Introducción

La paratuberculosis es una enfermedad crónica y debilitante de los rumiantes causada por Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis (Mapa) (1) y responsable de pérdidas económicas mundiales significativas estimadas en aproximadamente 12,61 millones de dólares estadounidenses y 364,31 millones de dólares en el ganado lechero español y de la Unión Europea, respectivamente (2, 3). Map es una bacteria ubicua transmitida entre el ganado a una edad temprana a través de la vía fecal-oral, aunque las manifestaciones clínicas pueden aparecer varios años después de la infección (4). La respuesta inmune protectora inicial contra Map se ha relacionado con una fuerte respuesta inmune mediada por células caracterizada por la liberación de la citocina proinflamatoria interferón γ (IFN-γ), la formación de granulomas y la eliminación de las micobacterias (5, 6). En este sentido, los animales infectados por Map pueden mostrar una variedad de lesiones que han demostrado estar estrechamente relacionadas con las diferentes fases de la enfermedad. Las lesiones de paratuberculosis temprana se caracterizan por granulomas pequeños y bien demarcados, llamados formas focales o multifocales, ubicados dentro del tejido linfoide intestinal que también se puede ver en animales adultos, donde se consideran formas de latencia o resistencia; la interrupción de la respuesta inmune mediada por células protectoras conduce al desarrollo de lesiones difusas y a la Los métodos patológicos para la caracterización de la lesión de la paratuberculosis se han aplicado con éxito en trabajos anteriores como un indicador fiable de la presencia de infección en el mapa y la forma de la enfermedad mostrada por los animales infectados (9-11).

El largo período de incubación y la capacidad de Map para persistir en los programas de control de obstaculizan el medio ambiente basados en medidas de manejo de la higiene o el diagnóstico temprano y el sacrificio de animales positivos (12, 13). Por esta razón, la vacunación con vacunas con calor muertas disponibles en el mercado se ha considerado como la medida más rentable para el control de la paratuberculosis, ya que su uso reduce la incidencia de la enfermedad dentro del reno (14, 15). La vacunación conduce a una reducción tanto de la colonización de los tejidos intestinales como del número de animales clínicamente afectados, logrando una disminución de aproximadamente el 90 % en la incidencia de animales que se desvasen de mapas (16-18).

Sin embargo, los mecanismos que podrían estar involucrados en la protección asociada con la vacunación aún no se entienden completamente (12, 13). La protección conferida por las vacunas contra la infección de Map se ha correlacionado con una respuesta inmune mediada por células temprana y fuerte (19-21), a pesar del hecho de que hay un bajo porcentaje de fracaso de vacunación, donde algunos animales vacunados podrían permanecer altamente infecciosos y desarrollar lesiones graves (16, 22, 23).

La mayoría de las vacunas paratuberculosis causadas por el calor se basan en la cepa Map 316F, que ha demostrado una virulencia reducida (carga bacteriana del tejido) durante la infección experimental de terneros con este aislado vivo, probablemente debido a pasajes continuos in vitro (24). En este sentido, la inmunización subcutánea de ovejas con la cepa Map 316F muerta por calor por sí sola no mostró una respuesta inmune mediada por células y humoral significativa (25). La suplementación con adyuvantes de aceite mineral es un principio central para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos y su liberación continua con el fin de promover una respuesta inmune robusta a través de la montura de una fuerte inflamación local en el lugar de la inyección (26). En un experimento anterior, se encontraron variaciones significativas en la respuesta inmune cuando las vacunas contra la paratuberculosis hechas con diferentes adyuvantes se administraron por vía subcutánea a ovejas (25). Por otro lado, se ha demostrado que la única administración de adyuvantes provoca una respuesta inmune inespecífica cuyo efecto protector no se ha evaluado en detalle (27-29). En el caso de las vacunas contra la paratuberculosis, el efecto que cada componente podría tener en una respuesta protectora contra la infección de Map no se ha dilucidado completamente.

