Identificación de biomarcadores potenciales para el fallo de la barrera intestinal en pollos de engorde
Identificación de biomarcadores potenciales para el fallo de la barrera intestinal en pollos de engorde
Jeffery Escobar- 1Novus International, Inc., St. Charles, MO, EE. UU.
- 2Departamento de Ciencias de la Aves, Universidad de Arkansas, Fayetteville, AR, EE. UU.
El objetivo del presente estudio era identificar posibles biomarcadores para el fallo de la barrera intestinal en los pollos. Un total de 144 pollos machos de pollos de enmiza Ross 308 se alojaron en 24 jaulas de batería con seis polluelos por jaula. Las jaulas se asignaron al azar a un grupo de control (CON) o a un grupo de fallas de barrera intestinal (GBF). Durante los primeros 13 días, las aves de los grupos CON o GBF recibieron una dieta común de inicio de maíz y soja. El día 14, los pollos CON se cambiaron a una dieta de productores de maíz, y los pollos de GBF se cambiaron a una dieta de productor de centeno-trigo y cebada. Además, el día 21, los pollos de GBF fueron desafiados por vía oral con una vacuna contra la coccidiosis. En los días 21 y 28, las aves se pesaban por jaula y se registró la ingesta de alimento para calcular la tasa de conversión de alimento. En el día 28, un pollo de cada jaula fue sacrificado para recoger muestras intestinales para el análisis morfométrico, sangre para el suero y raspaduras de la mucosa intestinal para la expresión génica. El rendimiento general y la eficiencia de la alimentación se vieron gravemente afectados (P < 0,05) por un modelo GBF en comparación con el grupo CON en los días 21 y 28. El duodeno de las aves GBF tenía vellosidades más anchas, una profundidad de cripta más larga y una relación de profundidad de cripta/altura de vísas más alta que las aves CON. Del mismo modo, las aves GBF tenían una mayor profundidad de cripta en yjunio y íleon en comparación con las aves CON. Los niveles de proteínas de endotoxina y α1-coproteína ácida (AGP) en el suero, así como los niveles de ARNm de interleucina (IL)-8, IL-1β, factor de crecimiento transformador (TGF)-β4 y proteína de unión a ácidos grasos (FABP) 6 aumentaron (P < 0,05) en Los resultados del presente estudio sugieren que la endotoxina sérica y la AGP, así como la expresión génica de FABP2, FABP6, ILP6, IL-1β, TGF-β4, occludina y MUC2 en la mucosa pueden funcionar como biomarcadores potenciales para la salud de la barrera intestinal en los pollos.
Introducción
La función de barrera es un aspecto crítico de la salud intestinal. El estrés oxidativo, la proteína poco digerible y la coccidiosis son algunos ejemplos que pueden causar el fallo de la barrera intestinal (1-5). Sin embargo, como consecuencia de la eliminación de los promotores del crecimiento antimicrobiano, han surgido nuevas enfermedades multifactoriales que causan enteritis y trastornos intestinales de origen desconocido en los pollos de enmbril, causando impactos negativos en la salud y el rendimiento (-6-9). Entre ellos, se ha informado de disbacteriosis, definida como la presencia de una microbiota cualitativa y/o cuantitativamente anormal en las partes proximales del intestino delgado, asociada con una reducción de digestibilidad de los nutrientes, función de barrera intestinal alterada, translocación bacteriana y respuestas inflamatorias (4, 5, 10). Sin embargo, más recientemente, la mala salud intestinal también se ha asociado con la codronecrosis bacteriana con osteomielitis en pollos y criadores de enmado (11 a-1). Como el órgano más grande del cuerpo, el intestino sirve como una barrera selectiva para absorber nutrientes y fluidos en el cuerpo, al tiempo que excluye las moléculas y patógenos indeseables (3, 14, 15). Por lo tanto, la función adecuada de la barrera intestinal es esencial para mantener una salud y un equilibrio óptimos en todo el cuerpo, y representa una línea clave de defensa contra los antígenos extraños del medio ambiente (16). La primera capa de barrera intestinal es la capa de moco extrínseca compuesta por una capa externa asociada con bacterias y una capa interna con altas concentraciones de IgA y mucina secretoras. La capa exterior está unida libremente al epitelio. La capa interna es adherente a la segunda capa de barrera intestinal, las células epiteliales intestinales (IEC). Los IEC son una sola capa de células epiteliales que separan la luz intestinal de la lámina propia subyacente (17-19). Estas células epiteliales deben ser capaces de regenerarse rápidamente en caso de daño tisular (14, 20, 21). Los enterocitos del epitelio apical son responsables de la absorción de nutrientes. Las uniones estrechas (TJ) sellan el espacio paracelular entre las células epiteliales adyacentes y regulan la permeabilidad de la barrera intestinal al prevenir la difusión de microorganismos y antígenos (22, 23). Dado que IEC es el tipo de célula principal que entra en contacto con el entorno externo, actúan como la primera línea de defensa del anfitrión. A pesar de su derivación no hematopoyética, la IEC representa un elemento central de la inmunidad innata dentro del tejido linfoide asociado al intestino, mostrando una amplia gama de funciones inmunes. De hecho, la IEC es capaz de reconocer patógenos a través de la expresión de receptores inmunes innatos, la liberación de moléculas antimicrobianas y la secreción de un gran número de hormonas, neurotransmisor, enzimas, así como citoquinas y quimiocinas que unen respuestas inmunes innatas y adaptativas (24-6). Por lo tanto, cualquier daño directo o indirecto en la IEC puede causar una ruptura en la barrera intestinal y, en consecuencia, la interrupción de la homeostasis inmune normal de la mucosa que potencialmente puede conducir a una inflamación intestinal y sistémica crónica incontrolada (27,28).
