Introducción

La evaluación de nuevos enfoques metodológicos para identificar los peligros microbiológicos y químicos en los alimentos para humanos y animales es un enfoque central de la investigación de la FDA (1). El avance de la ciencia para mejorar la política regulatoria es un dogma central que sustenta la misión de salud pública de la Agencia. En la actualidad, los datos genómicos y metagenómicos se utilizan para aplicaciones de seguridad alimentaria, como el seguimiento de patógenos en origen (2, 3), la identificación de adulterantes, contaminantes, toxinas y alérgenos (4) y la detección y predicción de la resistencia a los antimicrobianos (RAM) (5). Una nueva frontera de utilidad para los datos metagenómicos incluye el apoyo a las evaluaciones de toxicidad química a través de la provisión de perfiles holísticos basados en el ADN de componentes macro (plantas, animales e insectos) y micro (bacterias, hongos, virales y RAM) de alimentos humanos y animales no procesados y altamente procesados.

Las herramientas moleculares han facilitado un cambio de paradigma en nuestra comprensión de la ecología de la patogenicidad asociada a los alimentos humanos y animales (6). Una tendencia similar en la evaluación del riesgo de micotoxinas ha evolucionado para considerar la coexposición simultánea a diversas micotoxinas (7). Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por hongos. Hay cientos de fracciones diferentes producidas por una o varias especies. Es raro que exista una sola micotoxina en cualquier cultivo o alimento debido a la compleja biodiversidad de las ecologías agrícolas (8). Las especies de hongos reportadas para el maíz solo incluyen Fusarium proliferatum, Trichoderma gamsii, T. longibrachiatum, Penicillium oxalicum, P. aurantiogriseum, P. polonicum, Bipolaris zeicola, Sarocladium zeae, Chaetomium murorum, Botrytrichum murorum, Cladosporium cladosporioides, C. sphaerospermum, Aspergillus niger, A. flavus, Alternaria alternata y Rhizopus microsporus (9), de los cuales se sabe que al menos la mitad producen toxinas importantes para la salud humana y animal.

Hasta la fecha, la evaluación del riesgo de las micotoxinas en los alimentos se ha centrado principalmente en un pequeño número de toxinas importantes con efectos adversos críticos, sin tener en cuenta ampliamente la coexposición a múltiples compuestos (7), a pesar de que la presencia de múltiples micotoxinas es más común que la presencia de una sola micotoxina. Estudios recientes sobre la alimentación animal en Europa revelaron que entre el 75 y el 100 % de los piensos examinados contenían más de una micotoxina (10). La exposición a una sola toxina o a múltiples micotoxinas puede provocar efectos adversos (7). Si bien se ha realizado mucho trabajo para describir la coexposición a las micotoxinas, todavía hay más que aprender sobre las toxicidades dietéticas asociadas con las micotoxinas concurrentes.

Aspergillus flavus y A. parasiticus son dos de las especies aflatoxigénicas más tradicionalmente reconocidas en productos básicos antes y después de la cosecha, pero hay muchas otras especies de Aspergillus productoras de aflatoxinas, e incluso se ha propuesto que las especies de Fusarium, Penicillium, Claviceps y Alternaria pueden producir aflatoxinas (11, 12). La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC, por sus siglas en inglés) ha clasificado las aflatoxinas como los carcinógenos naturales más potentes conocidos por la humanidad y se estima que contaminan el 25% de los cultivos en todo el mundo (13). Muchos ingredientes comúnmente utilizados para alimentos de origen animal, como el maíz, el trigo y el arroz, son susceptibles a la contaminación por micotoxinas.

La secuenciación del genoma completo (WGS, por sus siglas en inglés) y la secuenciación metagenómica (MGS, por sus siglas en inglés) se han utilizado para describir cómo los patógenos y las toxinas se asocian con los alimentos humanos y animales (6, 14-19), pero una nueva frontera de datos químicos y metagenómicos integrados está en el horizonte para la evaluación modernizada de las toxinas químicas en los alimentos. Aquí utilizamos datos de MGS para describir cómo la abundancia taxonómica (cantidad de ADN) de la especie de hongo aflatoxigénico putativo, Aspergillus, se correlacionó con los niveles de aflatoxina cuantificados por espectrometría de masas por cromatografía líquida (LCMS). Se demostró que dos niveles de croquetas contaminadas con aflatoxinas, uno a 15 ppb y otro a 522 ppb, se correlacionan con una abundancia baja y alta (respectivamente) de ADN de Aspergillus. Además, demostramos que una amplia gama de especies que pueden producir micotoxinas adicionales podrían identificarse mediante datos metagenómicos, para abordar mejor las brechas de datos actuales y modernizar la evaluación del riesgo de micotoxinas.

