Figuras 1-3, sus medidas se pueden tomar de la Tabla 2.

www.frontiersin.orgTabla 2. Tamaño de las zonas de inhibición de los aislados de P. aeruginosa (PA1-4), S. canis (SC1-4), S. pseudintermedius (SP1-4) y sus cepas de referencia (PAR, SCR, SPR) expresadas en mm.

Pseudomonas aeruginosa

Las zonas de inhibición de todos los aislados de P. aeruginosa y de la cepa de referencia fueron circulares con márgenes distintos, como se muestra en la Figura 2. Una duración del tratamiento de 5 min a una distancia de 3 mm tuvo el efecto antimicrobiano más fuerte y dio lugar a zonas de inhibición que oscilaron entre 19 y 22 mm (cepa de referencia: 22 mm). La duración menos efectiva del tratamiento fue de 30 s a una distancia de 18 mm que dio lugar a zonas que oscilaron entre 5 y 6 mm (cepa de referencia: 5 mm). El tiempo de exposición de 30 s a una distancia de 3 mm dio lugar a zonas de inhibición que oscilaban entre 11 y 16 mm (deformación de referencia: 16 mm), el tiempo de exposición de 2 minutos a la misma distancia dio lugar a zonas de inhibición de 18-19 mm (deformación de referencia: 19 mm). La exposición de las bacterias a 2 minutos o 30 s repetidas cuatro veces dio lugar a zonas de inhibición similares que oscilaron entre 17-19 mm y 17-18 mm con una distancia de 3 mm y entre 9-11 mm y 9-11 mm con una distancia de 18 mm, respectivamente.

www.frontiersin.orgFigura 2. Las zonas de inhibición de un aislado de Pseudomonas aeruginosa después de la exposición a CAP durante 30 s, 4 × 30 s, 2 min, 5 min a una distancia de 3 mm son circulares y tienen bordes distintos. Ninguno de los tratamientos con gas argón por sí solo dio lugar a la formación de zonas de inhibición.

Staphylococcus pseudintermedius

La morfología de las zonas de inhibición de los aislados de S. pseudintermedius y la cepa de referencia variaron entre los diferentes tiempos de exposición y distancias (Figura 3). Se observó una duración del tratamiento de 30 s y 2 min, independientemente de la distancia, en una zona de inhibición circular con márgenes distintos. Una duración del tratamiento de 5 min a una distancia de 3 mm dio lugar a una zona de inhibición circular con márgenes indistintos o a una zona de inhibición de forma irregular. La duración del tratamiento de 5 min a una distancia de 18 mm dio lugar a zonas de forma circular con márgenes indistintos.

www.frontiersin.orgFigura 3. Las zonas de inhibición de un aislado de Staphylococcus pseudintermedius después de la exposición a NAC durante 30 s, 4 × 30 s, 2 min, 5 min a una distancia de 3 mm son circulares y los bordes se vuelven mal definidos con una mayor duración del tratamiento.

Una duración del tratamiento de 5 min a una distancia de 3 mm tuvo el efecto antimicrobiano más eficaz y dio lugar a zonas de inhibición que oscilaron entre 28 y 43 mm (cepa de referencia: 45 mm). La duración menos efectiva del tratamiento fue de 30 s a una distancia de 18 mm, lo que dio lugar a zonas de 3 mm (deformación de referencia: 4 mm). El tiempo de exposición de 30 s a una distancia de 3 mm dio lugar a zonas de inhibición de 14 mm (deformación de referencia: 14 mm), el tiempo de exposición de 2 minutos a la misma distancia dio lugar a zonas de inhibición de 20-24 mm (deformación de referencia: 22 mm). La exposición de las bacterias a 2 minutos o 30 s repetidas cuatro veces dio lugar a zonas de inhibición similares que oscilaron entre 20 y 24 mm y 21 a 25 mm con una distancia de 3 mm y entre 9 y 14 mm y 9 a 14 mm con una distancia de 18 mm, respectivamente.