Varios investigadores han descrito las vías asociadas con la interrupción de las redes de proteínas que conectan las células epiteliales por mediadores inflamatorios, como hormonas, especies de radicales libres de oxígeno, enzimas, así como múltiples citocinas proinflamatorias (27, 29, 30). También se ha demostrado que la alimentación de la grasa oxidada/no conservada aumenta las tasas de rotación epitelial intestinal y aumenta la apoptosis en las puntas de los vilos en aves de corral y cerdos (31). Se ha demostrado que los polisacáridos no a la astardos (NSP), como los β-glucanos y los pentosanes, tienen una influencia perjudicial en la utilización de nutrientes en los engordedores al aumentar la viscosidad de la digesta y reducir la digestibilidad de los nutrientes (por ejemplo, grasa y proteínas) (32, 33), lo que podría Actualmente, no se han descrito biomarcadores como herramientas para evaluar la inflamación intestinal o el fallo de la barrera intestinal en pollos de enmado. El objetivo del presente estudio no era determinar los efectos individuales de los ingredientes de la dieta o el desafío de la coccidia en la salud intestinal, sino identificar posibles biomarcadores para el fracaso de la barrera intestinal. Por lo tanto, intentamos exacerbar el fracaso de la barrera intestinal alimentando una dieta alta de NSP que contiene centeno, trigo y cebada para inducir una alta viscosidad de digesta (4, 5) en combinación con una vacunación contra la coccidiosis de 2 veces para inducir un desafío de salud intestinal.
Materiales y métodos
Fuente animal y dietas
Un total de 144 pollos machos Ross 308 fueron alojados al azar en 24 jaulas de batería con seis polluelos por jaula en habitaciones controladas por el medio ambiente. Para evitar la contaminación cruzada de la vacuna contra la coccidiosis, las aves del grupo de control (CON) y del grupo de falla de barrera intestinal (GBF) se alojaron en dos habitaciones separadas pero idénticamente controladas. La temperatura se mantuvo a 34 °C durante los primeros 5 días y luego se redujo gradualmente de acuerdo con las prácticas normales de manejo, hasta que se logró una temperatura de 23 °C. Se proporcionó iluminación las 24 horas del día. Durante los primeros 13 días, las aves de los grupos CON o GBF recibieron una dieta de inicio común de maíz y soja (Tabla 1). El día 14, las aves del grupo CON se cambiaron a una dieta de maíz-soja (28 días) y el grupo GBF se cambió a la dieta de centeno-trigo-cebada (Tabla 1). Las dietas experimentales se formularon para aproximar los requisitos nutricionales de los pollos de engorde (34). El día 21, las aves en tratamiento con GBF fueron desafiadas por vía oral con 2 veces la dosis de la vacuna contra la coccidiosis AdventTM, una mezcla de Eimeria acervulina, Eimeria maxima y Eimeria tenella (Huvepharma Sofia, Bulgaria). Todos los procedimientos de investigación fueron revisados y aprobados por un veterinario con licencia y también siguieron los protocolos descritos anteriormente (5, 35), que fueron aprobados por la IACUC de la Universidad de Arkansas. Todos los estudios realizados por Novus International, Inc. están de acuerdo con los estándares de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Agrícolas en la Investigación y la Enseñanza (35).
TABLA 1. COMPOSICIÓN DE INGREDIENTES Y CONTENIDO DE NUTRIENTES DE LAS DIETAS COMUNES, DE CONTROL Y DE FALLA DE BARRERA INTESTINAL (GBF), SEGÚN LO QUE SE MUESTRA.
Diseño experimental
Los 144 pollos de día de graniza se asignaron al azar a uno de dos grupos; CON o GBF sobre la base del peso corporal inicial (BW). Cada tratamiento se comprendió de 12 réplicas de seis polluelos cada uno (n = 72/grupo). A los 21 y 28 días, se registraron la tasa de peso corporal, el aumento de peso corporal (BWG) y la ingesta de piensos (FI) en cada jaula para calcular la tasa de conversión de piensos (FCR).