Materiales y métodos

Evaluación de micotoxinas

Se midieron niveles bajos (15 ppb) y altos (522 ppb) de croquetas contaminadas con aflatoxinas de acuerdo con los procedimientos operativos estándar de la División de Industrias Vegetales del Departamento de Agricultura de Missouri, que utiliza el método oficial AOAC 2005.08: Aflatoxinas en maíz, maní crudo y mantequilla de maní (cromatografía líquida con derivatización fotoquímica posterior a la columna). Posteriormente, las muestras se enviaron al Centro de Medicina Veterinaria de la FDA para su análisis metagenómico. Las croquetas que miden 15 ppb de aflatoxina se consideraron «bajas» y las croquetas que miden 522 ppb se consideraron muestras de aflatoxina de nivel «alto» para los fines de este estudio. La aflatoxina a 15 ppb en las croquetas está por debajo del nivel de acción de la FDA para las aflatoxinas de 20 ppb en los alimentos para mascotas (20). Un laboratorio de evaluación de piensos de terceros llevó a cabo una evaluación adicional de micotoxinas múltiples de LCMS (Cumberland Valley Analytical Services, Zullinger, PA). Las micotoxinas evaluadas incluyeron aflatoxina, fumonisina, ocratoxina A y zearalenona en croquetas de control y contaminadas.

Se tomaron muestras de «control» de exactamente la misma marca de alimento para perros, pero con un número de lote diferente (que no forma parte de las croquetas contaminadas con aflatoxinas retiradas del mercado) para representar una línea de base. Los ingredientes de las croquetas enumerados son harina de subproductos de pollo, maíz, trigo, harina de carne, salvado de arroz, grasa de pollo, pulpa de remolacha seca, harina de pescado blanco, linaza, sal, cloruro de potasio, cloruro de colina, vitaminas y minerales. La etiqueta describía una composición de al menos 26% de proteína, 15% de grasa con un máximo de fibra al 6%, humedad al 10% y 3.645 kcal/kg.

Preparación del metagenoma

Tres porciones de 2,5 g de cada nivel de croquetas contaminadas con aflatoxinas y control se molieron hasta obtener un polvo fino en un Qiagen Tissue Lyser II a 30 Hz (1800 oscilaciones por minuto) durante 1,3 min por muestra. Para la extracción de ADN se utilizaron réplicas de 100 mg de polvo de la mezcla combinada (7,5 gramos). La extracción de ADN se realizó utilizando el kit de extracción de ADN de alto peso molecular Zymo de acuerdo con las especificaciones del fabricante, incluida una etapa de lisis adicional con PBS y lisozima (21). Las bibliotecas de ADN se crearon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN de Illumina de acuerdo con los protocolos especificados por el fabricante y la secuenciación se realizó en un NextSeq 2000 utilizando un kit de alto rendimiento de acuerdo con los métodos descritos anteriormente (22). Se realizó una ejecución adicional de secuenciación de alto rendimiento NextSeq 2000 con solo dos réplicas de muestras de bajo y alto nivel para lograr una profundidad de secuenciación de entre 100 y 250 millones de lecturas por réplica para evaluar cómo el aumento de la profundidad de lectura afectó la incidencia de especies clave.

