Introducción

Las células LFBK-αVβ6 son una línea celular porcina de riñón que se transdujo para expresar el receptor de integrina αVβ6 bovino con el fin de proporcionar una línea celular altamente sensible y continua para la propagación del virus de la fiebre aftosa (FMDV) [(1); corrección (2)]. LaRocco et al. (1) demostraron que la sobreexpresión de la integrina αVβ6, un receptor celular conocido para la FMDV, mejoró la susceptibilidad a un rango de FMDV en relación con otras líneas celulares continuas (es decir, BHK, IB-RS-2, MVPK, LFBK y LK), al tiempo que Posteriormente, Fukai et al. (3) demostraron que las células LFBK-αVβ6 tienen una susceptibilidad similar a las muestras clínicas FMDV sin epitelio que las células ZZ-R 127.

Previamente validamos el uso de células LFBK-αVβ6 con fines de diagnóstico dentro del Laboratorio Mundial de Referencia para la Fiebre Aftosa (WRLFMD) (4). Nuestros resultados demostraron que las células LFBK-αVβ6 tenían una sensibilidad analítica similar a las suspensiones de epitelio FMDV que las células tiroideas primarias bovinas (BTY), que anteriormente se habían identificado como el sistema celular más sensible para el aislamiento de FMDV (5). Además, las células LFBK-αVβ6 habían mejorado la susceptibilidad a los FMDV adaptados a los porcinos en comparación con las células IB-RS-2 (4). Desafortunadamente, la línea celular LFBK-αVβ6 está infectada persistentemente con un virus de la diarrea bovina no citopático (BVDV; familia Flaviviridae, género Pestivirus) (Rodriguez, comunicación personal), lo que complica el uso de estas células debido a la preocupación por la contaminación cruzada de otras líneas celulares y las aplicaciones posteriores, incluida la

La presencia de un BVDV nocitopático en las células no es una ocurrencia novedosa. Múltiples estudios han documentado cepas de BVDV nocitopáticas presentes en el suero bovino fetal (6-10), lo que probablemente conduce a la posterior contaminación de numerosas líneas celulares, incluidos muchos cultivos no bovinos (11-13). Dado el impacto negativo de la BVDV en la industria ganadera y como contaminante de laboratorio, numerosos estudios han evaluado compuestos químicos sobre su capacidad para inactivar o inhibir la BVDV [revisado en (14)]. Se ha demostrado que un compuesto catiónico aromático, DB772, previene y elimina el BVDV no citopático de las células fibroblastos fetales infectadas persistentemente sin causar citotoxicidad (15, 16), además de tener propiedades antivirales in vivo (17).

El objetivo de este estudio fue erradicar el BVDV de las células LFBK-αVβ6 utilizando DB772, siguiendo procedimientos similares a los descritos en Givens et al. (16). Las suspensiones de células no aclaradas recogidas durante y después del tratamiento con DB772 se probaron para detectar la presencia del genoma BVDV utilizando un ensayo RT-PCR en tiempo real de pestivirus (rRT-PCR). La sensibilidad de la línea celular después del tratamiento con DB772 se evaluó mediante la realización de titulaciones comparativas con una gama de virus vesiculares junto con la línea celular original LFBK-αvβ6.

Materiales y métodos

Todos los experimentos se llevaron a cabo en laboratorios de alta contención del Instituto Pirbright que cumplen con las Normas Mínimas de Gestión del Riesgo Biológico para Laboratorios que Trabajan con el Virus de la Enfermedad de la Huella y la Virgen de la Comisión Europea para el Control de la Enfermedad de la Huella y la Virgen (18).

Compuesto antiviral (DB772)

El compuesto 2-{5-[4-(4,5-Dihidro-1H-imidazol-2-il)fenil]furano-2-il}-1H-benzo[d]imidazol 4-tolenosulfonato sal (DB772) fue sintetizado por NewChem Technologies (Durham, Reino Unido). Se preparó una solución de caldo de 10 mM en dimetilsulfóxido (Sigma) y se almacenó a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.