Colección de muestras
A los 28 días de edad, un pollo de cada jaula fue sacrificado por asfixia de CO2 para la recolección de muestras. Se tomó una muestra de sangre de la punción cardíaca con una jeringa, se mantuvo a temperatura ambiente durante 3 horas para permitir la coagulación y se centrífuga (1.000 × g durante 15 minutos a 4 °C) para separar el suero. Después de la eutanasia, se recogió una sección de 1 cm de duodeno desde el centro del duodeno descendente; se recogió una sección de 1 cm de jejuno en el divertículo de Meckel; se recogió una sección de 1 cm de íleon 2 cm antes de la ceca. Todas las secciones intestinales se enjuagaron con un 10% de formalina tampón neutra y luego se fijaron en un volumen de 20 veces de formalina tampón neutra al 10%. Una sección de 10 cm de jejuno se enjuagó con solución salina tamponada con fosfato frío (pH 7.4) y se cortó para raspar la mucosa usando diapositivas de vidrio sin ARNse en tubos de 2 ml con 1 ml de ARNlater (Applied Biosystems, NY, EE. UU.). Los raspados de la mucosa se almacenaron a 4 °C durante 24 horas y luego a -20 °C hasta el aislamiento total del ARN.
Preparación de muestras histológicas y medición de la morfometría intestinal
Los segmentos intestinales se recortaron, procesaron e incrustaron en parafina. Se colocó una sección de 5 μm de cada muestra en una diapositiva de vidrio y se tiñó con hematoxilina y eosina para el examen y la medición de morfometría bajo el microscopio de luz Olympus utilizando el software de imágenes Olympus MicroSuiteTM (Center Valley, PA, EE. UU.). Se tomaron cinco mediciones replicadas para cada variable estudiada de cada muestra, y los valores medios se utilizaron en los análisis estadísticos. La altura de los vilos se midió desde la parte superior de las víboras hasta la parte superior de la submucosa. La profundidad de la cripta se midió desde la base hacia arriba hasta la región de transición entre la cripta y las viles. El ancho de los vilos se midió en el centro de cada vilirios, mientras que la relación cripta/villi se determinó como la relación entre la profundidad de la cripta y la altura de los vilirios (36).
Endotoxina sérica y determinación sérica de la proteína de fase aguda α1
La endotoxina se midió con un kit de endotoxina de pollo Elisa de Amsbio (Cambridge, MA, EE. UU.). La proteína de fase aguda, la glicoproteína α1ácido (AGP) se midió utilizando el kit de medición de la glicoproteína α1ácido de pollo del Instituto de Ecosistema Metabólico (Miyagi, Japón). La densidad óptica para ambos kits se determinó a 450 nm utilizando un BIO-TEK ELx800 (Instrumento BIO-TEK, Winooski, VT, EE. UU.).
Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR)
El ARN total se aisló de muestras de raspado de la mucosa utilizando el kit de aislamiento de ARN total de Clontech NucleoSpin® RNA II (Clontech Laboratories, Inc., CA, EE. UU.). Se utilizó un microgramo de ARN total, una mezcla de oligoelementos de 11 metros de Fluoresentric y una transcriptasa inversa M-MLV (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) para sintetizar el ADNc de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los niveles relativos de ARNm de mcina 2 (MUC2), proteína de unión a ácidos grasos (FABP) 2, FABP6, interleucina (IL)-8, IL-1β, factor de crecimiento transformador (TGF)-β4, occludin, zonula occluden (ZO)-1, molécula de adhesión unionesional (JA Los resultados se expresaron como el nivel relativo al gen de limpieza correspondiente actina. Todos los cebadores se verificaron para comprobar la eficiencia y linealidad de la amplificación.
TABLA 2. LISTA DE IMPRIMACIONES UTILIZADAS PARA QRT-PCR.
Análisis estadísticos
Todos los datos se probaron para su normalidad y se sometieron a ANOVA unidireccional como un diseño completamente aleatorizado utilizando el procedimiento GLM de SAS (37). Cada jaula se utilizó como unidad experimental para el análisis. El rendimiento del crecimiento, incluidos BW, BWG, FI y FCR, utilizó los datos promedio por jaula. Las mediciones morfométricas intestinales, la endotoxina sérica, la AGP y la qRT-PCR utilizaron mediciones individuales de un ave elegida al azar por jaula. Los datos se expresan como media ± SE.
Resultados
Rendimiento del crecimiento
Los resultados de los parámetros de rendimiento de crecimiento entre los grupos CON y GBF se resumen en la Tabla 3. BW, FI por ave, BWG y FCR a los 21 y 28 días de edad se redujeron drásticamente en los pollos GBF en comparación con los pollos CON (P < 0,05), lo que indica que el modelo GBF comprometió sustancialmente el rendimiento del crecimiento de los pollos.
