El vector basado en el herpesvirus bovino
El vector basado en el herpesvirus bovino 4 que entrega el virus de la peste de los pequeños rumiantes La hemaglutinina ORF induce anticuerpos neutralizantes y respuestas citotóxicas de células T
Francesca Macchi1, 
José Manuel Rojas2, 
Andrea Elizabeth Verna1, 
Noemí Sevilla2, Valentina Franceschi1, Giulia Tebaldi1, Sandro Cavirani1, 
Verónica Martín2 y 
Gaetano Donofrio1*- 1Departamento de Ciencias Veterinarias Médicas, Universidad de Parma, Parma, Italia
- 2Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA), Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria, Madrid, España
El virus de la peste de los pequeños rumiantes (PPRV) es un morbillivirus extremadamente infeccioso que afecta principalmente a cabras y ovejas. En los países subdesarrollados, donde el ganado es el principal recurso económico, el VPSP causa pérdidas económicas considerables. Actualmente se dispone de vacunas vivas atenuadas protectoras, pero inducen respuestas de anticuerpos similares a las producidas en animales infectados naturalmente por el virus de la peste de pequeños rumiantes. Se requieren vacunas eficaces capaces de distinguir entre animales vacunados e infectados naturalmente para los programas de control y erradicación del VPSR. La hemaglutinina (H) es una glicoproteína de la envoltura PPRV altamente inmunogénica que muestra actividades de hemaglutinina y neuraminidasa, desempeñando un papel crucial en la unión y penetración del virus. En este estudio, se evaluó un vector recombinante basado en Herpesvirus-4 bovino (BoHV-4) que administra un casete optimizado de expresión de hemaglutinina PPRV, BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK, en ratones C57BL / 6 inmunocompetentes. La inmunización BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK-provocó respuestas inmunes celulares y humorales con células T específicas, linfocitos T citotóxicos y anticuerpos seroneutralizantes contra PPRV. Estos datos sugieren que el BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK recombinante es un candidato a vacuna eficaz para proteger contra la infección por rebaños por el virus de la peste de pequeños rumiantes y potencialmente aplicable para los programas de erradicación.
Introducción
La peste de pequeños rumiantes (PPR) es una enfermedad a menudo mortal, altamente contagiosa y devastadora que afecta a los pequeños rumiantes domésticos y especialmente a las cabras. La PPR es una enfermedad (http://www.oie.int/animal-health-in-the-world/oie-listed-diseases-2018/) incluida en la lista de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE), endémica en varios países como India, Turquía, África y Asia sudoccidental y central. Las lesiones en la boca y la lengua, la tos, la diarrea, la secreción nasal y ocular y la depresión son signos clínicos típicos de la enfermedad por PPR. El agente etiológico de la enfermedad de la PPR es el virus de la peste de pequeños rumiantes (PPRV), un virus de ARN monocatenario envuelto en sentido negativo perteneciente a la familia Paramixoviridae, género Morbillivirus (1) cuyo genoma contiene seis genes que codifican ocho proteínas. Entre estos, la hemaglutinina (H) es una glicoproteína estructural con actividades de hemaglutinina y neuraminidasa, involucrada en la orientación de la célula huésped y la unión del virus. La glicoproteína H es un antígeno inmunodominante que, por sí solo, puede estimular una respuesta inmune protectora cuando es administrado por varios vectores virales, principalmente basados en adenovirus (2-4) y poxvirus (5, 6). Estas propiedades inmunes del antígeno permitirían la generación de una vacuna de diferenciación de animales infectados de animales vacunados (DIVA). Dado que la glicoproteína PPRV H es el único antígeno PPRV expresado por el vector viral, el uso de un ELISA contra un antígeno diferente, como la proteína nucleo-cápside (N) PPRV, permitiría distinguir los animales infectados naturalmente de los animales vacunados. Los vectores virales no son simplemente sistemas de entrega, sino que también pueden funcionar como adyuvantes, estimulando de manera inequívoca el sistema inmunológico y, por lo tanto, aumentando la inmunidad activa / protectora específica. Se han probado diferentes clases de virus como vectores virales y cada uno presenta ventajas y desventajas particulares, dependiendo de sus características biológicas y del huésped, que necesita ser protegido contra una enfermedad específica. Por lo tanto, es arduo predecir qué vector viral podría ser el mejor. Un vector viral específico debe ser capaz de conferir inmunización selectiva sólo contra un patógeno específico y no hacia otros. En consecuencia, sería de gran interés explorar nuevas vacunas vectoriales basadas en diferentes virus. El herpesvirus bovino 4 (BoHV-4) es un virus del genoma dsDNA perteneciente a la familia Herpesviridae, subfamilia Gammaherpesvirus y género Rhadinovirus. El huésped natural de BoHV-4 es el ganado, mientras que su mejor huésped experimental es el conejo. Sin embargo, el BoHV-4 se ha aislado de especies bovinas domésticas y no domésticas como el búfalo africano (Syncerus caffer) (7), el bisonte americano (Bison bison) o el cebú (Bos indicus) y pequeños rumiantes como ovejas y cabras (8). También se reportaron algunos aislados felinos de leones (9) y gatos (10). Además, también se obtuvieron aislados de BoHV-4 del riñón de un mono aparentemente sano (Aotus trivirgatus) (11). BoHV-4 puede replicarse in vitro en cultivos primarios y líneas celulares de una variedad de especies animales (12-18), mientras que in vivo, puede infectar experimentalmente ratones (16, 19, 20), ratas (21), conejos (15), ovejas (13), cerdos (22) y Avena (18). Además, también se han observado infecciones ex vivo de explantes de tejido de primates no humanos (artículo en preparación). Otra característica importante de BoHV-4, que lo convierte en un vector de entrega de genes atractivo, es que, a diferencia de otros herpesvirus gamma, BoHV-4 no es oncogénico y su infección no está directamente relacionada con una patología específica. Dado que el vector basado en BoHV-4 se ha empleado con éxito para inmunizar ratones (16, 19, 20), ovejas (13) y cabras (18), en el presente trabajo, se realizó un estudio exploratorio de inmunización para PPRV en ratones, antes de aplicar el vector basado en BoHV-4 en ovejas y cabras. Se generó un BoHV-4 recombinante que expresa el gen de la hemaglutinina PPRV (cepa Nigeria 75/1). Los ratones inmunizados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK desarrollaron anticuerpos neutralizantes de PPRV y respuestas específicas de células T PPRV. Estos datos indican que este vector basado en BoHV-4 podría ser un candidato eficaz para la vacuna PPR para pequeños rumiantes que podría distinguir entre animales infectados y vacunados.
Materiales y métodos
Células y virus
En este estudio, HEK (riñón de embrión humano) 293 T (ATCC: CRL-11268), BEK (riñón de embrión bovino) del Dr. M. Ferrari, Istituto Zooprofilattico Sperimentale, Brescia, Italia (BS CL-94) y BEK cre, que expresa cre recombinasa (14), se cultivaron en Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM, Gibco) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina (Gibco), 100 UI / ml de penicilina (Gibco), 100 μg/ml de estreptomicina (SIGMA) y 0,25 μg/ml de anfotericina B (Gibco) y se incubaron a 37°C, 5% CO2 en una incubadora humidificada. Las líneas celulares Vero Dog-SLAM (VDS) y RMA-s (23), amablemente proporcionadas por el Dr. Parida (IAH, Pirbright, Reino Unido) y el Dr. McArdle (The Nottingham Trent University, Reino Unido), respectivamente, se cultivaron como se describe en Ref. (24, 25).
