1. Introducción

La Salmonella enterica es uno de los patógenos transmitidos por los alimentos más importantes. Basado en el método de White-Kauffmann-Le Minor, se han identificado más de 2.650 serotipos distintos de Salmonella por sus combinaciones distintivas de antígenos somáticos (O) y flagelares (H) (1, 2). La infección de Salmonella enterica, como S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis y S. Kentucky, en aves de corral y productos avícolas está en aumento (3, 4). Las aves son el huésped específico de Salmonella enterica serovar Gallinarum biovars Pullorum y Gallinarum. S. Pullorum y S. gallinarum se consideran actualmente biovares de serovar Gallinarum dentro del serogrupo D, que causan la enfermedad de pullorum (EP) y la fiebre tifoidea aviar (FT), respectivamente (5). S. pullorum puede transmitirse verticalmente a las crías recién nacidas y horizontalmente a otras aves y causar una grave carga económica para la industria avícola (6).

Los pollitos de < 3 semanas son más susceptibles a contraer la enfermedad de Pullorum, que es una enfermedad sistémica. La diarrea viscosa blanca y la septicemia aguda son características de la enfermedad de Pullorum, que se asocia con una alta tasa de morbilidad y mortalidad (alcanzando el 100% entre los pollitos jóvenes) (7). Los síntomas de infecciones en aves adultas incluyen desnutrición, reducción de la producción de huevos, diarrea, deformidades del sistema reproductivo y más (8, 9). Los animales que sobreviven pueden convertirse en portadores, pueden no cumplir con los requisitos esperados de producción animal y podrían producir huevos contaminados (10). En aves de corral, S. Gallinarum con mayor frecuencia resulta en fiebre tifoidea aviar, que puede manifestarse como septicemia crónica o aguda en aves jóvenes y adultas (11). Las enfermedades siguen siendo una carga económica significativa para el negocio avícola en varias naciones de América del Sur, América Central, Asia y África (12).

Los subtipos de Salmonella por debajo de la clasificación de subespecies se han determinado tradicionalmente utilizando el serotipado, que puede ayudar a identificar los orígenes de los aislados de Salmonella, determinar la gravedad de la enfermedad y evaluar si son o no resistentes a los antibióticos (13). Por lo tanto, la determinación de los serotipos de Salmonella sigue siendo una necesidad diagnóstica crucial en la promoción de la salud (14). Sin embargo, el serotipado tradicional de Salmonella es un método laborioso que implica varios antisueros de tipificación diferentes, además de tomar entre 5 y 6 días para terminar el experimento general (15). Por otra parte, los biovars S. Pullorum y S. Gallinarum son antigénicamente similares, por lo que es difícil distinguir entre ellos después del aislamiento de serovar Gallinarum. A pesar de esta similitud, cada uno produce enfermedades con distintas presentaciones clínicas y patrones de transmisión, y por lo tanto, es crucial distinguir entre los dos biovares. Los ensayos bioquímicos se realizaron en un estudio previo para distinguir entre las dos cepas de bacterias mediante la observación de cómo fermentaban ornitina, espironolactona, dulcitol y maltosa (16). Esto se puede lograr bioquímicamente, pero tomará entre 2 y 3 días (17). Por lo tanto, existe una necesidad inmediata de una técnica de diagnóstico que sea rápida y económica para reconocer y distinguir entre S. Gallinarum y S. Pullorum, ya que la identificación temprana del patógeno ayuda a dirigir la prevención y el control de patógenos (18).

La gran especificidad y sensibilidad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha demostrado un potencial considerable en la detección de muchas infecciones debido al avance de los métodos biológicos moleculares. En particular, incluso cepas y variantes de bacterias altamente relacionadas se han identificado y diferenciado con éxito mediante PCR (19). La efectividad de varias pruebas de PCR para distinguir varios serovariedades de Salmonella se ha estudiado en investigaciones separadas, que demostraron la notable sensibilidad y especificidad del ensayo de PCR (20, 21).