TABLA 3. PARÁMETROS DE RENDIMIENTO ENTRE LOS GRUPOS DE CULTIVADORES DE FALLA DE BARRERA INTESTINAL (GBF) DE CONTROL Y CONTROL.
Análisis histomorfométrico
Los resultados del análisis histomorfométrico del duodeno, el jejuno y el tejido ileal entre las gallinas CON y GBF a los 28 días de edad se resumen en la Tabla 4. El duodeno, el jejuno y el íleon mostraron un aumento (P < 0,05) de la profundidad de la cripta (que se muestra como * en la Figura 1) en los pollos GBF en comparación con los pollos CON. Los pollos GBF también tenían vellosidades más anchas en el duodeno y el jejuno, y una mayor relación de cripta/villi en el duodeno en comparación con los pollos CON; sin embargo, la relación cripta/villi no fue diferente en el jejuno (P = 0,064) y el íleo (P = 0,208) porque El aumento de la profundidad de la cripta y/o la relación cripta/villi es una indicación de una mayor necesidad de proliferación celular para mantener una salud intestinal adecuada, lo que sugiere que el modelo GBF generó una barrera intestinal poco saludable.
TABLA 4. ANÁLISIS HISTOMORPHOMÉTRICO DE LOS GRUPOS DE DUODENO, JEJUNO E ILEUM EN LOS GRUPOS DE CONTROL (CON) Y BARRERA INTESTINAL (GBF) EN POLLOS A LOS 28 DÍAS DE EDAD.
FIGURA 1. IMÁGENES REPRESENTATIVAS DE DUODENUM (A,B), JEJUNUM (C,D) E ILEUM (E,F) EN CONTROL (A,C,E) Y FALLA DE BARRERA INTESTINAL (B,D,F) GRUPOS DE POLLOS ENGORADOS A LOS 28 DÍAS DE EDAD. Los cifrados representativos se muestran como *.
Endotoxina sérica y AGP
La Tabla 5 muestra la comparación de los niveles séricos de AGP y endotoxinas entre los grupos CON y GBF de pollos de enmado a los 28 días de edad. AGP, un marcador de inflamación sistémica, aumentó (P < 0,05) 3,8 veces en aves GBF en comparación con aves CON (Tabla 5), lo que sugiere que la inflamación sistémica estaba ocurriendo en aves GBF. La endotoxina, una toxina liberada por bacterias gramnegativas en el intestino, se aumentó (P < 0,05) en 2,1 veces en el suero de las aves GBF en comparación con las aves CON (Tabla 5), lo que sugiere que se translocó una mayor cantidad de endotoxina de la luz intestinal a la sangre.
TABLA 5. COMPARACIÓN DE LOS VALORES DE ENDOTOXINA SÉRICA Y PROTEÍNA DE FASE AGUDA Α1 (AGP) ENTRE LOS GRUPOS DE CONTROL Y DE BARRERA INTESTINAL EN POLLOS A LOS 28 DÍAS DE EDAD.
Expresión génica en la mucosa jejunal por qRT-PCR
Los niveles relativos de ARNm de los genes que posiblemente estén involucrados en la función de barrera intestinal y la inflamación en la mucosa jejunal de los pollos de engorderos a los 28 días de edad se muestran en la Tabla 6. Los niveles relativos de ARNm de IL-8, IL-1β, TGF-β4 y FABP6 aumentaron (P < 0,04) en 3-, 1,5-, 2,2- y 7-fold, respectivamente, en los pollos GBF en comparación con los pollos CON. Sin embargo, los niveles de ARNm de FABP2, oclus y MUC2 disminuyeron en un 34 % (P = 0,005), un 24 % (P = 0,107) y un 29 % (P = 0,088), respectivamente, en las aves GBF en comparación con las aves CON. Los niveles de ARNm de catenina, claudina 1, ZO1, JAM2, JAM3, IL-4, IL-6, TLR4, TLR2β y TNF-α no fueron diferentes (P > 0,1) entre los pollos CON y GBF (datos no mostrados).
TABLA 6. NIVELES RELATIVOS DE ARNM DE GENES EN LA MUCOSA JEJUNAL ENTRE LOS GRUPOS DE CONTROL Y FALLA DE BARRERA INTESTINAL DE POLLOS A LA PARRILLA A LOS 28 DÍAS DE EDAD.