Generación de constructos
El ORF PPRV-H sintético se amplificó por primera vez a partir de la plantilla pGEM-T Easy-PPRV-H mediante PCR utilizando el sensor NheI-PPRV-H (5′-ccccgctagcccaccatgtccgcaaagggaaagg-3′) y el par de cebadores antisentido Phos-PPRV-H (5′-agactggattacatgttacctc-3′) para insertar el sitio de restricción NheI en el extremo 5′ y un grupo fosfato en el extremo 3′. El amplicón PPRV-H generado se clonó en NheI/SalI corte romo pIgK-E2BVDV3-Gd106 vector lanzadera intermedio (Clontech) para generar pIgK-PPRV-H-gD106. El gD106 el fragmento marcado se extirpó del corte plásmido intermedio con enzimas de restricción contundente NheI y BamHI para ser posteriormente clonado dentro del pINT2-Corte vectorial lanzadera final EGFP con enzimas de restricción NheI y SmaI para generar pINT2-PPRV-H-gD106.
Transfección transitoria
Las células T HEK 293 se sembraron en seis placas de pocillos (3 × 105 células/pocillo) e incubado a 37°C con 5% de CO2. Cuando las células eran subconfluentes, se eliminaba el medio de cultivo y las células se transfectaban con pIgK-PPRV-H-gD106pinta2-PPRV-H-gD106, y pEGFP-C1 utilizando reactivo de transfección de polietilenimina (PEI) (Polysciences, Inc.). Brevemente, se mezclaron 3 μg de ADN con 7,5 μg de PEI (1 mg/ml) (relación 1:2,5 ADN:PEI) en 200 μl de medio esencial modificado (DMEM) de glucosa alta (Euroclon) de Dulbecco sin suero. Después de 15 min a temperatura ambiente, se añadieron 800 μl de medio sin suero, y la solución de transfección se transfirió a las células (monocapa) y se dejó durante 6 h a 37°C con 5% de CO2, en una incubadora humidificada. La mezcla de transfección se reemplazó con EMEM medio fresco, con 10% FBS, 100 UI / ml de penicilina, 100 μg / ml de estreptomicina y 0.25 μg / ml de anfotericina B, y se incubó durante 24 h a 37 ° C con 5% de CO2.
Western Immunoblotting
Los extractos de células proteicas se obtuvieron de una placa confluente de seis pocillos de células T HEK 293 transfectadas con pIgK-PPRV-H-gD106pinta2-PPRV-H-gD106, y pEGFP-C1 y a partir de 25 cm2 matraces confluentes de células BEK infectadas con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK mediante la adición de 100 μl de tampón de extracción celular (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl y 1% NP-40; pH 8). Para analizar los extractos celulares, se utilizó una electroforesis en gel SDS-PAGE al 10%. Después de la transferencia de proteínas en membranas de PVDF por electroblotting, las membranas se incubaron con anti gD bovino primario106 anticuerpo monoclonal (clon 1B8-F11; VRMD, Inc., Pullman, WA, EUA) diluido 1:10.000 y luego sondeado con inmunoglobulina anti-ratón marcada con peroxidasa de rábano picante (SIGMA), diluida 1:10.000, y bandas visualizadas por quimioluminiscencia mejorada (ECL KIT; PIERCE).
Recombinación y selección de BAC
La recombinación se realizó como se describió anteriormente (26) con algunas modificaciones. Para la recombinación homóloga inducible por calor en SW102 Escherichia coli (E. coli), que contiene el genoma BAC-BoHV-4-A-TK-KanaGalK-TK dirigido al locus TK con casete selector KanaGalK, se utilizó el casete de expresión pTK-CMV-PPRV-H-TK linealizado PvuI. Después de la recombinación, solo las colonias que eran kanamicina negativa y cloranfenicol positivo se mantuvieron y cultivaron durante la noche en 5 ml de LB que contenían 12.5 mg / ml de cloranfenicol. El ADN-BAC se purificó y analizó a través de la digestión de la enzima de restricción HindIII. El ADN se separó por electroforesis en un gel de agarosa al 1%, se tiñó con bromuro de etidio y se visualizó a través de luz UV. Los protocolos detallados originales para la recombinación también se pueden encontrar en el sitio web de recombinación (https://redrecombineering.ncifcrf.gov/).
Southern Blotting
Para confirmar aún más nuestros resultados, se realizó un Southern Blotting con una sonda que abarca la secuencia H. El ADN del gel de agarosa al 1% se transfirió capilarmente a una membrana de nylon cargada positivamente (ROCHE) y se entrecruzó por irradiación UV mediante procedimientos estándar (14). La membrana se hibridó previamente en 50 ml de solución de hibridación (7% SDS, 0,5 M fosfato, pH 7,2) durante 1 h a 65°C en un horno de hibridación giratorio (Techna Instruments).
La sonda H marcada con digoxigenina se generó mediante PCR con cebadores NheI-PPRV-H sense (5′- ccccgctagcccaccatgtccgcacaaagggaaagg -3′) y Phos-PPRV-H antisentido (5′- agactggattacatgttacctc -3′), como se describió anteriormente (15). La reacción de amplificación por PCR se llevó a cabo en un volumen final de 50 μl, conteniendo 10 mmol de Tris-clorhidrato de pH 8.3, 5% de dimetilsulfóxido (DMSO), 0.2 mmol de trifosfatos de desoxinucleótidos, 2.5 mM MgSO4, 50 mM KCl y 0,25 μM de cada cebador. Cien nanogramos de ADN se amplificaron durante 35 ciclos, cada ciclo consistió en 1 minuto de desnaturalización a 94 ° C, 1 minuto de recocido de cebador a 60 ° C y 2 minutos de alargamiento de la cadena con 1U de ADN polimerasa Taq (Fermentas) además de 1 μl de digoxigenina-11-dUTP, álcali-lábil (Roche Life Science) a 72 ° C.
Electroporación de cultivo celular y reconstitución de virus recombinantes
Las células BEK o BEK cre se mantuvieron como una monocapa con medio de crecimiento DMEM completo con 10% de FBS, 2 mM de l-glutamina, 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Cuando las células eran subconfluentes (70-90%) se dividieron en un matraz de cultivo fresco (es decir, cada 3-5 días) y se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire, 5% de CO2. BAC-DNA (5 μg) se electroporó en 600 μl DMEM sin suero (Equibio Apparatus, 270 V, 960 mF, cuvetas de 4 mm gap) en células BEK y BEK cre de un confluente de 25 cm2 matraz. Las células electroporadas se devolvieron al matraz, después de 24 h el medio se reemplazó con medio fresco, y las células se dividieron 1:2 cuando alcanzaron la confluencia a los 2 días posteriores a la electroporación. Las células se dejaron crecer hasta la aparición del efecto citopático (CPE).
Virus y replicación viral
BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK y BoHV-4-A se propagaron infectando monocapas confluentes de células BEK a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5 dosis infecciosas de cultivo tisular 50 (TCID50) por célula y se mantuvieron en medio con solo 2% de FBS durante 2 h. El medio se eliminó y se reemplazó con EMEM fresco que contenía un 10% de FBS. Cuando CPE afectó a la mayoría de la monocapa celular (~ 72 h después de la infección), el virus se preparó congelando y descongelando las células tres veces y peletizando los viriones a través de un cojín de sacarosa al 30%, como se describió anteriormente (27). Los gránulos de virus se resuspendieron en EMEM frío sin FBS. TCID50 se determinó en células BEK limitando la dilución.