Análisis bioinformáticos

Los datos de la secuencia se examinaron para determinar las métricas de calidad utilizando Trimmomatic (23) y se analizaron utilizando tuberías y bases de datos internas de la FDA, como se describió anteriormente (22). La determinación de la composición bacteriana y fúngica a partir de la secuenciación de escopeta se llevó a cabo utilizando programas personalizados de C++ desarrollados para compilar una base de datos de firmas k-mer que contiene múltiples secuencias únicas de 30 pb por especie y luego identificar cada lectura en el archivo de entrada utilizando las sondas de 30 pb. Para cada especie o subespecie bacteriana o fúngica, cada 30 meros no duplicado de una secuencia de genoma completo de referencia se colocó en una base de datos. Se eliminaron los k-mers que no se encontraban en al menos 2/3 de un conjunto de secuencias genómicas adicionales de la misma especie y se eliminaron los k-mers encontrados en genomas de otras especies. La normalización se realizó para corregir el sesgo debido al diferente número de k-mers por entrada de la base de datos y los resultados se tabularon como porcentaje de lecturas identificadas (contribución a la población microbiana de las especies identificadas) para cada entrada de la base de datos. Los resultados se pueden expresar por golpes brutos o como abundancia relativa. Ambos son útiles cuando se detectan organismos de baja abundancia en metagenomas complejos. La anotación también se realizó utilizando la aplicación basada en la nube Cosmos ID (CosmosID Metagenomics Cloud, app.cosmosid.com, CosmosID Inc., www.cosmosid.com) con Fungal Database Version 1.2 (24). LEfSe (Linear discriminant analysis effect size) por la biopanadería Huttenhower¹ (25) se calculó en la aplicación COSMOSID. LEfSe (Linear discriminant analysis effect size) es un algoritmo utilizado para el descubrimiento de biomarcadores biológicos. Se identificaron características como genes, vías o taxones para cada tratamiento y se utilizó la prueba factorial no paramétrica de rangos de suma de Kruskal-Wallis (KW) (26) para identificar una abundancia diferencial significativa de características específicas entre los tratamientos. Se utilizó el Análisis Discriminante Lineal (LDA) para estimar el tamaño del efecto de cada característica diferencialmente abundante y clasificar la característica en consecuencia. Para el gráfico de barras presentado en la sección de resultados, el LDA varió de 2,9 a 5,27 y el valor de p varió de 0,022 a 0,035. Las anotaciones de datos de secuencia se visualizaron utilizando gráficos creados por el paquete R Tidyverse.²

Identificación de la vía de las micotoxinas

Las lecturas metagenómicas se mapearon con Diamond (v2.0.5) (27) BLASTX (≥95% de identidad y ≥90% de cobertura de lectura) a una base de datos de genes involucrados en las vías biosintéticas de micotoxinas: aflatoxina, deoxinivalenol, nivalenol, ocratoxina, patulina, esterigmatocistina, T2_toxin y tenuazonic_acid. Los genes fueron identificados y descargados de la base de datos MetaCyc (28).³ La identidad de las lecturas que se alinean con los genes de micotoxinas fue confirmada por BLASTX, alineándolas con la base de datos NCBI nr en línea.

Resultados

Ingredientes de croquetas identificados mediante secuenciación metagenómica

Para describir la composición y la abundancia relativa de los ingredientes, se crearon datos metagenómicos para tres réplicas de control, tres réplicas de croquetas contaminadas con aflatoxinas de baja concentración (15 ppb) y tres réplicas de croquetas contaminadas con aflatoxinas de alta concentración (522 ppb). Se utilizó un promedio de 182 millones de secuencias por réplica en los análisis posteriores. La abundancia relativa de macroingredientes [anotados por el ADN mitocondrial (29) y que ocurren en más del 1% de los datos normalizados] incluyeron Zea (maíz), Gallus (pollo), Triticum (trigo), soja (soja), Bos (vaca, buey, toro, yak, ganado) y levadura. Un mayor refinamiento de las anotaciones de las especies describió Z. mays, G. gallus, G. gallus ssp. spadiceus, T. aestivum, B. taurus, varias especies de Saccharomyces (cerevisiae, pastorianus y pastorianus Weihenstephan) y Fusarium verticillioides.