Además, Map comparte un alto número de antígenos comunes con micobacterias relacionadas como Mycobacterium bovis (Mbv) o Mycobacterium caprae, responsable de la tuberculosis en rumiantes, un hecho que va más allá de las reacciones cruzadas que aparecen cuando se utilizan pruebas inmunológicas para el diagnóstico de tuberculosis en animales infectados o vacunados por paratuberculosis (30, Esto también podría asociarse con la reducción significativa de las lesiones relacionadas con la tuberculosis lograda después de la vacunación contra la paratuberculosis en cabras y terneros (32,33). A pesar de este hecho, aún se desconoce el efecto de la inmunización con micobacterias relacionadas con la tuberculosis en el desarrollo de la paratuberculosis.

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue analizar el efecto de la vacunación homóloga o heteróloga de las cabras, y un desafío posterior con Map, en la respuesta inmune y la protección y evaluar si los diferentes componentes de estas vacunas (bacterias inactivadas o adyuvantes) podrían participar en la respuesta del huésped vacunado contra Map.

Materiales y métodos

Declaración ética

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las leyes europeas (86/609) y españolas (R.D. 223/1988, R.D. 1021/2005, R.D. 53/2013) y aprobado por el gobierno local tras el informe y las sugerencias del Subcomité de Experimentos con Animales y Bienestar de la Universidad de León (ULE) (OEBA-ULE-016-2017).

Vacunas, productos de inmunización e inoculo de desafío

La vacuna comercial contra la paratuberculosis Silirum® y sus componentes (el adyuvante Montanide™ y la cepa Map 316F incluidos en la vacuna) fueron preparados por separado y enviados por el fabricante, CZ Vaccines (Porriño, España), mientras que la vacuna Mbv inactivada por calor (HIMB ) y sus componentes (un adyuvante Montanide™ y la cepa de 1403 Mbv) fueron preparados por NEIKER como se describió anteriormente (34). Brevemente, cada dosis de la vacuna HIMB (1 ml) consistió en una suspensión acuosa de 107 unidades formadoras de colonias (UFC) inactivadas por calor de la cepa de NEIKER Mbv 1403 (84–85 °C durante 45 min) emulsionadas en Montanide™ ISA 50 V 2 adyuvante (Seppic, Francia). Además, cada bacteria inactivada y los productos de inmunización adyuvantes se ajustaron a la misma dosis administrada en las vacunas Silirum® y HIMB. Por lo tanto, cada dosis (1 mL) de bacterias inactivadas (109 UFC de las cepas Map 316F y 107 UFC de las cepas Mbv 1403) se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS), mientras que cada dosis del adyuvante Montanide™ (1 mL) (usado en vacunas Silirum® y HIMB) se emulsificó en PBS.

Además, la cepa bovina Map 764 se preparó para el desafío como lo describieron anteriormente Fernández et al. (11). Brevemente, la cepa Map 764 se cultivó en caldo Middlebrook 7H9 enriquecido con un 10% de ácido oleico-albúmina-dextrosa-catalasa (OADC) y 2 mg · L−¹ Mycobactin J (7H9 OADC MJ) durante 3 semanas a 37 ± 1°C. Luego, los cultivos se cosecharon por centrifugación a 3.000 g durante 10 minutos, y los gránulos bacterianos se lavaron dos veces y se resuspendieron en PBS. Con el fin de interrumpir los grumos bacterianos, la suspensión resultante se pasó hacia arriba y hacia abajo a través de una aguja de calibre 27 varias veces y se vorzó. La concentración bacteriana se estimó por la densidad óptica (O.D.) y la estimación de la UFC de diluciones en serie 10 veces plateadas en 7H9 OADC MJ solidificado con agar. Finalmente, las suspensiones se ajustaron a 1,2 × 1010 UFC · mL−¹ y se mantuvieron a 4°C durante todo el período de desafío (2 semanas), y los grupos bacterianos se interrumpieron de nuevo antes de la inoculación oral, como se mencionó anteriormente.