En el presente estudio, desarrollamos y validamos un ensayo preciso de PCR multiplex para detectar y diferenciar simultáneamente biovars S. Gallinarum y S. Pullorum. La PCR multiplex se basó en tres genes específicos de torT, I137_14430 y stn. La especificidad y la sensibilidad del ensayo de PCR múltiple se evaluaron para este ensayo. Este método recientemente desarrollado se aplicó para identificar los dos biovares S. Gallinarum y S. Pullorum en muestras clínicas de una granja de pollos.

2. Materiales y métodos

2.1. Cepas bacterianas

Los ensayos se realizaron con cepas puras caracterizadas serológicamente para estudios adicionales. La Tabla Suplementaria S1 enumera los patógenos de Salmonella y no Salmonella utilizados para desarrollar y validar la técnica de PCR múltiple. Un total de 75 aislados de Salmonella, incluidos 29 serovares diferentes y 50 patógenos no relacionados con Salmonella, se obtuvieron en el trabajo de laboratorio de rutina y se utilizaron en el presente estudio. Se utilizaron antisueros de diagnóstico de aglutinación rápida (Tianrun Bio-Pharmaceutical, Ningbo, China) para serotipar todas las cepas identificadas de Salmonella. Los biovars Gallinarum y Pullorum se distinguieron entre sí con la ayuda de la fermentación de dulcitol y la ornitina descarboxilante.

2.2. Crecimiento bacteriano y extracción de ADN genómico

Las existencias congeladas de los aislados se recuperaron en agar Luria-Bertani (LB) (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) o agar de infusión cerebral y corazón (BHI) (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, Estados Unidos) durante 18 h a 37 °C para la purificación del ADN. Las colonias se inocularon en caldo LB o BHI y se incubaron durante la noche a 37 ° C con agitación continua a 180 rpm.

Siguiendo el protocolo descrito por el fabricante de un kit de extracción de ADN (Tiangen, Beijing, China), se aisló ADN genómico de las bacterias cultivadas. Posteriormente, el ADN se resuspendió con 100 μL de agua estéril destilada doble. Se utilizó un NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE) para analizar el nivel y la pureza del ADN genómico extraído. El ADN extraído se almacenó a -20 ° C en preparación para las pruebas de PCR.

2.3. Análisis in silico y diseño específico de imprimación

Se examinó la especificidad de dos genes candidatos, torT y I137_14430, para establecer un enfoque fácil de usar, rápido y reproducible para identificar y distinguir S. Gallinarum y S. Pullorum. Los genes torT (GenBank acc. no. AM933173.1, región 3797861-3798901) y I137_14430 (GenBank acc. no. CP006575.1, región 3085007-3085765) se identificaron mediante el cribado de la base de datos para la recolección de nucleótidos no redundantes (nr/nt) utilizando la herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST). Todas las demás configuraciones se dejaron en sus valores predeterminados, excepto el límite superior de cuántas secuencias alineadas se mostrarán, que se estableció en el máximo de 5,000. Alineaciones de secuencia de I137_14430 y torT de S. Gallinarum, S. Pullorum y otros serovares fueron realizados por Clustal W. La búsqueda BLAST se realizó utilizando S. Secuencias de nucleótidos Pullorum torT, I137_14430 y stn contra las secuencias torT o genómicas de la cepa FDAARGOS_549 Citrobacter freundii (acceso GenBank no. NZ_CP033744.1).

Se diseñaron tres juegos de cebadores de torT, I137_14430 y stn. Las posiciones de los cebadores se basaron en la región deficiente de torT, la secuencia única de I137_14430 y la secuencia conservada de stn para el género Salmonella. El primer conjunto de cebadores, troT-F/R, fue diseñado para amplificar un fragmento de 801 pb para permitir la identificación específica de S. Pullorum. El segundo juego de cebadores, I137_14430-F/R, fue diseñado para distinguir S. Gallinarum de otras cepas, mientras que el tercer conjunto de cebadores, stn-F/R, se utilizó como gen de referencia para identificar el género Salmonella (Tabla 1). La especificidad de los cebadores se evaluó mediante el uso de BLAST y los cebadores fueron sintetizados comercialmente por GenScript (Nanjing, China).