Especies de Aspergillus en croquetas

La evaluación de los datos metagenómicos de las croquetas de control, de bajo y alto nivel que contenían aflatoxinas se correlacionó con la abundancia relativa de ADN de las especies de Aspergillus, es decir, las croquetas contaminadas con aflatoxinas de bajo nivel tenían una baja abundancia de ADN de las especies de Aspergillus y las croquetas de alto nivel tenían una mayor abundancia relativa de Aspergillus especie. La incidencia de Aspergillus o de cualquier otro taxón puede expresarse mediante aciertos brutos en el genoma de interés o como abundancia relativa después de la normalización por recuento de k-mer por organismo y número de lecturas de secuencia. Casi no se detectó ADN de Aspergillus en los controles (Figura 1). La especie de Aspergillus identificada en las croquetas de control fue predominantemente A. glaucus. La Figura 1A muestra las veinte especies de Aspergillus más abundantes identificadas en los niveles control, bajos (15 ppb) y altos (522 ppb) de croquetas para perros contaminadas con aflatoxinas utilizando la normalización de abundancia relativa. La Figura 1B muestra los impactos de k-mer en bruto a las 20 principales especies de Aspergillus observadas en los metagenomas. Ambos enfoques, abundancia relativa y aciertos de k-mer en bruto, son útiles cuando se intenta detectar ADN de baja abundancia de organismos de baja abundancia. Hubo un extenso rango taxonómico de especies de Aspergillus identificadas en las croquetas. La producción de aflatoxina puede haber estado asociada con una sola especie o potencialmente con varias especies. Aspergillus oryzae, flavus y phoenicis fueron las especies más abundantes observadas en croquetas contaminadas con aflatoxinas de alto nivel (522 ppb). Aspergillus flavus y A. parasiticus son dos de los productores de aflatoxina más tradicionalmente reconocidos en productos básicos antes y después de la cosecha (12). Es probable que estas especies desempeñaran un papel en la producción de aflatoxinas en las croquetas, ya que no se sabe que A. oryzae y A. phoenicis produzcan aflatoxinas (30, 31).

Figura 5. Resumen de la abundancia diferencial a nivel de familia fúngica. Las familias Apergillaceae (que contienen los géneros Aspergillus) y Nectriaceae (que contienen los géneros Fusarium) se observaron en una abundancia significativamente mayor en las croquetas contaminadas (aflatoxina de alto nivel) que en las croquetas de control, y las Saccharomycetaceae (que contienen los géneros Saccharomyces, es decir, levadura) tienen una abundancia significativamente mayor en las croquetas de control en comparación con las croquetas contaminadas.

Identificación de genes funcionales en las vías de las micotoxinas

Más allá de la identificación de la estructura taxonómica de las croquetas, los datos metagenómicos también describieron genes funcionales implicados en la producción de micotoxinas y, por lo tanto, proporcionaron una confirmación adicional de las vías de micotoxinas como el deoxinivalenol, el nivalenol y la aflatoxina. No es sorprendente que los impactos más numerosos en los genes implicados en la vía de producción de aflatoxinas se observaran en las muestras contaminadas con aflatoxinas de alto nivel (Tabla 2). Los aciertos dobles y únicos de nivalenol (VNI) y deoxinivalenol (DON) en muestras de control pueden ser indicativos de niveles bajos de VNI o DON en estas muestras.

Tabla 2. Impactos en genes en las vías de deoxinivalenol, nivalenol y aflatoxinas en datos metagenómicos de croquetas.

Otras observaciones interesantes

Stenocarpella maydis, otro potencial productor de toxinas, se observó en las muestras de croquetas contaminadas, pero no en los controles. Stenocarpella se identificó como un biomarcador para muestras de aflatoxinas de bajo nivel donde se enriqueció significativamente (Figura 3). Los metabolitos tóxicos, como la diplodiatoxina, las quetoglobosinas K y L, y (all-E)-trideca-4,6,10,12-tetraeno-2,8-diol asociados con Stenocarpella no se evalúan con frecuencia y no se dispone fácilmente de ELISA simple u otras pruebas basadas en HPLC.

Especies bacterianas en los metagenomas de las croquetas de perro

En la Figura 6 se muestran los perfiles bacterianos de los controles y las croquetas para perros contaminadas con aflatoxinas. Se promediaron tres réplicas de croquetas de perro contaminadas con aflatoxinas de control, de bajo y alto nivel y se graficaron taxones que se encontraban en más del 3% de los datos totales para resumir las características bacterianas de cada croqueta. Los géneros Enterobacter, Serratia y Kosakonia se observaron en croquetas contaminadas con toxinas y no en croquetas de control.