Curvas de crecimiento viral
Las células BEK se infectaron con BoHV-4-A y BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK a un M.O.I. de 0,1 TCID50/célula y se incubaron a 37°C durante 4 h. Las células infectadas se lavaron con EMEM sin suero y luego se superpusieron con EMEM que contenía 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 2.5 mg / ml de anfotericina B. Los sobrenadantes de los cultivos infectados se cosecharon después de 24, 48, 72 y 96 h, y la cantidad de virus infeccioso se determinó limitando la dilución en las células BEK. Las diferencias de títulos virales entre cada punto de tiempo son los promedios de las mediciones triplicadas ± los errores estándar de la media (p > 0,05 para todos los puntos de tiempo medidos por la prueba t de Student).
Animales e inmunizaciones
Los ratones hembra C57BL/6 (Harlan) de siete a ocho semanas de edad fueron inoculados y potenciados después de 21 días intraperitoneal (ip) con PBS (grupo 1; n = 10), con 106 TCID50/ml de BoHV-4-A (grupo 2; n = 10) o con 106 TCID50/ml de BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK (grupo 3; n = 10). Los animales fueron sangrados a los 14, 28 y 36 días después de la primera inmunización. Cinco animales por grupo fueron sacrificados en el día 7 después del impulso para realizar experimentos de respuesta de células T. Todos los experimentos con animales se realizaron en una instalación de aislamiento seguro para enfermedades (BSL3) en el CISA (INIA) en estricta conformidad con las recomendaciones del Código de Métodos y Consideraciones de Bienestar en la Investigación del Comportamiento con Animales (Directiva 867609EC; RD1201/2005).
Citometría de flujo Ensayos de tinción de citoquinas intracelulares
Los esplenocitos de ratones inoculados se prepararon como se describió anteriormente (24). Para las respuestas a la PPRV, los esplenocitos se cultivaron durante la noche con PPRV inactivada por BEI (Nig’75) (28). Para evaluar las respuestas a los epítopos murinos de células T PPRV-H H5 (H(551-559) YFYPVRLNF) y H9 (H(427-441) ITSVFGPLIPHLSGM) (29), los esplenocitos se expandieron in vitro durante 1 semana con péptido de 10 μg/ml antes de medir las respuestas de IFN-γ. Para las mediciones intracelulares de IFN-γ, las células se cultivaron a 106 células por pocillo en presencia de diferentes estímulos (péptido o PPRV) durante la noche antes de la adición de 10 μg/ml de brefeldina-A (Sigma) durante las últimas 5 h de incubación. La estimulación del acetato de miristil de forbol (20 ng / ml) y la ionomicina (1 μg / ml) (ambas de sigma) se utilizaron como control positivo para la producción de IFN-γ. Se utilizaron como control negativo los péptidos estimulados por vehículos (DMSO) (sin péptidos) o irrelevantes (péptido gp33-41 [KAVYNFATC] del virus de la coriomeningitis linfocítica). No se detectaron diferencias en la producción de IFN-γ de fondo entre estos grupos de control negativo. Después de la estimulación, las células se tiñeron con anticuerpos anti-ratón CD4-FITC y anti-ratón CD8-PerCP (BDpharmingen). Las células se fijaron y permeabilizaron en PBS que contenía 4% de paraformaldehído y 0,1% de saponina (peso / vol). Luego, las células se tiñeron con IFN-γ-PE anti-ratón (BD pharmingen) y se adquirieron utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson). La estrategia de gating se describe en Ref. (29). La activación para eventos positivos positivos de IFN-γ se estableció utilizando isotipo y fluorescencia menos controles de un canal. Los datos fueron analizados con el software FlowJo (TreeStar Inc.).
Ensayos de citotoxicidad por citometría de flujo
Los esplenocitos de ratones inmunizados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK se expandieron con péptido H5 durante 1 semana in vitro. Estos esplenocitos estimulados se utilizaron como células efectoras. Las células diana RMA/s se marcaron con el enlazador fluorescente verde PKH67 como se describe en la Ref. (30) y se pulsaron con el péptido relevante. Se utilizaron células RMA/s pulsadas por vehículos (sin péptidos) como control negativo. Las células efectoras y las células diana se incubaron durante 4 horas a 37 °C en 96 placas de pocillos con fondo en U. Las células se transfirieron a tubos FACS, las células muertas marcadas con yoduro de propidio (PI) (2 μg / ml) y las muestras se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. Las células diana estaban cerradas en células FL1+ brillantes. En todos los experimentos se utilizaron controles positivos de muerte celular máxima (células diana en PBS + saponina al 0,2%) y controles de muerte celular espontánea. El porcentaje de lisis de células diana específicas se calculó siguiendo la fórmula: % de lisis específica = 100 × (% PI+ objetivo – % de muerte espontánea)/(% de muerte máxima − % de muerte espontánea).
Ensayos de neutralización de PPRV
Las muestras de suero se inactivaron durante 30 min a 56 °C y se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes como se describió anteriormente (31). Brevemente, el stock de Nigeria 75/1 PPRV se incubó con diluciones seriadas de suero de oveja inactivado durante 1 hora en RT por triplicado. Células VDS a una concentración de 1,5 × 105 Se agregaron células/ml a cada pocillo y se incubaron durante 7 días, se fijaron con formaldehído al 2% y se visualizaron células mediante tinción de violeta cristalina. Los pozos sin virus sirvieron como controles. Las placas fueron monitoreadas para PPRV CPE durante 7 días. El título VNT se definió como la mayor dilución de suero que inhibió el 50% del CPE. Los sueros con títulos de VNT de 1:10 se consideraron negativos.
Análisis estadístico
Se utilizó el análisis de potencia (32) para determinar el tamaño del grupo de tratamiento para evaluar las respuestas de las células T y la seroneutralización del VPESTE de rupias. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., USA). La prueba de Mann-Whitney se utilizó para comparar la producción de IFN-γ en células T CD4 + y CD8 +. Los niveles de significancia fueron *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001.
Resultados
Generación de BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK
Basado en la suposición de que el antígeno PPRV-H podría inducir una respuesta inmune protectora, un BoHV-4, BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK recombinante, que proporciona un CMV-PPRV-HgD optimizado.106 El casete de expresión (Figura 1 A), se generó mediante recombinación homóloga inducible por calor en la cepa SW102 E. Coli que contenía pBAC-BoHV-4-A-KanaGalK-ΔTK (14) (Figura 1B). La autenticidad del genoma viral recombinante pBAC-BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK obtenida se evaluó primero mediante el análisis de la enzima de restricción HindIII y luego se confirmó mediante Southern Blotting utilizando una sonda específica PPRV-H. La estabilidad clonal se determinó mediante el crecimiento del clon positivo a lo largo de 20 pasajes. A continuación, se obtuvieron partículas virales infecciosas BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK recombinantes electroporando células BEK o BEKcre. Estas últimas células permitieron el agotamiento del casete BAC/GFP del genoma viral recombinante, como lo demuestra la pérdida de placas verdes (Figura 1C). Además, BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK no mostró defectos de replicación en comparación con la cepa parental BoHV-4-A (Figura 1 D) y la proteína PPRV-H expresada (Figura 1E).