2.4. Optimización y desarrollo del ensayo de PCR multiplex

Las pruebas de PCR se realizaron en una solución de reacción de 25 μL compuesta de 12,5 μL de 2 × mezcla Taq Master (Vazyme, Nanjing, China), concentraciones de cebador que incluían 80 nM stn, 40 nM torT y 40 nM I137_14430, ADN genómico de bacterias (100 ng) y agua altamente purificada hasta que la cantidad total alcanzó los 25 μL. La amplificación por PCR se realizó en un termociclador T100 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) con una desnaturalización inicial de 94 °C durante 3 min, 25 ciclos de 94 °C durante 45 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 60 s, seguida de una extensión final a 72 °C durante 10 min. Después de la electroforesis, los productos de PCR se examinaron en un gel de agarosa al 1% antes de la tinción con tinción de gel de ácido nucleico GelRed (Biotium, Fremont, CA, EUA), y la posterior visualización bajo luz UV utilizando un sistema de documentación de gel GelDoc XR (Bio-Rad).

2.5. Especificidad del ensayo de PCR multiplex

Se tomó ADN genómico de 75 cepas de Salmonella que representan 29 serovariedades distintas y 50 patógenos no Salmonella presentados en la Tabla Suplementaria S1, con el fin de probar la especificidad y la compatibilidad de las secuencias de cebadores en la PCR múltiple establecida. Especificidad de la PCR multiplex de un solo paso para la detección y diferenciación de S. Pullorum y S. Gallinarum fue validado en otro laboratorio. Se seleccionaron dos cepas al azar para cada serotipo de Salmonella y patógenos no relacionados con Salmonella.

2.6. Sensibilidad del ensayo de PCR

Para determinar el límite de detección en la prueba PCR, se evaluó su sensibilidad. S. Pullorum cepa S06004 y S. La cepa SG9 de Gallinarum se cultivó durante la noche en el medio LB y el ADN se extrajo con un kit de extracción de ADN genómico bacteriano. El ADN genómico se diluyó consecutivamente de 27,5 ng/μL a 2,75 pg/μL en agua estéril y sirvió como plantilla para la PCR múltiple. Se utilizaron dos lavados con PBS para enjuagar el cultivo bacteriano de S. Gallinarum y S. Pullorum, ajustado para que coincida con los niveles de concentración finales de 2 × 10⁷ a 2 × 10³ CFU / ml y ADN de genomas bacterianos se extrajeron hirviendo durante 10 minutos en un baño de agua. Finalmente, 5 μL de cada concentración recuperada a través de la centrifugación se utilizaron para esta prueba de PCR para determinar el número más bajo de S. Pullorum y S. Células de Gallinarum.

2.7. Aplicación de la prueba PCR multiplex en muestras de huevo de gallina

Las cepas clínicas de Salmonella se aislaron de huevos muertos obtenidos de una granja avícola en Jiangsu, China. La salmonela se aisló de muestras siguiendo procedimientos previamente establecidos para el procesamiento, enriquecimiento y aislamiento de muestras (22, 23). Brevemente, todas las muestras se sometieron a un preenriquecimiento en 50 ml de agua de peptona tamponada (Difco, BD, Sparks, MD, Estados Unidos) durante 24 h a 37°C. Después de ser rayado sobre el agar xilosa lisina tergitol 4 (Difco, BD), el cultivo bacteriano se sometió a incubación durante 16 h a 37°C. El enfoque de PCR múltiple establecido se empleó para detectar el ADN de las colonias putativas de Salmonella. Además, cada muestra también se sometió a los procedimientos estándar de cultivo bacteriano, así como a la prueba tradicional de aglutinación sérica.

3. Resultados y discusión

3.1. Evaluación de la alineación de secuencias y desarrollo de cebadores

Los pavos, pollos y algunos otros tipos de aves son susceptibles a dos cepas diferentes de Salmonella, llamadas Gallinarum y Pullorum, que causan la fiebre tifoidea de las aves y la enfermedad de Pullorum (8). Desde S. Pullorum y S. Gallinarum son ambos miembros del mismo serovar, pero pertenecen a biovares separados, las características bioquímicas son la base principal para identificar y distinguir entre ellos. Aunque la identificación bioquímica es el método más común, analizar un gran número de muestras rápidamente puede ser difícil, costoso y lento. En consecuencia, se requerían enfoques basados en el ADN, en particular métodos basados en PCR, para distinguir entre los dos biovares estrechamente relacionados. El cribado molecular con el uso de PCR es el método más eficiente en el tiempo, ya que tiene un alto grado de especificidad y sensibilidad y podría aplicarse para la detección y caracterización rápidas de tipos particulares de infección microbiana patógena (24, 25).