Streptococcus canis

La respuesta de los aislados de S. canis y de la cepa de referencia al tratamiento con plasma frío fue más variable entre las especies bacterianas. Las zonas de inhibición eran circulares con márgenes distintos o indistintos, de forma irregular o no medibles debido a una reducción general del crecimiento bacteriano (Figura 4). El tratamiento durante 30 s con ambas distancias dio lugar a zonas de inhibición con márgenes distintos, 2 min y cuatro veces 30 s, ambas a 18 mm de distancia, dio lugar a zonas de forma circular con márgenes distintos o indistintos. La duración del tratamiento de 2 min y cuatro veces 30 s a una distancia de 3 mm dio lugar a zonas de inhibición de forma irregular. Una duración del tratamiento de 5 minutos dio como resultado una reducción general del crecimiento bacteriano en la placa en el caso de una distancia de 3 mm, o en una zona de inhibición de forma irregular en el caso de una distancia de 18 mm.

www.frontiersin.orgFigura 4. Se muestran las zonas de inhibición de un aislado de Streptococcus canis después de la exposición a CAP durante 30 s, 4 × 30 s, 2 min, 5 min a una distancia de 3 mm. Con un tratamiento corto, las zonas eran circulares con bordes indefinidos, con tiempos de tratamiento más largos las formas se volvían irregulares. Un tratamiento de 5 minutos dio como resultado una reducción del crecimiento bacteriano en toda la placa de agar.

El efecto antimicrobiano más eficaz se logró con una duración del tratamiento de 5 minutos a una distancia de 3 mm, lo que resultó en una reducción general del crecimiento bacteriano. La duración menos efectiva del tratamiento fue de 30 s a una distancia de 18 mm que dio lugar a zonas que oscilaron entre 5 y 10 mm (cepa de referencia: 4 mm). El tiempo de exposición de 30 s a una distancia de 3 mm dio lugar a zonas de inhibición que oscilaron entre 18 y 19 mm (deformación de referencia: 18 mm), el tiempo de exposición de 2 minutos a la misma distancia dio lugar a zonas de inhibición con una anchura mínima y máxima que osciló entre 40 y 50 mm (deformación de referencia: 41 mm) y de 46 a 73 mm (deformación de referencia: 57 mm), respectivamente. La exposición de las bacterias a 2 minutos o 30 s repetidas cuatro veces a una distancia de 3 mm dio lugar a zonas de inhibición de forma irregular variable con un ancho mínimo y máximo que oscilaba entre 40 y 73 mm y 37 a 54 mm, respectivamente. Las duraciones del tratamiento de 2 min y 30 s repetidas cuatro veces a una distancia de 18 mm dieron lugar a zonas de inhibición que oscilaron entre 20-29 mm y 21-28 mm, respectivamente.

Comparación de especies bacterianas y tratamientos

El aumento de la duración del tratamiento y la reducción de la distancia al espaciador dieron lugar a zonas de inhibición más grandes en todas las especies, por lo que el efecto antimicrobiano más fuerte se detectó después de una duración del tratamiento de 5 min a una distancia de 3 mm, el menor después de una duración del tratamiento de 30 s a una distancia de 18 mm.

Una duración del tratamiento de 30 s a una distancia de 3 mm dio lugar a zonas de inhibición de hasta 16, 15 y 19 mm en el caso de los aislados de P. aeruginosa, S. pseudintermedius y S. canis, respectivamente. Estas zonas fueron aún más grandes en comparación con las resultantes de una duración de tratamiento de 2 min a 18 mm de distancia en los aislados de P. aeruginosa y S. pseudintermedius e incluso fueron similares a las resultantes de un tratamiento de 5 min a 18 mm de distancia en el caso de los aislados de P. aeruginosa.

Discusión

Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que evalúa la eficacia antibacteriana in vitro del plasma atmosférico frío de argón contra los patógenos corneales comunes involucrados en la queratitis bacteriana canina. Todos los aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosaStaphylococcus pseudintermedius y Streptococcus canis fueron susceptibles a la exposición a la NAC de argón.