Diseño experimental

En este estudio se utilizaron un total de 50 hembras de cabras de raza Murciano-Granadina de 1 mes de edad. Los animales fueron seleccionados de una bandada sin signos clínicos y dieron negativo para paratuberculosis y tuberculosis en los últimos 10 años. Además, no se identificaron reactores positivos en las campañas anuales oficiales de erradicación de la tuberculosis, basadas en una prueba cutánea intradéránea, realizada por las autoridades regionales de salud animal durante los últimos 5 años. El estado libre de paratuberculosis y tuberculosis de los animales de experimentación se confirmó utilizando el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) contra Map (ID Screen^® Paratuberculosis indirect, IDVet, Gabrels, Francia) y Mbv (INgezim Tuberculosis DR, Eurofins Technology, Madrid, España) y la prueba de liberación de Después de un período de adaptación de 15 días en las instalaciones del Instituto de Ganadería de Montaña (IGM-ULE) en León (España), los niños cabras fueron asignados al azar en corrales separados, sometidos a prácticas de gestión estándar, y su estado de salud y bienestar se comprobó diariamente.

Al comienzo del estudio, y de acuerdo con el protocolo de vacunación y/o infección que se debe seguir, las cabras se clasificaron en 10 grupos (n = 5) y se distribuyeron en diferentes corrales para evitar el contacto directo entre los grupos de acuerdo con el siguiente esquema (Figura 1):

VS: Silirum^® vacunado y no infectado

VSI: Silirum^® vacunado e infectado

VH: HIMB vacunado y no infectado

VHI: HIMB vacunado e infectado

StrSI: inmunizado con la cepa Map 316F Silirum^® e infectado

StrHI: inmunizado con la cepa Mbv 1403 HIMB e infectado

AdjSI: inmunizado con adyuvante MontanideTM Silirum^® e infectado

AdjHI: inmunizado con el adyuvante de la vacuna MontanideTM HIMB e infectado

NV: no vacunado y no infectado

NVI: no vacunados e infectados

No se incluyeron animales no infectados en grupos inmunizados con bacterias inactivadas o adyuvantes, debido al hecho de que el estudio se centró en la evaluación del efecto de los componentes de las vacunas en la protección, después de la infección de Map, y esto implicaría la inclusión de un gran número de animales y grupos que obstaculizarían el estudio.

La vacunación se realizó al comienzo del experimento, el día 0, mediante una inyección subcutánea en el pecho con 1 ml de vacuna Silirum^®, 109 UFC de la cepa de la vacuna Silirum^® Map 316F, 1 ml de adyuvante MontanideTM Silirum^® (CZ Vaccines, Porriño, España), 1 ml de vacuna HIM

Cuarenta y cinco días después de la vacunación (dpv), los animales fueron desafiados por vía oral (Figura 1) utilizando una jeringa automática con una cantidad total de 1,2 × 1010 Mapa 764-UFC diluidos en 40 ml de PBS como se describió previamente por Fernández et al. (11), mientras que 40 ml de PBS se administraron por vía oral a animales A lo largo del ensayo experimental, todas las cabras fueron monitoreadas diariamente para detectar signos clínicos y muestreadas cada 30 días hasta el sacrificio (Figura 1). A 190 dpv, se realizaron necropsias completas y muestreo post mortem en todas las cabras después de ser sacrificadas humanamente por sedación profunda con xilazina (XILAGESIC^®, Laboratorios Calier, Barcelona, España) y una posterior inyección intravenosa de T61^® (MSD Animal Health, Salamanca, España) seguida de exsanguinación (Figura 1).

Colección de muestras

Las muestras de sangre se recogieron mensualmente de la vena yugular en tubos de Vacutainer con heparina de litio (Becton Dickinson and Company, Reino Unido) y sin anticoagulante (Becton Dickinson and Company, Reino Unido). Luego, las muestras heparinizadas se procesaron inmediatamente para la prueba de liberación de IFN-γ en respuesta al derivado proteico de los antígenos aviar (PPDa) y bovinos (PPDb) a 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv (Figura 1). En los mismos puntos, también se recogió sangre heparinizada para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (35) y su posterior caracterización por citometría de flujo. Además, se procesaron muestras no heparinizadas para las pruebas de determinación de anticuerpos de Map (ID Screen^® Paratuberculosis indirect, IDVet, Gabrels, Francia) y específicas de Mbv (INgezim Tuberculosis DR, Eurofins Technology, Madrid, España) a 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv (Figura 1).