Células y tratamiento con DB772

La línea celular LFBK-αvβ6 [(1), corrección (2)], suministrada por el Centro de Enfermedades Animales de Plum Island (Nueva York, EE. UU.), se mantuvo como se describió anteriormente (4). En pocas palabras, las células LFBK-αvβ6(paso 19) se cultivaron en un matraz de cultivo de tejido de tapa de filtro de 175 cm2 células (Cellstar, Greiner Bio-One) a 37 °C en presencia de un 5 % de CO2 hasta que la monocapa alcanzó el 90-100% de confluencia. La monocapa celular se lavó con 15 ml de solución salina tamponada de fosfato estéril de 15 ml (PBS; Severn Biotech), seguida de 15 ml de tripsina-EDTA (Gibco). Después de retirar la tripsina, el matraz se inculó a 37 °C hasta que las células se disociaron de la superficie del matraz. Luego, las células se re suspendieron en el medio Eagle modificado de Dulbecco de 25 ml (DMEM; Gibco) suplementado con un 10 % de suero bovino (BS; BVDV negativo certificado, Gibco) (referido DMEM + BS). Dos tubos Falcon de 50 ml recibieron cada uno 1 ml de la suspensión de la celda y se centrifugaron a 340 g durante 5 minutos a 4 °C. Las células granuladas se reuspendieron en 5 ml de DMEM + BS (control no tratado) o 4 μM DB772 DMEM + BS, se transfirieron a frascos de cultivo de tejido de tapa de filtro de 25 cm2 (TPP Techno Plastic Products) e incubaron a 37 °C en presencia de un 5 % de CO2. Después de 24 horas, los medios se retiraron de los frascos y se reemplazaron por los correspondientes 5 ml de DMEM + BS con o sin DB772. Las células se incubaron a 37 °C en presencia de un 5 % de CO2 hasta que las monocapas alcanzaron una confluencia del 90-100 %.

Se realizaron pasajes posteriores siguiendo el procedimiento anterior, incluyendo el uso de 1 ml de suspensiones celulares (relación dividida de 1:4), pero con los otros volúmenes ajustados para el uso de frascos de 25 cm2 (es decir, 3 ml de PBS estéril, 3 ml 0,25% de tripa-EDTA, resuspensión de células en 4 ml de DMEM En cada paso, se añadieron 125 μL de la suspensión celular a 325 μL de tampón de lisis MagMAX (relación 5:13; Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) y se almacenaron a -80 °C hasta la prueba. El tratamiento con DB772 continuó durante 9 pasajes (pasos 20-28), después de lo cual las células se mantuvieron en DMEM + BS, idénticas a las células no tratadas. Para diferenciar los dos cultivos, las células LFBK-αvβ6 tratadas con 4 μM DB772 pasaron a llamarse WRL-LFBK-αvβ6.

Los cultivos de LFBK-αvβ6 y WRL-LFBK-αvβ6 se mantuvieron durante 10 pasajes posteriores (pasos 29-38), y en cada paso, la suspensión celular se añadió al tampón de lisis y se almacenó a -80 °C hasta la prueba. El cultivo de WRL-LFBK-αvβ6 se mantuvo durante 18 pasajes adicionales (pasos 39-56), y en los pasajes 40, 44, 48, 52 y 56, la suspensión de células se añadió al tampón de lisis y se almacenó a -80 °C hasta la prueba. Las reservas de células WRL-LFBK-αvβ6se almacenaron en nitrógeno líquido en los pasajes 33, 34 y 40.

Detección de BVDV

El ARN se purificó a partir de suspensiones celulares no aclaradas utilizando el kit de aislamiento de ARN viral MagMAX-96 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) en un robot de extracción Kingfisher Flex (Thermo Fisher Scientific) utilizando un protocolo automatizado. Todas las extracciones se realizaron por triplicado, incluyendo un genoma BVDV positivo y un control negativo por placa de extracción. El control positivo se preparó a partir de células LFBK-αvβ6 y generó un valor de ~23 TC, y el control negativo fue una suspensión negativa del epitelio de cerdo (es decir, control utilizado regularmente con pruebas de diagnóstico de enfermedades vesiculares de rutina y que contiene material genómico porcino).