FIGURA 1. Diagrama (no a escala); (A) resumen de la recombinación homóloga inducible por calor en SW102 que contiene pBAC-BoHV-4-A-TK-KanaGalK-TK, donde el casete Kana/GalK fue reemplazado por el CMV-PPRV-HgD106 casete de expresión flanqueado por secuencias TK del herpesvirus bovino 4 (BoHV-4), localizadas en el vector plásmido lanzadera pINT2. (B) colonias representativas resistentes a la 2-desoxi-galactosa probadas mediante análisis de enzimas de restricción HindIII, electroforesis en gel de agar y Southern blotting realizadas con sondas específicas para los ORF de hemaglutinina del virus de la peste de pequeños rumiantes (PPRV-H). La banda de 2.650 pb, correspondiente al control pBAC-BoHV-4-A-TK-KanaGalK-TK no redirigido, ha sido reemplazada por una banda de 3240 pb en pBAC-BoHV-4-A-CMV-PPRV-H-ΔTK. (C) Imágenes microscópicas representativas de contraste de fase de placa formada por BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK recombinante reconstituidas viables después de la electroporación del ADN del cromosoma artificial bacteriano (BAC) correspondiente en células de riñón de embrión bovino (BEK) que expresan cre recombinasa (Magnificación, ×10). (D) Cinética de replicación del crecimiento de BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK en células BEK y comparado con el aislado parental de BoHV-4-A. Los datos presentados son la media ± los errores estándar de las mediciones por triplicado (p > 0,05 para todos los puntos temporales medidos por la prueba t de Student). (E) Western immunoblotting de células, infectadas con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK o el BoHV-4-A parental utilizado como control negativo. Los carriles estaban cargados con diferentes cantidades de extracto celular de proteína total (5, 10 y 20 μg).
La inmunización contra BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK INDUCE LA RESPUESTA DE LAS CÉLULAS T CONTRA EL PESTE DE PEQUEÑOS RUMIANTES
Los esplenocitos de ratones C57BL / 6 se extrajeron 7 días después de la inmunización de refuerzo y la producción de IFN-γ por células T a la cepa PPRV Nig’75 inactivada se midió por citometría de flujo (Figura 2). Las células T CD4+ de ratones inmunizados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK produjeron IFN-γ en respuesta a la estimulación inactivada de PPRV (Figuras 2A, B). No se detectó una producción específica de IFN-γ para PPRV en células T CD4 + de ratones inmunizados con PBS o BoHV-4-A. Del mismo modo, las células T CD8 + de ratones inmunizados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK produjeron IFN-γ en presencia de PPRV, mientras que las células T CD8 + de animales inmunizados con PBS o BoHV-4-A no lo hicieron. Estos datos indican que la inmunización BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK puede provocar respuestas de células T CD4+ y CD8+ a la infección por PPRV.
FIGURA 2. Inducción de las respuestas de células T CD4+ y CD8+ al virus de la peste de pequeños rumiantes (PPRV) mediante la vacuna recombinante BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK Los esplenocitos de ratones C57BL / 6 vacunados se extrajeron 7 días después de la vacunación de refuerzo y se estimularon con la cepa inactivada de PPRV Nig’75 (BEI-PPRV Nig’75) durante la noche. La producción de IFN-γ en linfocitos T CD4+ y CD8+ se evaluó mediante citometría de flujo mediante tinción intracelular. (A) Se muestran diagramas de puntos representativos para la producción de IFN-γ por células T CD4 + en ratones vacunados con PBS, herpesvirus bovino 4 [BoHV-4 (BoHV)] o BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK (BoHV-PPRV-H). (B) Se muestra el porcentaje promedio de ± SD de células T CD4 + productoras de IFN γ por encima del control en 5 ratones por grupo a los 7 días posteriores a la vacunación de refuerzo. Prueba de Mann-Whitney (BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK vs BoHV-4-A o PBS); *p < 0,05; **p < 0,01. (C) Se muestran diagramas de puntos representativos para la producción de IFN-γ por células T CD8 + en ratones vacunados con PBS, BoHV-4-A o BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK. (D) Se muestra el porcentaje promedio de ± SD de células T CD8 + productoras de IFN-γ por encima de la liberación espontánea de IFN- γ (control) en 5 ratones por grupo a los 7 días posteriores a la vacunación de refuerzo. Prueba de Mann-Whitney (BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK vs BoHV-4-A o PBS); *p < 0,05; **p < 0,01.
La inmunización BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK induce respuestas a los epítopos de células T PPRV-H
Varios epítopos murinos de células T de PPRV-H en el H-2b contexto previamente definido (29). En el presente trabajo, se utilizaron péptidos H5 y H9 de la proteína PPRV-H para caracterizar aún más la respuesta de las células T contra la PPRV después de la inmunización con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK. Los esplenocitos de ratones inmunizados fueron estimulados 1 semana in vitro con péptidos H5 y H9 y la producción de IFN-γ se evaluó mediante citometría de flujo mediante tinción intracelular (Figura 3). El péptido H5 indujo la producción específica de IFN-γ en células T CD8+ pero no en células T CD4+ de ratones inmunizados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK (Figuras 3A, B). No se detectó una producción específica de IFN-γ estimulada por péptidos H5 en esplenocitos de ratones inmunizados con PBS o BoHV-4-A. El péptido H9 indujo la producción específica de IFN-γ tanto en células T CD4+ como CD8+ de ratones inmunizados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK (Figuras 3C, D). No se detectó secreción de IFN-γ estimulada por péptidos H9 en grupos PBS o BoHV-4-A. Por lo tanto, la inmunización BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK provocó respuestas de células T CD4 + y CD8 + contra los epítopos PPRV-H.
FIGURA 3. La inmunización BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK induce respuestas de células T CD4+ y CD8+ específicas para los epítopos de la hemaglutinina del virus de la peste de pequeños rumiantes (PPRV-H) Los esplenocitos de ratones C57BL / 6 inmunizados con PBS, BoHV-4-A (BoHV) o BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK (BoHV-PPRV-H) se estimularon in vitro con péptidos H5 o H9 de PPRV-H durante 1 semana. La producción de IFN-γ en linfocitos T CD4+ y CD8+ se midió mediante citometría de flujo mediante tinción intracelular. Se muestran diagramas de puntos representativos para la producción de IFN-γ al péptido H5 en (A) CD4 + y (B) células T CD8 + en ratones inmunizados. Producción promedio de IFN-γ específica de ± SD al péptido H5 en grupos de ratones inmunizados (n = 5 para PBS y BoHV-4-A; n = 7 para BoHV-4-A-PPRV-H-Δ TK). Prueba de Mann-Whitney [BoHV-4-A-PPRV-H-Δ TK (BoHV-4-A-PPRV-H) vs PBS o BOHV-4-A(BoHV)]; *p < 0,05; **p < 0,01. Se muestran diagramas de puntos representativos para la producción de IFN-γ al péptido H9 en células T (C) CD4 + y (D) CD8 + en ratones inmunizados. Promedio ± producción específica de IFN-γ SD al péptido H9 en grupos de ratones inmunizados (n = 5 para PBS y BoHV-4-A; n = 7 para BoHV-4-A-PPRV-H-Δ TK). Prueba de Mann-Whitney (BoHV-4-A-PPRV-H-Δ TK vs PBS o BOHV-4-A); **p < 0,01.
La inmunización BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK estimula los linfocitos T citotóxicos (CTL) anti-PPRV
Los esplenocitos de ratones inmunizados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK fueron estimulados con péptidos H5 durante 1 semana in vitro y utilizados como células efectoras en ensayos de citotoxicidad basados en citometría de flujo. Las células RMA-s se utilizaron como células diana en estos experimentos. Los esplenocitos de ratones inmunizados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK fueron capaces de lisar específicamente las células RMA-s pulsadas con péptido H5 (Figuras 4A, B). Estos datos indican que la inmunización BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK puede promover respuestas CTL contra la infección por PPRV.