Las muestras fecales de cada cabra se recogieron por separado en guantes de plástico desechables directamente desde el recto a 190 dpv, antes de la eutanasia del animal, y se congelaron a -20 °C hasta el procesamiento para la detección del mapa a través de un cultivo bacteriológico.

Los animales fueron sacrificados en el día 190 dpv y se realizó una necropsia regulada, ordenada y completa. Después del examen bruto de las vísceras, las muestras del íleon (zonas proximal, media y distal), el yeyuno (zonas proximal, media y distal), la válvula ileocecal y los parches de Peyer jejunal (al menos tres parches de cada zona: proximal, medio y distal), junto con los ganglios linfáticos mes Además, también se recogieron y almacenaron muestras de íleon distal, parches de Peyer y nódulos linfáticos mesenterice a -20 °C para el aislamiento del mapa por cultivo y la detección por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR), así como procesadas inmediatamente para el aislamiento de leucocitos con el fin de

Aislamiento de PBMC y leucocitos tisulares

Los PBMC se aislaron como se describió anteriormente (35). En resumen, se centrifugaron 30 ml de sangre periférica heparinizada, y los PBMC se aislaron mediante centrifugación de gradiente utilizando LymphoprepTM (STEMCELL Technologies^®, Colonia, Alemania). Los PBMC resultantes se lavaron tres veces con PBS, y las suspensiones celulares se resuspendieron en medio RPMI1640 suplementado + GlutaMaxTM (Gibco, Paisley, Reino Unido) y se contaron en una cámara Neubauer y se ajustaron a una concentración final de 106 células · mL−1. Las muestras intestinales y los ganglios linfáticos mesentéricos se recogieron y lavaron en PBS durante la necropsia, se colocaron en tubos de halcón individuales que contenían 30 ml de medio RPMI1640 suplementado estéril y se procesaron en el laboratorio dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Para el aislamiento de linfocitos tisulares, 5 cm de parches de jequeo y jejunal Peyer se abrieron longitudinalmente mostrando la mucosa y se lavaron con PBS hasta que se eliminaron los restos fecales, mientras que se eliminó la grasa pericapsular de los ganglios linfáticos. Se eliminó el exceso de tejido alrededor de cada parche de Peyer, y se raspó y picó la mucosa del íleon y los parches de Peyer. Además, 50 mg de tejido de ganglios linfáticos mesentéricos se cortaron en trozos pequeños y se cortaron con una hoja de bisturí. El tejido picado se suspendió en 11 ml de PBS con EDTA (2 mM) y se procesó con una licuadora de estómago (Masticator, IUL) durante 2,5 minutos. Luego, se pasaron 10 ml de la porción superior homogeneizada superior a través de un filtro de 40 μm (Thermo Fisher Scientific, Madrid, España), y la suspensión resultante se superpuso en un volumen igual de LymphoprepTM y se centrifugó a 800 g durante 30 minutos sin parada ni aceleración. Las células de la capa de interfaz se lavaron tres veces con PBS/EDTA, se contaron en una cámara Neubauer y se resususpendaron en RPMI1640 suplementado a una concentración final de 106 células · mL-1.

La viabilidad celular determinada por la exclusión del tinte azul de tripapano fue generalmente >90% tanto para los PBMC como para los linfocitos tisulares (datos no se muestran).

Respuesta inmune humoral periférica y local mediada por células y periféricas

Las muestras de sangre periférica heparinizada completa tomadas a 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv se procesaron dentro de las 3 horas posteriores a la recolección. Para cada animal, tres pozos de una placa tisular de 24 pozos (Thermo Fischer Scientific, Rochester, NY) se llenaron con 1,5 ml de sangre cada uno y se mezclaron con 100 μL de PBS estéril (control negativo) o se estimularon con 100 μL de PPDa o PPDb (Vacunas CZ, Porriño, España) Después de 22 horas de estimulación, las placas se centrifugaron a 750 g durante 15 minutos, y el plasma se recogió y se almacenó a -20 °C hasta que se hizo la prueba.