Discusión
Es bien sabido que la mala salud intestinal causa impactos negativos en la salud y el rendimiento del crecimiento de los pollos de enla en la industria avícola. Se ha informado que los granos alternativos, como el trigo, la cebada y el centeno que son ricos en NSP, causan una reducción significativa en el rendimiento (38-40). Se han descrito varios mecanismos de la acción de NSP sobre la absorción de nutrientes, incluido un aumento de la viscosidad de la digesta debido a la reducción de la digestibilidad, el engrosamiento de la capa mucosa mucosa intestinal, la apoptosis de células epiteliales y la inflamación causada por la disbacteriosis (10, 31,39). La avícola tiene pocas o ninguna enzima intrínseca capaz de hidrolizar estos NSP, por lo que las altas concentraciones de NSP en el trigo, la cebada o el centeno conducen a una reducción de la digestibilidad de los nutrientes. Los ingredientes de alimentación no digeridos en el intestino proporcionan nutrientes para el crecimiento excesivo de las bacterias en el intestino trasero, lo que conduce a la disbacteriosis. Las dietas altas en NSP también se han asociado con la enteritis necrótica, una enfermedad multifactorial causada por Clostridium perfringens que es probablemente la enfermedad bacteriana más importante en términos de implicaciones económicas en las gallinas de enmado (41). Las consecuencias nutricionales y económicas del aumento de una respuesta inflamatoria en las aves de corral están inversamente relacionadas con el BWG y el rendimiento general (42, 43). En el presente estudio, se utilizó una dieta de trigo-cebada y centeno en combinación con un desafío de coccidios para inducir el fracaso de la barrera intestinal en los pollos de enlachado. El rendimiento general del crecimiento y la eficiencia de la alimentación se redujeron gravemente con este modelo GBF. Estos resultados están de acuerdo con estudios anteriores de que las dietas altas de NSP comprometieron el rendimiento del crecimiento en pollos (4, 5, 44,45).
La morfometría del duodeno, el jejunio y el íleon en pollos CON y GBF a los 28 días de edad se midió bajo el microscopio para confirmar si la dieta de centeno, la cebada y el desafío del trigo y los coccidios generaron un fracaso de la barrera intestinal. Las aves GBF tenían una mayor profundidad de cripta que las aves CON en el duodeno, el jejuno y el íleon, y también una mayor relación de altura de cripta/villi en el duodeno que las aves CON. La profundidad de la cripta y la relación entre la profundidad de la cripta y la altura de los viillus son medidas de eficiencia porque el aumento de la profundidad de la cripta y/o la relación de cripta/villi indica una mayor necesidad de proliferación celular para mantener la integridad de la barrera intestinal (46-48). Además de la profundidad de la cripta más larga, el duodeno y el jejunio de las aves GBF también tenían vellosidades más amplias. Los vellosidades estrechas tienen un mayor área de absorción de nutrientes. La ampliación de los vilos indica menos área de absorción de nutrientes y probablemente también una mayor cantidad de proliferación y acumulación de tejido inmunitario asociado al intestino en el vilo, que es otra indicación de salud intestinal comprometida. El cambio estructural en las aves GBF confirmó que se estaba produciendo un fallo de la barrera intestinal en las aves GBF, lo que puede estar asociado con el bajo rendimiento en este estudio y es consistente con un estudio anterior (49).
El tracto gastrointestinal (GIT) es desafiado repetidamente por antígenos extraños y la mucosa intestinal debe tener la capacidad de restaurarse rápidamente en caso de daño tisular (50). El deterioro de esta frágil barrera conduce a la enteritis y otras enfermedades inflamatorias (9). La mucosa intestinal contiene diferentes tipos de células epiteliales con funciones específicas. IEC controla las poblaciones bacterianas asociadas a la superficie sin alterar el microbioma que son vitales para la salud del huésped (51), y desempeñan un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis intestinal y la función de barrera (52, 53). Como capa unicelular, IEC sirve como barrera protectora contra el medio ambiente externo y mantiene una defensa contra las toxinas y antígenos intraluminales, además de apoyar el transporte de nutrientes y agua (54). IEC están sellados por uniones adherentes (AJ) y TJ que están compuestas de cadherinas, claudinas, occludinas y JAM (29, 55-57). Tras una lesión, IEC se somete a un proceso de curación de heridas que depende de tres eventos celulares: restitución, proliferación y diferenciación (27). Estudios anteriores han demostrado que varios péptidos reguladores, incluidos los factores de crecimiento y las citocinas, son capaces de influir en la restauración de IEC dañado (58).