Patrones de sensibilidad de diferentes bacterias

Los efectos esterilizantes de la NAC en varias especies bacterianas están bien informados (2, 11, 15, 19-23, 42-46), sin embargo, existen diferencias en los patrones de sensibilidad entre especies (15, 42, 43, 47-50). También se observaron diferentes niveles de sensibilidad en nuestro estudio, presentándose como zonas de inhibición de tamaño y forma variables. Los aislamientos de S. canis mostraron las zonas de inhibición más grandes y el crecimiento bacteriano se inhibió dentro de las áreas que se extienden mucho más allá de la mancha tratada focalmente. Las zonas de inhibición de los aislados de S. pseudintermedius y Scanis mostraron márgenes mal definidos. Esto podría deberse a una menor concentración de componentes de plasma en la periferia del chorro de plasma, ya que son altamente reactivos en el aire atmosférico (3). Las zonas de inhibición de P. aeruginosa, por el contrario, tenían márgenes bien definidos y tenían forma circular. Por lo tanto, sospechamos que la erradicación de P. aeruginosa requiere la exposición a concentraciones más altas de plasma, lo que está respaldado por un estudio previo que compara la susceptibilidad de P. aeruginosa a los aislados de S. pseudintermedius de infecciones cutáneas en perros (50). Los estudios in vitro actuales muestran resultados contradictorios en lo que respecta a la diferencia en la susceptibilidad de las especies Gram positivas y Gram negativas (15, 46, 47, 51, 52). Algunos estudios reportan una mayor sensibilidad de las bacterias Gram negativas en comparación con las Gram positivas (51, 52). Dado que se considera que el daño a la membrana celular desempeña un papel importante en el mecanismo de eficacia antimicrobiana de la NAC, se postula que la morfología de la pared celular contribuye a la diferencia de sensibilidad (51, 52). Los resultados de nuestro estudio no apoyan esta teoría. Los aislados de S. canis fueron los más susceptibles en nuestro estudio, lo que puede enfatizar que el daño a la membrana celular no es el único mecanismo de eficacia antibacteriana (53). Este hallazgo se correlaciona con un estudio previo que mostró un aumento de los radicales reactivos de oxígeno intracelulares en especies Gram positivas en comparación con las Gram negativas después de la exposición a CAP (48). La razón exacta de esto sigue siendo desconocida.

Como postulamos que la duración máxima del tratamiento a la vez es de 30 s, por razones que se discutirán más adelante, incluimos un tratamiento de intervalos de 2 min que consta de 4 intervalos con 15 s entre ellos. Los resultados de ese protocolo mostraron resultados similares a los de los protocolos que utilizaron 2 minutos de exposición completa en todas las especies bacterianas. Por lo tanto, no esperamos una disminución de la eficacia antibacteriana del tratamiento interválico en el caso de una duración del tratamiento de 2 minutos.

Las reacciones bioquímicas y biofísicas complejas e incompletamente comprendidas de los diferentes patógenos a los componentes de la NAC causan diferentes patrones de sensibilidad entre las especies bacterianas, los aislados de S. canis fueron los más susceptibles a la exposición a la NAC en nuestro estudio.

Eficacia frente a aislados multirresistentes

La NAC es altamente efectiva en la erradicación de bacterias multirresistentes in vitro e in vivo, como los aislados de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) (44, 54, 55). Esto está en concordancia con los hallazgos de nuestro estudio que muestran que el tratamiento de dos aislados resistentes a meticilina de S. pseudintermedius logró resultados muy similares en comparación con los aislados sensibles a meticilina. El desarrollo de multirresistencias contra la NAC parece poco probable, ya que múltiples componentes están implicados en la eficacia antibacteriana (42, 53, 56, 57). Además, la NAC puede incluso aumentar la eficacia de los agentes antibióticos, ya que su exposición previa aumenta la sensibilidad de las cepas de Staphyloccus aureus resistentes a la meticilina (SARM) a los antibióticos (58). Además del SARM, la erradicación de los aislados de Staphylococcus pseudintermedius resistentes a la meticilina también puede ser un objetivo potencial de la aplicación de la NAC.

Factores que influyen en la eficacia antimicrobiana

Los resultados de los antimicrobianos dependen de una serie de factores variables, como la elección de la fuente de plasma, la fuente de alimentación, el gas de trabajo y la dosis de NAC. El tipo de fuentes plasmáticas está influyendo en la eficacia, ya que pueden utilizar técnicas variables de generación de plasma que producen plasma de diferente composición y cantidad (1, 42). El principio de la generación de plasma de chorros de plasma se basa en la ionización de un gas de trabajo que fluye entre dos electrodos. El tipo de gas de trabajo, por ejemplo, argón o helio, influye en la eficacia antimicrobiana, ya que la concentración de radicales reactivos de oxígeno en el plasma difiere según el tipo de gas (59, 60). Se ha reportado que es mayor en el plasma generado con gas argón en comparación con el gas helio (59, 60). El dispositivo de nuestro estudio funciona con gas argón, lo que tiene varias ventajas. Entre ellos se encuentran una buena tolerancia tisular (61), su presencia natural en la atmósfera (62) y la extracción simple por licuefacción de aire (63). Otra ventaja del argón en la investigación es su «estado inerte», lo que nos permitió su uso en nuestros experimentos de control que verificaron que el gas argón no tiene un efecto antibacteriano en sí mismo. El gas helio, por el contrario, no es renovable y su reciclado es demasiado bajo para cubrir el suministro actual, lo que provoca escasez y un aumento de los precios a largo plazo (64). Otro factor que influye en la eficacia antimicrobiana de la NAC es la adición de diferentes concentraciones de oxígeno al gas de trabajo (46). La investigación del efecto sobre los patógenos mediante la adición de oxígeno al gas argón no estaba dentro del alcance del presente estudio. La dosificación de plasma también tiene un impacto significativo en la eficacia antimicrobiana (15, 42, 48-50). Esto se correlaciona con los resultados de nuestro estudio que muestran que la eficacia fue mayor con un mayor tiempo de exposición y una menor distancia a la superficie tratada.