El ARN purificado se probó mediante rRT-PCR utilizando el kit de qRT-PCR EXPRESS One-Step Superscript (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Cada pozo de la rRT-PCR consistía en 5 μL de plantilla de ARN y 15 μL de mezcla maestra [10 μL de mezcla EXPRESS, 1 μL cada uno de imprimación hacia adelante e inversa (20 μM), 0,5 μL de sonda (15 μM), 0,5 μL de tinte de Se utilizaron imprimaciones y sondas dirigidas a la región no traducida conservada de 5′ del genoma del pestivirus (19), según lo recomendado por el Manual de la OIE (20) para la detección de BVDV. Las siguientes condiciones de ciclo se utilizaron en un instrumento de PCR rápido en tiempo real de 7.500 utilizando el ajuste rápido (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific): 50 °C durante 15 minutos, 95 °C durante 20 s, luego 50 ciclos de 95 °C durante 3 s y 60 °C durante 30 s. Las muestras con CT a valor ≤40 se consideraron positivas (20).

Tituciones de virus

Se seleccionaron virus representativos de la enfermedad vesicular para las pruebas de la colección WRLFMD. La suspensión original FMDV/O/KUW/4/2016 se preparó como se describe en Gray et al. (4) a partir del epitelio vesicular, y se utiliza para monitorear rutinariamente la variación de lote a lote de línea celular primaria y continua. Además, se seleccionaron los siguientes virus para las pruebas: virus de la enfermedad vesicular porcina (SVDV) UKG/77/1980 RS1, virus de la estomatitis vesicular (VSV) IND-1 BHK5, exantema vesicular del virus porcino (VESV) D53 PK5 RS3, y virus del Valle Seneca (SVV) RS3. Las titulaciones del virus se realizaron en paralelo para comparar las sensibilidades relativas de la línea celular.

Las células WRL-LFBK-αvβ6 y LFBK-αvβ6 se dilataron (a partir del paso 40) para las titulaciones; las células se sembraron en tubos de cultivo celular de lado plano de Nunc (5,5 cm2; Thermo Fisher Scientific) y alcanzaron una confluencia del 90-100% en 24 horas con una Las existencias de virus se diluyeron en serie 10 veces en tampón M25 [35 mM de fosfato de hidrógeno disódico (Sigma) y 5,7 mM de fosfato de dihidrógeno potásico (Fisher Scientific) en agua estéril]. Las células (n = 5 tubos por línea celular por dilución/control) se lavaron con 2 ml de PBS estéril antes de agregar 2 ml de medios esenciales mínimos (MEM; Gibco) complementados con 6 ml/L de antibióticos de campo y 2% de BS (Gibco). Los tubos celulares se inocularon con 0,2 ml de la dilución del virus adecuada y se incubaron con rotación a 37 °C. Después de 72 horas, se realizó una lectura final de las células examinando al microscopio la presencia de efecto citopático (CPE). Para cada línea celular, los títulos virales se calcularon utilizando el método Spearman-Karber y se expresaron como Log10 TCID50/mL. Se realizaron tres titulaciones independientes por virus y se compararon los títulos virales promedio entre las líneas celulares mediante pruebas t (GraphPad Prism 9.1.0).

Resultados

El crecimiento celular de WRL-LFBK-αvβ6 fue más lento durante el tratamiento con DB772 en comparación con los controles no tratados (10-40 % según estimaciones de confluencia diaria), pero no se observó citotoxicidad (pasos 20-28). BVDV no se detectó en células WRL-LFBK-αvβ6 después de tres pasajes en presencia de 4 μM DB772 (Figura 1). El nivel del genoma BVDV en la línea celular LFBK-αvβ6 no tratada fue consistente a lo largo de las pruebas (TC media = 20,8; Figura 1). Después de que se detuviera el tratamiento con DB772 (a partir del paso 29), el BVDV no se detectó en los cultivos WRL-LFBK-αvβ6 a través del paso 56 (Figura 1, datos no mostrados en los pasajes 40-56). Los títulos virales promedio fueron comparables entre los cultivos celulares WRL-LFBK-αvβ6 y LFBK-αvβ6 para todos los virus de la enfermedad vesicular probados (valores de p > 0,05; Tabla 1).

FIGURA 1. Eliminación de BVDV de las células LFBK-αvβ6detectadas por RT-PCR en tiempo real. BVDV no se detectó en suspensiones celulares no aclaradas de células WRL-LFBK-αvβ6después de tres pasajes con tratamiento con 4μM DB772. Los puntos de datos representan la CT promedio (n = 3) ± desviación estándar. La línea de puntos denota el corte del ensayo de pestivirus (TC de <40), y la flecha indica el primer paso en el que se detuvo el tratamiento con DB772 para las células WRL-LFBK-αvβ6.