Las bacterias gramnegativas en el intestino liberan endotoxina durante el crecimiento, la división y la muerte, y la endotoxina luminal pueden translocalizarse a la circulación a través de dos vías: (1) transporte paracelular no específico a través de TJ de células epiteliales, y (2) transporte transcelular a través de los dominios de membrana de balsa lipídica y e TLR4 está involucrado en esta última ruta (60). La falta de diferencia en los niveles de ARNm de TLR4 entre las aves CON y GBF sugiere que la endotoxina probablemente no entró en circulación a través del transporte transcelular. Se ha informado de que los patógenos, como Escherichia coli o C. perfringens, así como sus toxinas elaboradas (por ejemplo, endotoxina o entertoxina) alteran la función de la TJ epitelial y la barrera intestinal (23). Se ha informado de que la mala integridad de la barrera intestinal o la apertura de TJ facilita el transporte paracelular de la endotoxina, lo que aumentará la secreción de citoquinas proinflamatorias y activará la respuesta inmune innata y adaptativa (61, 62). Las citocinas secretadas pueden entrar en la CEI a través del lado basolateral, lo que resulta en un mayor aumento de la inflamación, la interrupción de los complejos de TJ y un aumento del transporte de endotoxinas paracelulares (63). Curiosamente, había niveles detectables de endotoxina en los pollos CON, que en realidad no son el ruido de fondo detectado por el kit ELISA. En este estudio, los pollos CON eran mucho más saludables que los pollos GBF, la endotoxina en el suero de los pollos CON podría ser una difusión paracelular no específica de la endotoxina de la luz intestinal a la circulación. El aumento de los niveles de endotoxina en las aves de GBF indica que la falla de la barrera intestinal aumentó el transporte de la endotoxina de la luz intestinal a la circulación, lo que podría afectar negativamente aún más la integridad de TJ, como lo demuestra la disminución de los niveles de ARNm de occiludino en las aves de la GBF. Occludin, uno de los principales componentes de TJ, está involucrado en la regulación de la difusión intermembrana y la difusión paracelular de moléculas pequeñas (64). La oclusin está regulada en pacientes con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, dos tipos comunes de enfermedad inflamatoria intestinal en humanos (57, 64), lo que sugiere el importante papel de la oclusluin en la salud intestinal. Sin embargo, no se detectaron diferencias entre las gallinas GBF y CON en la expresión de otros componentes de TJ, como claudin 1, ZO1, JAM2 y JAM3. Claudin 1 es un miembro de la proteína transmembrana de espacila múltiple llamada claudinas, una familia de proteínas con más de 20 miembros, JAM2 y JAM3 son proteínas transmembrana de una sola espa (51, 65, 66). ZO1 es una proteína de placa que actúa como adaptador para conectar las proteínas transmembranas al anillo de actmiosina perijunctional (23). Estos resultados indican que el modelo GBF deteriora la integridad de TJ al reducir la expresión de oclusina, lo que facilita el transporte de la endotoxina de la luz intestinal a la sangre para la circulación sistémica.
También se informó que la endotoxina aumenta la secreción de péptidos de saciedad, lo que reducirá la FI (20). La disminución del rendimiento del crecimiento en las aves GBF podría estar parcialmente asociada con el aumento del péptido de saciedad resultante de los niveles elevados de endotoxinas, aunque el péptido de saciedad no se midió en este estudio.
La glicoproteína α1-ácido, una proteína de fase aguda, se ha utilizado como marcador de la inflamación sistémica en aves de corral (67). El aumento de la AGP en las aves GBF confirma que la inflamación sistémica estaba ocurriendo en las aves GBF, lo que nos llevó a investigar el estado de inflamación local en el intestino. Se ha informado de que los cambios en la microbiota intestinal afectan negativamente la integridad de la barrera intestinal, lo que lleva a una mayor fuga de endotoxina y ácidos grasos, que pueden actuar sobre la TLR4 para activar la inflamación sistémica (68). La activación de los macrófagos a través de TLR es importante para la inflamación y la defensa del huésped contra los patógenos; sin embargo, estudios recientes sugieren que las moléculas no patógenas son capaces de inducir la inflamación a través de TLR2 y TLR4 (16, 69-71). La capacidad de detectar lesiones tisulares e iniciar mecanismos de reparación adecuados es indispensable para la supervivencia de todas las especies superiores. Un aspecto común de todos los tipos de lesiones, causadas por procesos infecciosos, físicos, químicos o inmunes, es un cambio de composición del entorno celular que conduce a la presencia de nuevos patrones moleculares. Estos patrones son reconocidos por un grupo de receptores llamados receptores de reconocimiento de patrones (PRR) y desencadenan respuestas específicas que promueven la restauración de la función tisular, incluida la inflamación y la cicatrización de heridas (20, 72). El reconocimiento de patógenos es fundamental para sobrevivir en un entorno esencialmente hostil que está lleno de microorganismos potencialmente infectivos. Los sistemas de detección de patrones moleculares característicos de los patógenos (patrones moleculares asociados a patógenos, PAMP) se desarrollan al principio de la evolución y están presentes en la mayoría de las especies, incluidas las plantas y los invertebrados (69). Como grupo de PRR altamente conservados, TLR señala la presencia de varios PAMP a los constituyentes celulares del inmune innato y adaptativo (69, 73), por lo tanto, actuando como guardianes para varios sistemas de respuesta altamente eficientes que regulan la homeostasis tisular y protegen al huésped después de una lesión aguda (60, 74). Tras la lesión, el epitelio intestinal se somete a un proceso de curación de heridas (69). Estudios recientes han revelado la activación de la TLR por la microbiota durante el proceso de curación (20). Además, varias citocinas, como TGF-α, TGF-β, IL-1β e IL-2, también se incrementan durante el proceso de curación (16, 75). En este