FIGURA 4. La vacunación BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK induce linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos para los epítopos de la hemaglutinina del virus de la peste de los pequeños rumiantes (PPRV-H) Los esplenocitos de ratones BoHV-4-A-PPRV-H-Δ TK (BoHV-4-A-PPRV-H) inmunizados con C57BL / 6 fueron estimulados con péptido H5 de PPRV durante 1 semana in vitro y utilizados como células efectoras en ensayos de citotoxicidad basados en citometría de flujo. Se utilizaron células RMA-s como células diana. La membrana celular RMA-s se marcó fluorescentemente con marcador PKH67, y las células pulsaron con péptido o se dejaron sin pulsar como control. Después de la incubación con células efectoras, la lisis de células diana se evaluó mediante tinción de yoduro de propidio (PI). (A) La muerte de la célula diana se cerró en el evento brillante PKH67 + y PI + como se muestra. (B) Se muestra citotoxicidad específica representativa de células diana pulsadas con péptido H5 cuando se cultivan con esplenocitos estimulados por H5.
La inmunización contra BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK induce una respuesta específica de anticuerpos neutralizantes contra PPRV-H
Para determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes, se analizaron sueros de ratones vacunados obtenidos a los 28 días posteriores a la primera inmunización (7 días después de la inoculación de refuerzo) en una prueba de neutralización del virus. Todos los animales vacunados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK mostraron anticuerpos neutralizantes específicos del VPPESTE con títulos de neutralización entre 160 y 320 (Tabla 1).
TABLA 1. Análisis in vitro de la neutralización de la infectividad de la cepa Nigeria 75/1 peste des petits rumiants virus (PPRV).
No se detectó actividad de neutralización en sueros preinmunes o sueros de ratones inyectados con PBS o BoHV-4-A. Estos resultados muestran que la inoculación in vivo de BoHV-4-A recombinante que expresa la proteína PPRV-H es capaz de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes de PPRV, lo que sugiere que este enfoque tiene el potencial de conferir inmunidad protectora a los animales vacunados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK.
Discusión
En los países en desarrollo, la mayor parte de la población se dedica a la agricultura a pequeña escala, el 80% de estos hogares mantienen ganado constituido principalmente por pequeños rumiantes, principalmente ovejas y cabras. Su productividad está limitada por múltiples factores, incluidas las enfermedades infecciosas, donde la PPR representa una de las más importantes. La vacunación puede reducir la mortalidad animal, aumentar la producción de leche y carne, y tener un impacto positivo en los ingresos de los hogares. Como resultado, la vacunación también contribuye al alivio de la pobreza al aumentar los beneficios familiares y liberar ingresos para alimentos, atención médica o educación infantil. Por lo tanto, las nuevas vacunas eficaces dirigidas a las enfermedades que obstaculizan la agricultura en los países en desarrollo tendrán un gran beneficio social y económico (33).
Para la campaña de erradicación del VPSR, una vacuna DIVA sería de gran valor para facilitar los programas de serovigilancia del VPRP y acelerar las estrategias para el control y la erradicación de la enfermedad (34). El inconveniente más importante cuando se utiliza una vacuna viva atenuada clásica es la incapacidad de distinguir la respuesta inmune estimulada por la vacunación de la inducida por una infección natural. Por lo tanto, una vacuna DIVA sería una solución inteligente que combina la vacunación con la serovigilancia. La vacuna DIVA se puede aplicar no solo con vacunas marcadoras eliminadas genéticamente (35), sino también con vacunas de subunidades (36), vacunas heterólogas (37) y vacunas recombinantes basadas en vectores. Con respecto al último caso y como vector viral alternativo, en el presente trabajo se empleó una plataforma de vectores basada en BoHV-4 para administrar y expresar el gen PPRV-H en células transducidas de ratones inmunocompetentes como modelo animal sustituto. Aunque no existe un modelo murino para la enfermedad inducida por el VPPESTE de pequeños rumiantes, representan un modelo invaluable para probar inicialmente la inmunidad inducida por nuevas vacunas prototipo. El uso directo de animales grandes podría representar un gran desperdicio de recursos, en términos de mantenimiento y estructuras de contención de bioseguridad, especialmente en caso de fracaso del experimento. Los datos proporcionados por ratones inmunizados no solo se pueden obtener de forma rápida y económica, sino que también podrían representar una herramienta predictiva y orientativa de la inmunogenicidad de la vacuna en el huésped natural, por ejemplo, cabras y ovejas en el caso específico de PPRV (4, 25). La proteína PPRV-H posee actividades de hemaglutinina y neuraminidasa y tiene un dominio hidrofóbico en el extremo N (posición de aminoácido 35-38), que permanece dentro de la proteína madura que actúa como un péptido señal que ancla la proteína en la membrana (38). La presencia de 34 aminoácidos N-terminal localizados en el interior de la membrana caracteriza a la PPRV-H como una glicoproteína de tipo II (38). Dado que se ha demostrado que la proteína PPRV-H es un buen antígeno candidato (3, 4), se construyó un BoHV-4 recombinante que administra un casete de expresión de PPRV-H optimizado para probar la inmunogenicidad de este vector basado en BoHV-4 y explotarlo como una plataforma de vacuna DIVA para la vacunación PPR. BoHV-4 no tiene una asociación directa clara de la enfermedad; Sin embargo, su potencial patógeno no puede excluirse absolutamente. Esta es una consideración importante ya que debe usarse como vector de entrega de genes. De hecho, BoHV-4 se ha asociado a menudo con metritis posparto en bovinos junto con endometotrópicas específicas (39, 40). La secreción de prostaglandina E2 (PGE2) y luego la estimulación de la replicación viral por PGE2, TNF-α y lipopolisacárido (LPS) se sugirieron como un modelo patogénico para BoHV-4 y la coinfección bacteriana en vacas endometríticas (41-43). Por lo tanto, se empleó un supuesto biotipo no patógeno de BoHV-4 (BoHV-4-A) aislado de la fracción de células lácteas de una vaca sana cuyo genoma se clonó como un cromosoma artificial bacteriano (pBAC-BoHV-4-A) (14). Es importante destacar que el vector basado en BoHV-4-A se comporta como un vector viral incompetente replicante tanto en ratones de tipo salvaje como en ratones inmunocomprometidos, mostrando una ausencia completa de patogenicidad (16, 17, 19, 27, 44, 45). PPRV-H ORF se personalizó bajo el control transcripcional del promotor CMV y se integró en BoHV-4-A genoma TK locus. El vector recombinante derivado deficiente en replicación podría transducir células de mamíferos y expresar la proteína PPRV-H. Por lo tanto, esta construcción podría potencialmente provocar inmunidad al transgén. La estabilidad genética de los vectores virales sigue siendo una cuestión muy importante, ya que los vectores virales recombinantes constituyen «organismos modificados genéticamente» (OMG). En nuestro caso, la construcción BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK fue estable a través de varios pasajes. Sin embargo, se necesitará una planificación pertinente antes de que este vector recombinante pueda obtener legalmente una licencia para el empleo en el campo.
La inmunidad natural protectora a los morbilivirus requiere componentes humorales y celulares del sistema inmune adaptativo. La inmunidad humoral puede proteger contra el prototipo de reinfección por el virus del sarampión morbillivirus, mientras que la inmunidad celular controla la eliminación y diseminación del virus (46, 47). En el presente trabajo, los ratones inmunizados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK produjeron respuestas de células T CD4 + y CD8 + contra epítopos PPRV-H y promovieron respuestas CTL contra PPRV. Por lo tanto, esta vacuna de vector recombinante puede estimular potencialmente la inmunidad de las células T esencial para la eliminación del virus. Será interesante en trabajos futuros determinar si, de manera similar a las vacunas de adenovirus recombinantes (29), la inmunización BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK puede desencadenar respuestas de células T de memoria en huéspedes naturales de PPRV.