Figura 6. Especies bacterianas en croquetas contaminadas con aflatoxinas de bajo y alto nivel de control. Aquí se muestran los taxones bacterianos de croquetas para perros contaminadas con aflatoxinas de bajo y alto nivel. Las croquetas de alto nivel tuvieron una fuerte incidencia de Enterobacter cloaceae. Stenotrophomonas, que se ha descrito como un patógeno global emergente (a veces resistente a múltiples fármacos), también se observó en las croquetas de alto nivel.

Resistencia a los antimicrobianos en croquetas

Las croquetas de control tenían genes de resistencia a los antimicrobianos diferentes a los observados en las croquetas contaminadas con aflatoxinas. Lo más probable es que esto se deba a las diferentes bacterias que estaban presentes en las muestras contaminadas en comparación con los controles. Los genes implicados en la resistencia a los macrólidos se observaron en las croquetas contaminadas, así como los genes betalactámicos bla R1 y bla I, que influyen en la expresión de blaZ y la proteína de unión a la penicilina 2a (PBP 2a) y contribuyen a la resistencia a la meticilina (35, 36). El gen bla 1 se observó en muestras de control, típicamente asociado con resistencia a la ampicilina.

Discusión

Una de las principales misiones del Centro de Medicina Veterinaria (CVM) es proteger la salud animal garantizando la inocuidad de los alimentos para animales. La aplicación de datos metagenómicos para complementar las evaluaciones de identificación de toxicidad (TIE) presentadas aquí es un enfoque metodológico novedoso para apoyar la misión de salvaguardar los alimentos. Los datos metagenómicos proporcionan una identificación completa basada en el ADN de todos los constituyentes eucariotas (insectos, plantas y animales) y procariotas (bacterias, hongos y protistas) de cualquier alimento, incluidos adulterantes, alérgenos, patógenos, determinantes de resistencia a los antimicrobianos y biomarcadores. Este tipo de información puede ayudar a los químicos a enfocar los parámetros de búsqueda cuando toxinas químicas desconocidas han causado enfermedades transmitidas por los alimentos.

En este trabajo, demostramos que los datos metagenómicos de croquetas con niveles bajos y altos de contaminación por aflatoxinas se correlacionaron con la incidencia y abundancia de ADN de especies de Aspergillus. Esta observación apoya la hipótesis de que las especies de Aspergillus desempeñaron un papel en la producción de aflatoxinas que condujo a los niveles observados en las croquetas altas. Además, los genes en la vía de producción de aflatoxinas solo se identificaron en croquetas de alto nivel, lo que respalda la utilidad de los datos metagenómicos para identificar aflatoxinas en los alimentos. Los biomarcadores estadísticamente significativos asociados con aflatoxinas de alto nivel incluyeron cuatro taxones de Aspergillus enriquecidos diferencialmente y taxones distintivos de Rhizopus y Fusarium. Los biomarcadores estadísticamente significativos asociados con las croquetas de control incluyeron cuatro taxones de Saccharomyceenriquecidos diferencialmente, que, como se describió anteriormente, a menudo se agregan a los alimentos para unirse a la aflatoxina y hacer que los alimentos sean más seguros para el consumo. Los datos metagenómicos podrían servir como una evaluación de puntos de control críticos para identificar poblaciones robustas de Saccharomyces en croquetas antes de que se vendan a los consumidores. Los biomarcadores también pueden informar sobre los orígenes regionales y/o temporales de los ingredientes (31). Comprender exactamente cómo funcionan los biomarcadores de ADN como predictores de toxicidad requerirá futuros trabajos de validación, pero estos resultados preliminares son muy prometedores.

Los datos metagenómicos utilizados junto con el perfil químico no solo son útiles para detectar la contaminación por especies aflatoxigénicas conocidas, sino también para describir especies desconocidas de hongos micotoxigénicos en alimentos humanos y animales. Actualmente, la FDA monitorea las aflatoxinas, fumonisinas, vomitoxina, zearalenona y ocratoxina A en alimentos para humanos y animales utilizando métodos de un solo objetivo (37, 38), aunque la FDA ha iniciado recientemente un enfoque de vigilancia de múltiples micotoxinas para alimentos para bebés y niños pequeños (39). La metagenómica proporciona un enfoque no dirigido que puede describir los hongos micotoxigénicos que pueden producir toxinas que actualmente no son monitoreadas por la FDA y los datos podrían indicar que es posible que se necesiten pruebas adicionales de micotoxinas para caracterizar con precisión los peligros y evaluar el riesgo.