estudio, los niveles de ARNm de TGF-β e IL-1β en los pollos GBF aumentaron, pero los niveles de ARNm de TLR4, TLR2β, TGF-α, IL-4 e IL-6 no fueron diferentes en comparación con los pollos CON. Estos resultados sugieren que la inflamación que se produjo en las aves GBF en este estudio probablemente no esté mediada por la vía TLR2 o TLR4. Sin embargo, en este estudio no se midieron los niveles de ARNm y proteína de TLR3, TLR4 y TLR3. Por lo tanto, no podemos excluir la posibilidad de que la vía TLR esté involucrada en la inflamación en las aves GBF. IL-1β es un importante mediador de la respuesta inflamatoria y está involucrado en una variedad de actividades celulares, incluida la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis (76). TGF-β, un mediador clave de la homeostasis inmune de la mucosa, media la producción de IgA, retiene linfocitos en el intestino y promueve la cicatrización de heridas del epitelio intestinal y la mucosa (75). TGF-β también promueve la proliferación de IEC a través de la activación de la quinasa extracelular regulada por señal (ERK) 1/ERK2 proteína quinasa activada por mitógeno durante la cicatrización de heridas (20). La IL-8 es secretado basolateralmente por el epitelio intestinal en respuesta a bacterias patógenas o citocinas inflamables específicas, y desencadena la migración de neutrófilos y la inflamación en el intestino (73). El aumento de la AGP sistémica y el TGF-β, IL-8 e IL-1β de la mucosa en las aves GBF indican que el modelo GBF aumentó la inflamación intestinal y activó la respuesta inmune innata intestinal y la curación de heridas.
Las mucinas son grandes glicoproteínas que cubren las superficies epiteliales del intestino y forman una capa de moco para proteger las células epiteliales del desafío de salud intestinal. Hay dos tipos principales de mucinas, unidas a la membrana y secretadas (77, 78). En los pollos (Gallus gallus), se han identificado tres mucinas transmembranas (MUC4, MUC13 y MUC16) y cuatro mucinas formadoras de gel (MUC6, MUC2, MUC5ac y MUC5b) (79). En los mamíferos, la MUC2, la mucina secretada por las células de la copa, es la mucina más abundante en el intestino, y se ha informado que su deficiencia aumenta la translocación bacteriana y la inflamación (18, 80). Los estudios evolutivos sugieren que las mucinas comparten un ancestro común, ya que sus estructuras de dominio están bien conservadas en los metazoanos (71, 81). Todas las mucinas (MUC) contienen al menos un dominio PTS, una región rica en prolina, treonina y serina (18, 82). Se ha informado que el pollo MUC2 es notablemente similar al humano y al ratón fuera del dominio central PTS, pero es muy divergente dentro de esta estructura repetitiva central (82, 83). Aunque las implicaciones fisiológicas y las asociaciones de enfermedades del MUC en varias superficies de la mucosa se entienden bien, todavía hay muchas preguntas sobre cómo y por qué la arquitectura génica de esta familia contribuye a diversas modificaciones de proteínas que muestran diversos efectos biológicos entre los metazoos en la salud y la enfermedad (18, 84–87). La expresión génica MUC2 se ha utilizado como marcador para la salud intestinal en aves de corral y otras especies (85, 88, 89). Por ejemplo, Li et al. encontraron que la suplementación con zinc en las dietas de los criadores mejoró la morfometría, aumentó el número de células de copas por vilo y la expresión génica de MUC2, y redujo los niveles de ARNm m de citocinas proinflamatorias, como IL-6 e IL-1β en el jejunio de su En el presente estudio, la expresión del gen MUC2 se redujo en un 29 % en las aves GBF en comparación con las aves CON, lo que sugiere que el modelo GBF redujo la protección de la capa de moco en el jejunio.
Los chaperones lipídicos intracelulares conocidos como FABP son un grupo de moléculas que coordinan la respuesta lipídica y el metabolismo en las células (90). Los FABP se encuentran en todas las especies, desde Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans hasta ratones y humanos, lo que demuestra una fuerte conservación evolutiva (90). El metabolismo lipídico mediado por FABP está estrechamente vinculado a los procesos metabólicos e inflamatorios mediante la modulación de vías críticas sensibles a los lípidos en las células diana, especialmente los adipocitos y los macrófagos (90, 91). Hasta ahora se han identificado nueve FABP en el intestino, el hígado, el cerebro, el adiposo y el músculo, los órganos que muestran altas tasas de metabolismo lipídico, en los vertebrados (92, 93). El FABP intestinal, FABP2 y FABP6, se expresan a niveles altos en el intestino delgado y el íleon, respectivamente, y además de mediar el metabolismo lipídico, también están involucrados en condiciones inflamatorias intestinales al modular las vías críticas sensibles a los lípidos en los adipocitos y los macrófagos en humanos (94, 95 FABP2 está regulado a la baja en pacientes con lesión de la barrera intestinal inducida por isquemia/reperfusión (93), lo que sugiere el importante papel de FABP2 en la salud de la barrera intestinal. FABP2 se ha identificado como un marcador específico de la cantidad relativa de epitelio en humanos y cerdos (96). Se han identificado varios FABP (FABP1, FABP2, FABP6 y FABP10) que se expresan predominantemente en el tracto digestivo de los pollos (97, 98); sin embargo, queda mucho por determinar con respecto a su expresión y funciones biológicas en las aves de corral. FABP10 desempeña un papel hepático importante en respuesta al FI en el pollo (98). FABP2 está involucrado en la lipogénesis y el transporte de ácidos grasos, y desempeña un papel importante en el contenido de grasa abdominal en los pollos de engorde (98-100). En el presente estudio, el modelo GBF redujo la expresión génica FABP2, lo que sugiere que, al igual que el papel de FABP2 en la salud de la barrera intestinal humana, FABP2 se puede utilizar como un marcador de la función de la barrera intestinal en el pollo. La reducción de la expresión de FABP2 indica la pérdida del contenido de células epiteliales y la aparición de insuficiencia de la barrera intestinal en las aves GBF.