Sin embargo, los resultados más sorprendentes se relacionaron con la producción de anticuerpos neutralizantes del virus (VNA) contra el VPP. Anteriormente se demostró que un título de neutralización superior a 10 se correlaciona con una respuesta humoral duradera y podría considerarse como un indicador exitoso de vacunación y protección en el campo (48, 49). En este estudio piloto, el título de VNA más bajo obtenido para todos los ratones vacunados nunca fue inferior a 120. Por lo tanto, se podría especular que los animales vacunados con BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK podrían protegerse del desafío virulento de la PPRV cuando este protocolo se aplique en el huésped natural. Esto se ve respaldado por el hecho de que BoHV-4 se ha utilizado con éxito en ovejas y cabras (13, 18). El vector basado en BoHV-4 que administra H solo también indujo títulos de neutralización más altos que los obtenidos con otros vectores virales que administran antígenos H y F, lo que está en línea con el concepto de que la glicoproteína H del Paramixovirus es un inductor más fuerte de VNA que la glicoproteína F (50, 51). A pesar de la noción de que la respuesta inmune de anticuerpos contra PPRV es el factor principal para una protección eficiente, la respuesta inmune celular también puede ser importante para la eliminación del virus. En algunos casos, la protección se ha obtenido incluso con un nivel indetectable de títulos de VNA (52, 53). Los altos niveles de títulos de VNA y la inducción de inmunidad celular después de la inmunización contra BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK indican que esta vacuna de vector recombinante tiene el potencial de proteger contra el desafío viral virulento. La inducción de inmunidad humoral y celular después de la inoculación de BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK indica que esta vacuna puede desencadenar la inmunidad contra el VPPESTE en el huésped natural tanto en un entorno experimental como en el campo.
En conclusión, en el presente trabajo, se demostró que BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK es capaz de inducir una fuerte respuesta inmune específica contra PPRV. Estos hallazgos están allanando el camino para el uso de BoHV-4-A-PPRV-H-ΔTK como un vector viral seguro, grande, potente, no integrador y replicante competente para la vacunación y erradicación de la PPR.
Disponibilidad de datos y material
Disponible bajo petición.
Declaración ética
Los experimentos se realizaron en un centro de aislamiento seguro para enfermedades (BSL3) en el Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), en estricta conformidad con las recomendaciones del Código de Métodos y Consideraciones de Bienestar en la Investigación del Comportamiento con Animales (Directiva 86/609EC; RD1201/2005). Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Experimentación con Animales (CEEA) del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) y la Comisión de ética estatal de bienestar animal.
Contribuciones del autor
GD concibió los experimentos. VF, JR, AV, GT, NS, FM, VM, CP y GD realizaron los experimentos. GD, LL, SC, JR, VM y SO analizaron los datos. GD escribió el artículo.
Declaración de conflicto de intereses
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Financiación
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio italiano de Universidad e Investigación Científica (Beca Nacional Italiana MIUR, PRIN 2010-2011). Este trabajo ha sido financiado por las becas AGL2015-64290R y ADENONET-Redes de Excelencia (BIO2015-68990-REDT) del Ministerio de Economía Competitividad y la subvención S2013/ABI-2906-PLATESA de la Comunidad de Madrid.
Abreviaturas
BoHV-4: herpesvirus bovino 4; BAC: cromosoma artificial bacteriano; BEK: riñón de embrión bovino; HEK293T, riñón embrionario humano 293 T; VDS, vero dog-SLAM; FBS: suero fetal bovino; EMEM, el medio esencial mínimo del águila; DMEM, el medio esencial modificado de dulbecco; DMSO: sulfóxido de dimetilo; MOI: multiplicidad de la infección; TCID50, dosis infecciosas de cultivo de tejidos 50; EDTA: etilendinitrilo-tetraacético; PEI: polietilenimina; CPE: efecto citopático; MFI: intensidad media de fluorescencia; PPR, peste de pequeños rumiantes; PPRV, virus de la peste de los pequeños rumiantes; PPRV-H, peste des petits rumiants virus hemaglutinina; H: hemaglutinina; DIVA, diferenciando animales infectados de vacunados; OIE, oficina internacional de epizootias.
Referencias
1. Baron MD, Diallo A, Lancelot R, Libeau G. Peste des petits rumiants virus. Adv Virus Res (2016) 95: 1-42. doi:10.1016/bs.aivir.2016.02.001
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
2. Qin J, Huang H, Ruan Y, Hou X, Yang S, Wang C, et al. Una nueva vacuna recombinante contra el adenovirus canino de la peste de pequeños rumiantes provoca una respuesta de anticuerpos neutralizantes de larga duración contra la peste de pequeños rumiantes en cabras. PLoS One (2012) 7:e37170. doi:10.1371/journal.pone.0037170
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
3. Herbert R, Baron J, Batten C, Baron M, Taylor G. Adenovirus recombinante que expresa la hemaglutinina del virus de la peste de pequeños rumiantes (PPRV) protege a las cabras contra el desafío con virus patógenos; una vacuna DIVA para la peste de pequeños rumiantes. Vet Res (2014) 45:24. doi:10.1186/1297-9716-45-24
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
4. Rojas JM, Moreno H, Valcarcel F, Pena L, Sevilla N, Martin V. La vacunación con adenovirus recombinantes que expresan las proteínas F o H del virus de la peste de pequeños rumiantes supera la inmunosupresión viral e induce inmunidad protectora contra el desafío del VPPESTE de pequeños rumiantes en ovinos. PLoS One (2014) 9:e101226. doi:10.1371/journal.pone.0101226
5. Hosamani M, Singh SK, Mondal B, Sen A, Bhanuprakash V, Bandyopadhyay SK, et al. Una vacuna bivalente contra la viruela caprina y los rumiantes de la Peste des Petits induce una respuesta inmune protectora en cabras. Vaccine (2006) 24:6058–64. doi:10.1016/j.vaccine.2006.05.021
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
6. Chen W, Hu S, Qu L, Hu Q, Zhang Q, Zhi H, et al. Una vacuna peste-des-petits-rumiants vectorizada por el virus de la viruela de cabra induce anticuerpos de neutralización de larga duración a altos niveles en cabras y ovejas. Vaccine (2010) 28:4742–50. doi:10.1016/j.vaccine.2010.04.102
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
7. Dewals B, Thirion M, Markine-Goriaynoff N, Gillet L, De Fays K, Minner F, et al. Evolución del herpesvirus bovino 4: recombinación y transmisión entre búfalo africano y bovino. J Gen Virol (2006) 87:1509–19. doi:10.1099/vir.0.81757-0
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
8. Moreno-Lopez J, Goltz M, Rehbinder C, Valsala KV, Ludwig H. Un herpesvirus bovino (BHV-4) como virus pasajero en tumores etmoidales en ganado indio. Zentralbl Veterinarmed B (1989) 36:481–6.
9. Egyed L, Kluge JP, Bartha A. Estudios histológicos de la infección por herpesvirus bovino tipo 4 en especies no rumiantes. Vet Microbiol (1997) 57:283–9. doi:10.1016/S0378-1135(97)00105-3
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
10. Fabricant CG, King JM, Gaskin JM, Gillespie JH. Aislamiento de un virus de una gata con urolitiasis. J Am Vet Med Assoc (1971) 158:200–1.