La selección del objetivo es uno de los aspectos más cruciales involucrados en el desarrollo de este tipo de ensayo de detección. Con base en el análisis bioinformático, encontramos que una región de deleción de 126 pb en el carboxilo-terminal de torT se observó solo en S. Pullorum y no en otros serovares de Salmonella incluyendo S. Gallinarum, que puede emplearse para identificar con precisión S. Pullorum (Figura 1A; Figura suplementaria S1). El gen I137_14430, que se encuentra en todos los serovares de Salmonella además de S. Gallinarum, podría utilizarse para identificar este biovar (Figura 1B; Figura suplementaria S2). La similitud y la existencia de los tres objetivos también se examinaron en C. freundii. Los resultados muestran que la longitud de S. El gen Pullorum torT es 923 pb. Sin embargo, la longitud del gen torT de C. freundii es de 1.032 pb. Además, no se encontró similitud significativa en las secuencias torT entre las dos especies (Figura Suplementaria S3A). I137_14430 y stn genes de S. Pullorum se alinearon con el genoma de C. freundii, y no se encontró similitud significativa en el genoma de C. freundii tanto para la secuencia I137_14430 (Figura Suplementaria S3B) como para la secuencia stn (Figura Suplementaria S3C). Además, el gen stn se emplea ampliamente como el control de referencia del género Salmonella (26-28). Por lo tanto, en base a las características de la secuencia, se diseñaron tres conjuntos de cebadores de torT, I137_14430 y stn. Los tres pares de cebadores amplificaron tres productos específicos para torT (801 pb), I137_14430 (508 pb) y stn (252 pb) (Tabla 1).

También se han publicado nuevas pruebas basadas en genes para identificar Salmonella. Por ejemplo, al examinar los datos de secuenciación del genoma completo de S. Los serotipos Pullorum, Xu et al. (29) diseñaron efectivamente la prueba PCR para el reconocimiento de S. Pullorum se basa en el nuevo gen ipaJ de S. Pullorum. Sin embargo, no pudo diferenciar los dos biovares de S. Gallinarum y S. Pullorum. En particular, nuestra investigación identificó y diferenció con éxito S. Pullorum y S. Gallinarum por primera vez dirigiéndose a los nuevos genes de torT y I137_14430.

3.2. Especificidad de la prueba de PCR multiplex para distinguir S. Gallinarum y S. Biovares de Pullorum

Es necesario identificar y serotipar la salmonela para ofrecer detalles adicionales que puedan utilizarse para determinar las fuentes de infección durante las investigaciones de brotes y para la identificación de cepas (30). Sin embargo, los hallazgos de la mayoría de las técnicas de genotipado, como el análisis del perfil plásmido, la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), el ribotipado y el polimorfismo amplificado de longitud de fragmento (AFLP), no muestran una correlación entre el genotipo y el serotipo del serogrupo Salmonella (31).