Recientemente se demostró que la proteína de unión a lípidos ileal (ILBP; gen humano FABP6) era necesaria para el transporte eficiente de ácidos biliares desde el lado apical al lado basolateral de los enterocitos en la porción distal del intestino murino (101). Los ácidos biliares son sintetizados por el hígado y liberados en la luz del intestino delgado a través de la bilis, y la mayoría de los ácidos biliares se recuperan en el extremo distal del intestino delgado y luego se devuelven al hígado para su reutilización (102). El ácido biliar ha surgido como importantes moléculas biológicas que emulsionan los lípidos y los nutrientes dietéticos liposolubles para facilitar su digestión y absorción (103, 104). Tiene una fuerte actividad antimicrobiana y, por lo tanto, está emergiendo como un factor huésped que regula la composición de la microbiota en el intestino (105, 106). Se informa que la reducción de los niveles de ácido biliar en el intestino está asociada con el crecimiento excesivo y la inflamación bacterianos (106). La inflamación intestinal en las aves de GBF puede haber dado lugar a niveles más bajos de ácidos biliares, que desafortunadamente no se midieron en este estudio. El aumento sustancial de FABP6 por cuatro veces en las aves GBF indica una alta demanda de ácidos biliares como antimicrobiano para promover la recuperación de la disbacteriosis y el fracaso de la barrera en el intestino de las aves GBF.
En conclusión, el propósito de este estudio no era determinar los efectos individuales de los ingredientes dietéticos o el desafío de los coccidios, sino más bien determinar los biomarcadores potenciales que se pueden utilizar para definir el fracaso de la barrera intestinal en estudios futuros. Intentamos exacerbar la falla de la barrera intestinal con las herramientas disponibles para nosotros, y los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren que la combinación de una dieta alta de NSP y un desafío de los coccidios indujo la insuficiencia de la barrera intestinal y la inflamación en los pollos de enmparas de enmparas, caracterizadas el aumento de endotoxina y A Estos parámetros pueden utilizarse como posibles biomarcadores para la salud de la barrera intestinal en los pollos. Ahora que tenemos una mejor comprensión de qué biomarcadores son relevantes en los modelos de falla de barrera intestinal en pollos, se llevarán a cabo más estudios para evaluar los efectos de los enteropatógenos de pollo, diferentes ingredientes dietéticos o aditivos para piensos, como probióticos y prebióticos, en la función de barrera intestinal en pollos de engorde.
Declaración de conflicto de intereses
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo con el apoyo financiero de Novus International Inc. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo tiene el único propósito de proporcionar información específica y no implica recomendaciones ni respaldo por parte de Novus International Inc.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Terra Wineman, Cindy Atwell y Beaver Wuelling por la asistencia técnica, y al Dr. Karen Wedekind para la lectura crítica del manuscrito. El estudio contó con el apoyo financiero de Novus International Inc.
Abreviaturas
AGP, glicoproteína α1-ácido; AJ, uniones adherentes; BW, peso corporal; BWG, aumento de peso corporal; CON, control; ERK, quinasa extracelular regulada por señal; FABP, proteína de unión a ácidos grasos; FCR, relación de conversión de piensos; FI, ingesta de piensos; GBF, fallo
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Recibido: 19 de marzo de 2015; Aceptado: 08 de mayo de 2015;
Publicado: 26 de mayo de 2015
Editado por:
Michael Kogut, Servicio de Investigación Agrícola del USDA, EE. UU.
Revisado por:
Jason Kindrachuk, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, EE. UU.
Wolfgang Ludwig Köster, Universidad de Saskatchewan, Canadá
Copyright: © 2015 Chen, Tellez, Richards y Escobar.
*Correspondencia: Juxing Chen, Novus International, Inc., 20 Research Park Drive, St. Charles, MO 63304, EE. UU., juxing.chen@novusint.com
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