Los datos metagenómicos aquí descritos identificaron múltiples especies de Penicillium, que pueden producir toxinas como brevianamid A, citreoviridina, citrinina, ácido ciclopiazónico, fumitremorgina B, griseofulvina, luteoskyrina, ácido penicilico, penitrem A, toxina PR, roquefortina, rugulosina, verrucosidina, verruculógeno, viridicarumtoxina y xantomegnina (40). Las pruebas químicas concordantes podrían establecer si estos compuestos estaban presentes o no. Los datos metagenómicos también identificaron Stenocarpella maydis, Rhizopus delemar y R. oryzae en croquetas contaminadas y no en croquetas de control. Stenocarpella maydis es un patógeno fúngico del maíz y sus metabolitos tóxicos incluyen diplodiatoxina, quetoglobosinas K y L, y (all-E)-trideca-4,6,10,12-tetraeno-2,8-diol (41, 42). Los sinónimos de S. maydis incluyen Diplodia zeae, Diplodia maydis, Sphaeria maydis, S. zeae, Macrodiplodia zeae y Dothiora zeae, que se han relacionado con la toxicidad por diplodia (diplodiosis). La diplodiosis se caracteriza por temblores musculares, falta de coordinación, cuartos traseros atáxicos, parálisis y muerte de bovinos, ovejas, ratas y patitos, con informes de mortalidad de ganado que se remontan a 1919 (43).

Utilizando un estudio de caso limitado con croquetas retiradas del mercado con dos niveles conocidos de aflatoxina (15 ppb y 522 ppb), demostramos que el ADN de los productores putativos de aflatoxinas se enriquecía diferencialmente en croquetas de bajo y alto nivel (es decir, se observaron cantidades comparativamente altas de ADN de Aspergillus en las croquetas contaminadas con aflatoxinas de alto nivel en contraste con las de bajo nivel). También documentamos la vía de producción de aflatoxinas mediante la identificación de genes en esa vía que también solo se observaron en el ADN de croquetas de aflatoxinas de alto nivel. La identificación taxonómica de otros posibles productores de toxinas podría servir para guiar las pruebas químicas adicionales para comprender mejor si otras toxinas estaban presentes en los alimentos y qué especies pueden haberlas producido. Los datos metagenómicos pueden describir la composición total (género, especie, subespecie e incluso serovares y variedades) de plantas, animales, insectos, bacterias, hongos, virus, plásmidos y resistencia a los antimicrobianos. Los datos combinados de productos químicos y MGS son una frontera emocionante que, sin duda, proporcionará información valiosa para respaldar la evaluación de riesgos modernizada para los alimentos humanos y animales.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres de los repositorios y los números de acceso se pueden encontrar en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1062328/.

Contribuciones de los autores

AO: Redacción – borrador original, Visualización, Supervisión, Administración de proyectos, Metodología, Investigación, Análisis formal, Curación de datos, Conceptualización. BK: Redacción – revisión y edición, Visualización, Administración de proyectos, Metodología, Análisis formal, Curación de datos. ER: Escritura – revisión y edición, Visualización, Software, Análisis formal. SC: Redacción – revisión y edición, Metodología, Análisis formal. MM: Redacción – revisión y edición, Metodología, Análisis formal. PR: Redacción – revisión y edición. PM: Redacción – revisión y edición. BF: Escritura, revisión y edición. ES: Redacción – revisión y edición.

Financiación

El/los autor/es declaran/n que no se recibió apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo.

Reconocimientos

Nos gustaría agradecer a Stan Cook, Madison Fink, Quintin Muenks y Mary Koestner del Departamento de Agricultura de Missouri – Industrias Vegetales, Oficina de Piensos y Semillas por proporcionar muestras de croquetas de investigación.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Descargo de responsabilidad del autor

Las opiniones expresadas en este manuscrito son las de los autores y no reflejan necesariamente la política oficial del Departamento de Salud y Servicios Humanos, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos o el Gobierno de los Estados Unidos. La referencia a cualquier material, equipo o proceso comercial no constituye de ninguna manera aprobación, respaldo o recomendación por parte de la Administración de Alimentos y Medicamentos.

Notas

Referencias