Para evaluar la especificidad de los tres conjuntos de cebadores, primero se optimizó la PCR multiplex y luego se probó con plantillas de ADN preparadas a partir de los 50 patógenos no relacionados con Salmonella y 75 patógenos de Salmonella que figuran en la Tabla Suplementaria S1. Los resultados mostraron que solo dos productos específicos de 508 pb I137_14430 y 252 pb stn fueron amplificados para S. Pullorum. Sólo se generaron dos productos de 801-bp torT y 252-bp stn para S. Gallinarum. Los tres productos de torT, I137_14430 y stn se amplificaron para otros serovares de Salmonella. Sin embargo, no se generó una sola banda para ninguno de los patógenos que no fueran Salmonella (Figura 2). Las tres dianas específicas no pudieron ser amplificadas en cuatro cepas de C. freundii conservadas en nuestro laboratorio utilizando los cebadores diseñados en este estudio (Figura 3), lo que fue consistente con los del análisis bioinformático. Se realizó la validación cruzada de las pruebas entre laboratorios para verificar la precisión del ensayo de PCR múltiple. Se seleccionaron dos cepas al azar para cada serotipo de Salmonella y patógenos no Salmonella (incluyendo Citrobacter spp.). Los resultados fueron consistentes con los de nuestro laboratorio, y este método de PCR múltiple pudo identificar y distinguir con precisión S. Gallinarum y S. Pullorum (Figura suplementaria S4), mostrando que este método tiene buena reproducibilidad. Además, no se crearon falsos positivos o negativos en el método de PCR establecido utilizando los tres pares de cebadores específicos. Mientras tanto, la PCR múltiplex no indicó ninguna reacción cruzada con una especificidad del 100%, en línea con los resultados de BLAST. Esta prueba PCR tuvo una excelente especificidad y pudo identificar y diferenciar efectivamente entre S. Pullorum y S. Gallinarum.

Tradicionalmente, S. Pullorum se distinguió de S. Gallinarum utiliza enfoques como el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción de PCR (RFLP) y el polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP) que emplean secciones cambiables de un gen o un polimorfismo de nucleótido único (SNP) (32, 33). Esta investigación, sin embargo, utilizó los genes torT y I137_14430 para decir definitivamente S. Pullorum y S. Gallinarum aparte. Además, como los cebadores del gen torT son específicos para S. Pullorum, y los cebadores de I137_14430 son específicos para S. Gallinarum, sería posible distinguir los dos biovares utilizando los dos objetivos específicos de forma independiente. Es posible un ahorro significativo de tiempo y mano de obra, ya que la PCR múltiple establecida puede amplificar secuencias específicas de ADN y distinguir entre los dos biovares de Salmonella simultáneamente.

3.3. Sensibilidad del ensayo de PCR multiplex para la identificación de los biovares Pullorum y Gallinarum

Se utilizaron dos tipos distintos de plantillas para determinar la sensibilidad de la PCR múltiple. El límite de detección de la técnica de PCR se evaluó diluyendo en serie S. Gallinarum y S. ADN genómico de Pullorum de 27,5 ng/μL a 2,75 pg/μL. Se determinó mediante pruebas de sensibilidad que se necesitaba un mínimo de 27,5 pg/μL de ADN genómico para la identificación de S. Pullorum y S. Gallinarum después de la detección por PCR multiplex (Figura 4A). La sensibilidad de la PCR múltiple desarrollada es mayor que la de la prueba HRM-PCR, que tiene una sensibilidad de 126,2 pg/μL (34).

Además, una dilución en serie diez veces mayor de S. Pullorum y S. Células de Gallinarum que variaron de 10⁵ UFC a 10¹ Se utilizó UFC para determinar el límite detectable de células bacterianas. Los resultados de tres conjuntos de cebadores confirmaron que 100 UFC era la concentración más baja en la que S. Gallinarum y S. Pullorum pudo ser detectado (Figura 4B). Estos resultados de PCR mostraron un umbral más bajo para el reconocimiento de células bacterianas que los de la PCR basada en el gen sefA (400 UFC) (35), comparable a la PCR multiplex centrada en los genes flhB, lygD y tcpS (100 UFC) (36), y la PCR basada en el gen ipaJ (100 UFC) (29). Estos hallazgos confirmaron que la técnica de PCR tenía un límite superior de detección, permitiendo la identificación de S. Pullorum y S. Células de Gallinarum en cantidades muy bajas. Además, este ensayo de PCR también fue muy rápido, con un procedimiento de PCR de una sola ronda que duró < 2 h.

3.4. Aplicación de la PCR multiplex en la identificación y distinción entre biovars Pullorum y Gallinarum

Tanto la EP (que es causada por S. Pullorum) y FT (que es causada por S. Gallinarum) tienden a causar graves pérdidas económicas de ganado (37). S. Pullorum y S. Gallinarum son dos de las infecciones bacterianas más importantes que afectan al pollo en China (38). La identificación precisa y la posterior eliminación de las aves enfermas son esenciales para la prevención y el éxito en la eliminación de S. Gallinarum y S. Pullorum en aves de corral.