El elevado número de factores que pueden influir en la eficacia antimicrobiana in vitro hace que sea muy difícil comparar la eficacia antibacteriana de diferentes estudios (1). Por lo tanto, es posible que los resultados observados en nuestro estudio no se reproduzcan utilizando una fuente de plasma, un gas de trabajo o un diseño experimental diferentes.

Limitaciones del estudio

Las limitaciones de este estudio fueron el bajo número de aislamientos analizados y la inclusión de solo tres especies bacterianas diferentes de la superficie ocular. Es necesario ampliar los experimentos a otros patógenos de la córnea en perros para investigar más a fondo el espectro antibacteriano del plasma atmosférico frío de argón.

Investigaciones futuras

El uso potencial de la NAC generada por el kINPenVET en la terapia de la queratitis bacteriana en pacientes caninos requiere futuras investigaciones. Esto debería centrarse en la seguridad del tejido ocular, la profundidad de penetración de la NAC en el tejido corneal y su eficacia in vivo contra los patógenos corneales.®

Algunos ejemplos de posibles mecanismos de daño al tejido ocular que acompañan a la exposición a la NAC pueden ser las interacciones con especies reactivas, la exposición a la luz ultravioleta (65) o la desecación de la superficie ocular por altas tasas de flujo de gas (15).

La investigación actual centrada en la seguridad de la NAC para el tejido corneal humano es prometedora, ya que muestra que la NAC no produce efectos nocivos en cultivos in vitro de diferentes células oculares si se aplica durante un máximo de 5 minutos (15, 27). Incluso se ha demostrado que la CAP aumenta la viabilidad de las células epiteliales limbales corneales in vitro después de una exposición a la CAP de argón durante un máximo de 2 minutos. La exposición durante 5 min no influyó en la viabilidad, mientras que se observó una disminución después de 10 min (15). Los radicales libres se consideraron tóxicos durante mucho tiempo debido a su alta reactividad (66), sin embargo, estudios recientes han demostrado que los procesos intracelulares dependen de la presencia de radicales libres (1). Lo más probable es que su presencia desempeñe el papel dominante en los efectos estimulantes sobre las células, lo que resulta en un aumento de la migración celular (67) y la proliferación (68). Además, en las heridas crónicas, los procesos importantes que dependen de los radicales se ven afectados y pueden ser reestimulados por el aumento de las concentraciones intracelulares de especies reactivas (1). Las córneas tratadas hasta 5 min no mostraron cambios histopatológicos en los estudios con diferentes dispositivos (15, 23, 45, 69, 70). La tasa de epitelización corneal en conejos no se vio afectada por la aplicación de NAC durante 2 min (69). La luz ultravioleta (UV) es uno de los componentes de la NAC con efectos tóxicos bien reportados en el tejido corneal (71). El riesgo de daño inducido por los rayos UV durante la exposición a la NAC se considera bajo debido a que la emisión de luz UV durante la generación de la NAC es baja (72) y no hubo evidencia de daño inducido por los rayos UV a los fibroblastos conjuntivales y las muestras corneales después de la exposición durante un máximo de 5 minutos en estudios anteriores (2, 27). Se observó una desecación de la superficie ocular después de la aplicación de la pluma de plasma kINPen MED (Neoplas GmbH) en la córnea de pacientes humanos durante 30 s (15). Esto es consecuencia de un alto caudal de gas del gas de trabajo que es necesario para concentraciones de plasma adecuadas y ayuda en el enfriamiento del dispositivo (comunicación personal con Neoplas GmbH). Decidimos reducir el caudal de gas a 4,1 SLM por razones técnicas, sin embargo, puede reducirse hasta un caudal de 2 SLM según el fabricante. Postulamos que la lubricación del ojo del paciente durante la terapia puede ser necesaria cada 30 s, ya que es menos probable que la interrupción del tratamiento interfiera con la eficacia antimicrobiana, como se discutió en la sección anterior.®®

La investigación sobre la profundidad de penetración de la NAC en el tejido corneal es escasa. Un estudio que utilizó un modelo de tejido estromal corneal mostró que el efecto antimicrobiano sobre E. coli era evidente a una profundidad de hasta 200 μm (73). Sin embargo, la NAC en este estudio fue generada por una fuente de plasma diferente.