TABLA 1. Sensibilidad analítica comparativa de las células tratadas con DB772 (WRL- LFBK-αvβ6₎ y no tratadas a los virus de la enfermedad vesicular.

Discusión

En este estudio, se probó el compuesto catiónico aromático DB772 a 4 μM para eliminar la infección no citopática de BVDV en la línea celular LFBK-αvβ6. Después de tres pasajes en presencia de DB772, el BVDV no fue detectado y permaneció sin ser detectado a lo largo de los pasajes celulares posteriores, incluso después de que se detuviera el tratamiento con DB772 (Figura 1). La sensibilidad analítica del cultivo WRL- LFBK-αvβ6 fue comparable a la línea celular LFBK-αvβ6 infectada con BVDV original cuando se probaron las titulaciones de FMDV, SVDV, VSV, VESV y SVV (Tabla 1).Estos datos apoyan el uso de WRL- LFBK-αvβ6 para el diagnóstico de fiebre aftosa y enfermedad vesicular, con los hallazgos de acuerdo con los reportados anteriormente en Gray et al. (4).

Es posible que menos de nueve pasajes con DB772 pudieran haber sido suficientes para eliminar el BVDV de las células LFBK-αvβ6 (es decir, detenerse después de tres pasajes); sin embargo, las pruebas de rRT-PCR no se realizaron inmediatamente después de cada paso para confirmar los niveles de detección del genoma de BVDV. Sin embargo, la presencia de DB772 no pareció tener un efecto inmediato o a largo plazo en las células (es decir, sin citotoxicidad ni diferencia en la sensibilidad viral). El crecimiento celular fue más lento en presencia de DB772, pero se recuperó después de la aprobación posterior en DMEM + BS.

En estudios iniciales, el Forsythoside A (2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethyl 6-O-(6-deoxy-β-D-gulopyranosyl)-4-O-[(2E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoil]-α-L-altropiranosido) también se evaluó como un compuesto potencial (21). Sin embargo, los experimentos se detuvieron después del segundo paso, dado que la forsythosida A utilizada a 100 μg/ml en DMEM + BS inhibió el crecimiento de las células LFBK-αvβ6.

Estos resultados apoyan los de Givens et al. (16), lo que demuestra que DB772 se puede utilizar para erradicar la BVDV de las células infectadas persistentemente, y destaca el uso potencial de DB772 para otras líneas celulares de alto valor con BVDV no citopática. El tratamiento con DB772 y la posterior eliminación de BVDV de las células LFBK-αvβ6 no alteraron la capacidad de estas células para apoyar el crecimiento de FMDV y otros virus vesiculares. El cultivo celular libre de BVDV, WRL-LFBK-αvβ6, se puede manejar utilizando precauciones estándar asociadas con las prácticas de cultivo celular, ahora que se elimina el riesgo de contaminación cruzada de otras líneas celulares y/o reactivos con BVDV. La eliminación de BVDV de estas células también es una ventaja para preparar cepas de desafío para estudios in vivo y preparaciones de vacunas.

Declaración de disponibilidad de datos

Los autores pondrán a disposición los datos sin procesar que respaldan las conclusiones de este artículo, sin reservas indebidas.

Contribuciones del autor

VM concibió el estudio. VM y AG desarrollaron la metodología. AG y EH llevaron a cabo los experimentos con la supervisión de BW y VM. AG analizó estos datos. BW y VM escribieron el manuscrito. DK obtuvo financiación. Todos los autores leyeron y aprobaron el contenido del manuscrito.

Financiación

Esta investigación fue apoyada por la financiación del Departamento de Medio Ambiente, Alimentación y Asuntos Rurales del Reino Unido (DEFRA; Proyecto SE1130). El Instituto Pirbright recibe apoyo estratégico del Consejo de Biotecnología e Investigación Biológica (BBSRC), Reino Unido (Proyectos BBS/E/I/0007035, BBS/E/I/00007036 y BBS/E/I/00007037).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Agradecimientos

Los autores desean dar las gracias a L. Rodríguez y M. LaRocco (Plum Island, USDA/ARS) por proporcionar la línea celular LFBK-αvβ6, y B. Tyson (NewChem Technologies) para soporte técnico.

Referencias