Para evaluar el rendimiento diagnóstico en términos de la precisión de nuestro enfoque de PCR multiplex, se utilizaron muestras clínicas adicionales obtenidas de muestras de huevo de gallina contaminadas naturalmente. Los hallazgos de la PCR demostraron que diez de las veinticuatro muestras solo incluían el objetivo único de 508 pb de I137_14430 y el objetivo de 252 pb de stn, lo que implicaba que los aislados de Ch4, Ch5, Ch9, Ch10, Ch11, Ch12, Ch16, Ch17, Ch18 y Ch24 eran S. Pullorum. Tanto el único torT de 801 pb como el stn de 252 pb fueron generados por dos aislados diferentes, lo que confirma que los dos aislados de Ch22 y Ch23 eran S. Gallinarum. Los resultados del experimento de PCR fueron consistentes con los hallazgos obtenidos utilizando reacciones bioquímicas tradicionales y técnicas de serotipado (Tabla 2).

Las técnicas microbiológicas clásicas han demostrado ser menos eficientes y menos sensibles que las pruebas basadas en PCR para identificar serovariedades de Salmonella (5). Las técnicas moleculares, como la PCR acompañada de RFLP basada en los genes speC o fliC, se han utilizado para distinguir entre S. Gallinarum y S. Pullorum para identificar estas infecciones (10, 32). Otros métodos, como una PCR dúplex y una PCR multiplex en tiempo real, han sido diseñados para distinguir entre S. Pullorum y S. Gallinarum (2, 39). Sin embargo, estos métodos eran caros y requerían equipo especial. La PCR multiplex establecida en este estudio es un ajuste perfecto para esta necesidad, y ofrece asistencia tecnológica para eliminar el serovar Gallinarum en granjas avícolas comerciales.

Estos hallazgos validaron los genes torT, I137_14430 y stn como candidatos prometedores para S. Gallinarum y S. Identificación y diferenciación de Pullorum. El serotipado de Salmonella utilizando el método serológico tradicional requiere mucho tiempo, requiere mucha mano de obra y es costoso. La tecnología desarrollada en este estudio, que se basa en la PCR múltiple, permite distinguir S. Gallinarum de S. Pullorum de forma rápida y precisa. Como las aves de corral también pueden infectarse con S. Enteritidis, S. Typhimurium, y otros serovares, la PCR multiplex puede ser capaz de diferenciar entre S. Biovares de Gallinarum y otros serovares de Salmonella. Esta prueba podría permitir el diagnóstico temprano de infecciones, lo que permite un manejo más eficiente de la enfermedad en las aves de corral, así como la detección temprana de infecciones.

4. Conclusión

En resumen, este estudio desarrolló por primera vez un nuevo método de PCR múltiple basado en tres genes específicos de torT, I137_14430 y stn. La PCR múltiplex podría detectar y diferenciar simultáneamente la S prevalente. Pullorum y S. Gallinarum, que exhibió una capacidad eficiente de identificación y discriminación en bacterias cultivadas y muestras clínicas de huevos de gallina. La PCR múltiple desarrollada representa un procedimiento económico y de un solo paso para la detección rápida, específica y sensible de ambas S. Pullorum y S. Gallinarum. Puede contribuir a medidas de control más oportunas y eficientes tanto en DP como en FT.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres del repositorio / repositorios y el número (s) de acceso se pueden encontrar en el artículo / material complementario.

Contribuciones del autor

LS, XJ y ZP concibieron el estudio y escribieron el artículo. LS diseñó los experimentos, realizó los ensayos y analizó los resultados. LS, RT y DX realizaron los experimentos y analizaron los resultados. Todos los autores han contribuido al manuscrito, leído y aprobado el manuscrito final.

Financiación

Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Números de subvención 32102679, 31972685 y 31920103015), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (Número de subvención 2020M681741), el Proyecto 111 (D18007) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (Número de Subvención PAPD).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

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Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2023.1220118/full#supplementary-material

Referencias