Existen estudios que investigan la eficacia antimicrobiana de la NAC en patógenos oculares en condiciones ex o in vivo. Por ejemplo, la NAC se utilizó para tratar con éxito córneas infectadas experimentalmente ex vivo (15, 24, 27, 45) e in vivo (22) de personas, conejos y cerdos. Las infecciones corneales de origen natural en las personas fueron tratadas con NAC utilizando el kINPen MED (15). En todos los estudios, el tratamiento con NAC sola o como complemento del tratamiento estándar fue eficaz para controlar la infección y dio lugar a la curación de la ulceración corneal.®

Con base en la literatura actual, la aplicación de NAC en pacientes con infecciones corneales puede ser segura y en teoría eficiente para tratar la infección, sin embargo, se necesitan estudios clínicos aleatorizados con grupos control para confirmar su eficacia en la terapia de la queratitis bacteriana. Fomentamos la investigación de todos estos aspectos en animales de compañía, ya que actualmente son escasos.

Conclusión

Concluimos que el plasma atmosférico frío de argón demuestra un potente efecto antibacteriano in vitro sobre las cepas de P. aeruginosa, S. pseudintermedius y Str. canis, bacterias que se encuentran con mayor frecuencia en la queratitis bacteriana canina. También es capaz de erradicar bacterias multirresistentes, incluidos los aislados de S. pseudintermedius resistentes a la meticilina y puede aumentar la eficacia de los antibióticos si se usan en combinación (58). Si futuras investigaciones confirman nuestros resultados y la seguridad de su aplicación, el plasma atmosférico frío podría ser una alternativa prometedora o un coadyuvante a los antibióticos en la superficie ocular de los perros. Por lo tanto, podría contribuir a la reducción del consumo de antibióticos, lo que está en consonancia con el enfoque «Una sola salud» (74).

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo/material complementario, las consultas posteriores pueden dirigirse al autor correspondiente.

Declaración ética

No se requirió aprobación ética para el estudio con animales de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales porque los aislados bacterianos utilizados en el estudio se obtuvieron previamente de pacientes clínicos para la identificación de especies y pruebas de susceptibilidad (razones no relacionadas con el estudio).

Contribuciones de los autores

AM: Investigación, Metodología, Visualización, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. HO: Metodología, Recursos. JM: Metodología, Recursos. JV: Metodología, Recursos. TF: Conceptualización. CB: Conceptualización, Metodología, Supervisión, Visualización, Redacción – Revisión y Edición.

Financiación

El/los autor/es declara(n) haber recibido apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Esta publicación de acceso abierto será financiada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) – 491094227 «Financiación de Publicaciones de Acceso Abierto» y la Fundación de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover.

Reconocimientos

Nos gustaría agradecer a Thomas von Woedtke y Veronika Hahn del Instituto Leibniz de Ciencia y Tecnología del Plasma, Greifswald, por su apoyo. Además, agradecemos a Paul Lüttjohann y Sven Glitsch de Neoplas GmbH Greifswald por la modificación de nuestro dispositivo de plasma y a Viktoria Nepke y sus colegas del laboratorio del Departamento de Farmacología, Toxicología y Farmacia por su apoyo constante durante nuestros experimentos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

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Palabras clave: pluma plasmática, plasma no térmico, úlcera bacteriana, eficacia antibacteriana, MRSP

Cita: Marx AH, Oltmanns H, Meißner J, Verspohl J, Fuchsluger T y Busse C (2024) El plasma atmosférico frío de argón erradica patógenos in vitro que se asocian comúnmente con la queratitis bacteriana canina. Frente. Vet. Sci. 10:1320145. doi: 10.3389/fvets.2023.1320145

Recibido: 11 de octubre de 2023; Aceptado: 21 de diciembre de 2023;
Publicado: 09 Enero 2024.

Editado por:

Amjad Islam Aqib, Universidad de Ciencias Veterinarias y Animales de Cholistán, Pakistán

Revisado por:

Piera Anna Martino, Universidad de Milán, Italia
Cristin Coman, «Cantacuzino», Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Médico-Militar, Rumania
Hafiz Iftikhar Hussain, Universidad de Ciencias Veterinarias y Animales de Cholistán, Pakistán

Derechos de autor © 2024 Marx, Oltmanns, Meißner, Verspohl, Fuchsluger y Busse. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons Attribution License (CC BY).

*Correspondencia: Claudia Busse, claudia.busse@tiho-hannover.de

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