11. Bublot M, Dubuisson J, Van Bressem MF, Danyi S, Pastoret PP, Thiry E. Antigenic and genomic identity between simian herpesvirus aotus type 2 and bovine herpesvirus type 4. J Gen Virol (1991) 72(Pt 3):715–9. doi:10.1099/0022-1317-72-3-715
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
12. Donofrio G, Cavirani S, Simone T, Van Santen VL. Potencial del herpesvirus bovino 4 como vector de entrega génica. J Virol Methods (2002) 101:49–61. doi:10.1016/S0166-0934(01)00419-0
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
13. Donofrio G, Sartori C, Ravanetti L, Cavirani S, Gillet L, Vanderplasschen A, et al. Establecimiento de un vector basado en el herpesvirus bovino 4 que expresa una forma secretada de la glicoproteína estructural E2 del virus de la diarrea viral bovina con fines de inmunización. BMC Biotechnol (2007) 7:68. doi:10.1186/1472-6750-7-68
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
14. Donofrio G, Sartori C, Franceschi V, Capocefalo A, Cavirani S, Taddei S, et al. Estrategia de doble inmunización con un péptido quimérico secretado por BoHV-4-vectorializado BVDV-E2/BoHV-1-gD. Vaccine (2008) 26:6031–42. doi:10.1016/j.vaccine.2008.09.023
15. Donofrio G, Franceschi V, Capocefalo A, Taddei S, Sartori C, Bonomini S, et al. La focalización celular de antígenos heterólogos diseñados es un factor determinante para el desarrollo de vectores de vacunas basados en el herpesvirus bovino 4. Clin Vaccine Immunol (2009) 16:1675–86. doi:10.1128/CVI.00224-09
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
16. Franceschi V, Capocefalo A, Calvo-Pinilla E, Redaelli M, Mucignat-Caretta C, Mertens P, et al. Inmunización de ratones receptores de interferón alfa/beta knock-out contra la infección letal de lengua azul con un vector basado en BoHV-4 que expresa el antígeno BTV-8 VP2. Vacuna (2011) 29:3074–82. doi:10.1016/j.vaccine.2011.01.075
17. Redaelli M, Franceschi V, Capocefalo A, D’avella D, Denaro L, Cavirani S, et al. El vector basado en el virus del herpes simple tipo 1 basado en el virus de la timidina quinasa con herpesvirus bovino tipo 4 muestra propiedades oncolíticas mejoradas en modelos de glioma singénico ortotópico inmunocompetente de ratón y rata. Neuro Oncol (2012) 14:288–301. doi:10.1093/neuonc/nor219
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
18. Donofrio G, Franceschi V, Lovero A, Capocefalo A, Camero M, Losurdo M, et al. Protección clínica de cabras contra la enfermedad genital inducida por CpHV-1 con un vector basado en BoHV-4 que expresa CpHV-1 gD. PLoS One (2013) 8:e52758. doi:10.1371/journal.pone.0052758
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
19. Franceschi V, Parker S, Jacca S, Crump RW, Doronin K, Hembrador E, et al. La administración de antígeno heterólogo único vectorial basado en BoHV-4 protege a los ratones STAT1 (-/-) del desafío letal del virus de la viruela del simio. PLoS Negl Trop Dis (2015) 9:e0003850. doi:10.1371/journal.pntd.0003850
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
20. Jacca S, Rolih V, Quaglino E, Franceschi V, Tebaldi G, Bolli E, et al. El vector basado en herpesvirus bovino 4 que administra un oncoantígeno híbrido HER-2 rata/humano protege eficazmente a los ratones del cáncer mamario autóctono Her-2+. Oncoinmunología (2016) 5:e1082705. doi:10.1080/2162402X.2015.1082705
21. Donofrio G, Martignani E, Poli E, Lange C, Martini FM, Cavirani S, et al. Interacción vectorial basada en herpesvirus bovino 4 con células hepáticas in vitro e in vivo. J Virol Methods (2006) 136:126–36. doi:10.1016/j.jviromet.2006.04.008
22. Donofrio G, Taddei S, Franceschi V, Capocefalo A, Cavirani S, Martinelli N, et al. Las células estromales adiposas porcinas cargadas con viriones 4 del herpesvirus bovino recombinante que expresan un antígeno extraño inducen potentes respuestas inmunes humorales en cerdos. Vaccine (2011) 29:867–72. doi:10.1016/j.vaccine.2010.11.048
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
23. Seki F, Ono N, Yamaguchi R, Yanagi Y. Aislamiento eficiente de cepas salvajes del virus del moquillo canino en células Vero que expresan SLAM canino (CD150) y su adaptabilidad a células tití B95a. J Virol (2003) 77:9943–50. doi:10.1128/JVI.77.18.9943-9950.2003
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
24. Rojas JM, Rodriguez-Calvo T, Pena L, Sevilla N. Las respuestas de las células T al virus de la lengua azul se dirigen contra epítopos de células T CD4+ y CD8+ múltiples e idénticos de la proteína central VP7 en ratones y ovejas. Vaccine (2011) 29:6848–57. doi:10.1016/j.vaccine.2011.07.061
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
25. Rojas JM, Moreno H, Garcia A, Ramirez JC, Sevilla N, Martin V. Dos vectores de vacunas adenovirales defectuosas de replicación para la inducción de respuestas inmunitarias al VPP. Vacuna (2014) 32:393–400. doi:10.1016/j.vaccine.2013.11.033
26. Warming S, Costantino N, Court DL, Jenkins NA, Copeland NG. Recombinación de BAC simple y altamente eficiente utilizando la selección galK. Ácidos nucleicos Res (2005) 33:e36. doi:10.1093/nar/gni035
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
27. Donofrio G, Cavaggioni A, Bondi M, Cavirani S, Flammini CF, Mucignat-Caretta C. Outcome of bovine herpesvirus 4 infection following direct viral injection in the lateral ventrile of the mouse brain. Microbes Infect (2006) 8:898–904. doi:10.1016/j.micinf.2005.10.016
28. Rojas JM, Pena L, Martin V, Sevilla N. Los epítopos ovinos y murinos de células T de la proteína no estructural 1 (NS1) del serotipo 8 del virus de la lengua azul (BTV-8) se comparten entre los serotipos virales. Vet Res (2014) 45:30. doi:10.1186/1297-9716-45-30
29. Rojas JM, Avia M, Pascual E, Sevilla N, Martin V. Vaccination with recombinant adenovirus expressing peste des petits rumiants virus-F or -H proteins elicits T cell responses to epitopes that arises during PPRV infection. Vet Res (2017) 48:79. doi:10.1186/s13567-017-0482-x
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
30. Rojas JM, Spada R, Sanz-Ortega L, Morillas L, Mejias R, Mulens-Arias V, et al. La deficiencia de la subunidad reguladora beta de PI3K p85 no afecta la diferenciación de las células NK y aumenta la activación mediada por NKG2D. J Leukoc Biol (2016) 100: 1285-96. doi:10.1189/jlb.1A1215-541RR
31. Barrett T, Belsham GJ, Subbarao SM, Evans SA. La inmunización con un vaccinia recombinante que expresa la proteína F protege a los conejos del desafío con una dosis letal del virus de la peste bovina. Virology (1989) 170:11–8. doi:10.1016/0042-6822(89)90346-2
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
32. Charan J, Kantharia ND. ¿Cómo calcular el tamaño de la muestra en estudios con animales? J Pharmacol Pharmacother (2013) 4:303–6. doi:10.4103/0976-500X.119726
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
33. Marsh TL, Yoder J, Deboch T, Mcelwain TF, Palmer GH. Las vacunaciones del ganado se traducen en un aumento del capital humano y de la asistencia escolar de las niñas. Sci Adv (2016) 2:e1601410. doi:10.1126/sciadv.1601410
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
34. Diallo A, Minet C, Le Goff C, Berhe G, Albina E, Libeau G, et al. La amenaza de la peste de pequeños rumiantes: avances en el desarrollo de vacunas para el control de enfermedades. Vacuna (2007) 25:5591–7. doi:10.1016/j.vaccine.2007.02.013
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
35. Ahrens U, Kaden V, Drexler C, Visser N. Efficacy of the classical swine fever (CSF) marker vaccine porcilis pesti in pregnant sows. Vet Microbiol (2000) 77:83–97. doi:10.1016/S0378-1135(00)00265-0
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
36. De Smit AJ, Bouma A, De Kluijver EP, Terpstra C, Moormann RJ. Duración de la protección de una vacuna de marcador de subunidad E2 contra la peste porcina clásica después de una sola vacunación. Vet Microbiol (2001) 78:307–17. doi:10.1016/S0378-1135(00)00306-0
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
37. Capua I, Terregino C, Cattoli G, Mutinelli F, Rodriguez JF. Desarrollo de una estrategia DIVA (diferenciación de animales infectados de vacunados) utilizando una vacuna que contiene una neuraminidasa heteróloga para el control de la gripe aviar. Avian Pathol (2003) 32:47–55. doi:10.1080/0307945021000070714
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
38. Langedijk JP, Daus FJ, Van Oirschot JT. Sequence and structure alignment of Paramyxoviridae attachment proteins and discovery of enzymatic activity for a morbillivirus hemagglutininin. J Virol (1997) 71:6155–67.
39. Frazier KS, Baldwin CA, Pence M, West J, Bernard J, Liggett A, et al. Seroprevalencia y comparación de aislados de herpesvirus bovino-4 endometriotrópico. J Vet Diagn Invest (2002) 14:457–62. doi:10.1177/104063870201400602
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
40. Monge A, Elvira L, Gonzalez JV, Astiz S, Wellenberg GJ. Metritis posparto asociada al herpesvirus bovino 4 en un hato lechero español. Res Vet Sci (2006) 80:120–5. doi:10.1016/j.rvsc.2005.04.001
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
41. Donofrio G, Ravanetti L, Cavirani S, Herath S, Capocefalo A, Sheldon IM. La infección bacteriana de las células del estroma endometrial influye en el herpesvirus bovino 4 activación temprana inmediata del gen: una nueva visión de la interacción bacteriana y viral para la enfermedad uterina. Reproducción (2008) 136:361–6. doi:10.1530/REP-08-0171
42. Donofrio G, Capocefalo A, Franceschi V, Price S, Cavirani S, Sheldon IM. La quimiocina IL8 está regulada al alza en las células estromales endometriales bovinas por el producto del gen BoHV-4 IE2, ORF50 / Rta: un paso adelante hacia un mecanismo para la endometritis inducida por BoHV-4. Biol Reprod (2010) 83:919–28. doi:10.1095/biolreprod.110.086074
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
43. Jacca S, Franceschi V, Colagiorgi A, Sheldon M, Donofrio G. Las células del estroma endometrial bovino apoyan la replicación mejorada del herpesvirus bovino tipo 4 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa. Biol Reprod (2013) 88:135. doi:10.1095/biolreprod.112.106740
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
44. Franceschi V, Stellari FF, Mangia C, Jacca S, Lavrentiadou S, Cavirani S, et al. Análisis de imágenes in vivo de vectores basados en BoHV-4 en ratones. PLoS One (2014) 9:e95779. doi:10.1371/journal.pone.0095779
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
45. Puppo A, Cesi G, Marrocco E, Piccolo P, Jacca S, Shayakhmetov DM, et al. Perfiles de transducción retiniana por vectores virales de alta capacidad. Gene Ther (2014) 21:855–65. doi:10.1038/gt.2014.57
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
46. Mongkolsapaya J, Jaye A, Callan MF, Magnusen AF, Mcmichael AJ, Whittle HC. Expansión específica del antígeno de los linfocitos T citotóxicos en la infección aguda por el virus del sarampión. J Virol (1999) 73:67–71.
47. De Vries RD, Yuksel S, Osterhaus AD, De Swart RL. Los linfocitos T CD8(+) específicos controlan la diseminación del virus del sarampión. Eur J Immunol (2010) 40:388–95. doi:10.1002/eji.200939949
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
48. Lund BT, Tiwari A, Galbraith S, Baron MD, Morrison WI, Barrett T. La vacunación del ganado vacuno con virus atenuado de la peste bovina estimula las respuestas de células T CD4 (+) con una amplia especificidad de antígeno viral. J Gen Virol (2000) 81:2137–46. doi:10.1099/0022-1317-81-9-2137
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
49. Gans HA, Yasukawa LL, Sung P, Sullivan B, Dehovitz R, Audet S, et al. Inmunidad humoral y mediada por células del sarampión en niños de 5 a 10 años después de la inmunización primaria contra el sarampión administrada a los 6 o 9 meses de edad. J Infect Dis (2013) 207:574–82. doi:10.1093/infdis/jis719
50. Diallo A, Minet C, Berhe G, Le Goff C, Black DN, Fleming M, et al. Respuesta inmune de cabra a la vacuna contra la viruela que expresa la proteína hemaglutinina de la peste de pequeños rumiantes. Ann N y Acad Sci (2002) 969:88–91. doi:10.1111/j.1749-6632.2002.tb04356.x
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
51. Berhe G, Minet C, Le Goff C, Barrett T, Ngangnou A, Grillet C, et al. Desarrollo de una vacuna recombinante dual para proteger a los pequeños rumiantes contra las infecciones por virus peste-des-petits-rumiants y capripoxvirus. J Virol (2003) 77:1571–7. doi:10.1128/JVI.77.2.1571-1577.2003
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
52. Jones L, Giavedoni L, Saliki JT, Brown C, Mebus C, Yilma T. Protection of winats against peste des petits rumiants with a vaccinia virus double recombinant express the F and H genes of rinderpest virus. Vaccine (1993) 11:961–4. doi:10.1016/0264-410X(93)90386-C
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
53. Saravanan P, Sen A, Balamurugan V, Rajak KK, Bhanuprakash V, Palaniswami KS, et al. Eficacia comparativa de las vacunas contra la peste de pequeños rumiantes (PPR). Biologicals (2010) 38:479–85. doi:10.1016/j.biologicals.2010.02.003
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico
Palabras clave: BoHV-4, PPRV, vacunas DIVA, antígeno H, vacunas virales
Cita: Macchi F, Rojas JM, Verna AE, Sevilla N, Franceschi V, Tebaldi G, Cavirani S, Martín V y Donofrio G (2018) Bovine Herpesvirus-4-Based Vector Delivering Peste des Petits Rumiants Virus Hemagglutinin ORF induce anticuerpos neutralizantes y respuestas citotóxicas de células T. Frente. Immunol. 9:421. doi: 10.3389/fimmu.2018.00421
Recibido: 11 de enero de 2018; Aprobado: 15 de febrero de 2018;
Publicado: 05 Marzo 2018
Editado por:
Fabrizio Ceciliani, Università degli Studi di Milano, Italia
Revisado por:
Simon Paul Graham, Instituto Pirbright (BBSRC), Reino Unido
Martin Faldyna, Instituto de Investigación Veterinaria (VRI), Chequia
Copyright: © 2018 Macchi, Rojas, Verna, Sevilla, Franceschi, Tebaldi, Cavirani, Martín y Donofrio. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons (CC BY).
*Correspondencia: Gaetano Donofrio, gaetano.donofrio@unipr.it
Renuncia: Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante no está garantizado ni respaldado por el editor.
Date de alta y recibe nuestro 👉🏼 Diario Digital AXÓN INFORMAVET ONE HEALTH
Date de alta y recibe nuestro 👉🏼 Boletín Digital de Foro Agro Ganadero
Noticias animales de compañía
Noticias animales de producción
Trabajos técnicos animales de producción
Trabajos técnicos animales de compañía