Para el análisis de la respuesta inmune local mediada por células, un total de 2 × 106 leucocitos mononucleares aislados del íleon, los parches de Peyer y el ganglio linfático mesenteric se sembraron por pozo en tres pozos cada uno de una placa de tejido de 24 pomos y se estimularon como se describe para la sangre completa. Después de 22 h de estimulación, las placas se centrifugaron a 750 g durante 15 minutos, y los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a -20 °C hasta que se probaron.

La producción de IFN-γ en estos ensayos se evaluó por duplicado utilizando ELISA comercial para IFN-γ bovino siguiendo las instrucciones del fabricante (prueba Bovigam^® Mbv IFN-γ para ganado, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.), y los valores de absorbancia se midieron espectrofotométricamente utilizando un lector ELISA ELX800 (Bio Los valores de O.D. se ajustaron dividiendo el valor de O.D. de plasma o sobrenadante por el valor de O.D. de control negativo de cada placa para evitar variaciones entre placas. Los resultados se expresaron como valores de índice aviái y bovino por medio del cociente entre el O.D. medio de PPDa o O.D. del plasma estimulado por PPDb, respectivamente, y el O.D. medio del plasma de control negativo (11, 36).

Se permitió que las muestras de sangre no heparinizadas se coagularan y se retraieran, y el suero se almacenó a -20 °C hasta su uso. Cada suero se analizaron en detección de anticuerpos específicos contra Map (37) y Mbv (38) utilizando pruebas ELISA comerciales (ID Screen^® Paratuberculosis indirect, IDVet, Gabrels, Francia; e INgezim Tuberculosis DR Eurofins Technology, Madrid, España, respectivamente) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como la relación S/P de anticuerpos Map y Mbv calculada dividiendo el O.D. corregido de la muestra por el O.D. corregido del control positivo y multipliCándose por 100 (39).

Detección cuantitativa de mapas en tiempo real

El ADN se extrajo de 50 mg de íleon distal, parches de Peyer yyunales y ganglio linfático mesentérico utilizando el kit de purificación de ADN de tejido Maxwell^® 16 (Promega, WI, EE. UU.) con el instrumento Maxwell 16 (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. A partir de eso, el ADN se cuantificó utilizando el kit del sistema QuantiFluorTM ONEdsDNA (Promega, WI, EE. UU.) y el fluorémetro QuantusTM (Promega, WI, EE. UU.). El ADN extraído se diluyó a 50 ng · μL−¹ y se almacenó a -20°C hasta que se realizó la qPCR. Se extrajo y cuantificó el ADN genómico de 2 × 108 UFC de mapa y el de 50 mg de tejidos de un animal no infectado para generar una curva estándar.

La detección de la secuencia del mapa IS900 se realizó como lo describió Arteche-Villasol et al. (40). Además, la cuantificación de Map-ADN y la sensibilidad analítica de qPCR se evaluaron mediante la construcción de una curva estándar diluida 10 veces utilizando ADN Map-geómico que va de 1.000 pg a 0,001 pg/reacción mezclado con 100 ng/reacción de ADN tisular de un animal no infectado. Las muestras se consideraron positivas cuando el pico de disociación (Tm) fue de 89,1 ± 1,5 °C y los ciclos de umbral (Ct) fueron ≤ 37 (41, 42). Los resultados de la qPCR se analizaron utilizando el software 7500 v2.0.6 (Applied BiosystemsTM). La cantidad de ADN del mapa (pg) de cada pozo se calculó mediante la interpolación de sus valores de Ct con la curva estándar como se describió anteriormente (43), y la cantidad media se calculó a partir de ambos duplicados.

Cultivo de tejidos y fecales del mapa

El íleon distal, los parches de Peyer jejunal y el ganglio linfático mesentérico de cada animal se probaron individualmente, mientras que las muestras fecales se agruparon en grupos de tres cabras cada uno. Los segmentos del parche de ílio y Peyer (12 cm) y 2 gramos de ganglio linfático mesentérico se procesaron como se describe para el aislamiento de leucocitos tisulares y siguiendo los métodos descritos anteriormente (44). Brevemente, 2 g de cada grupo de muestras de tejido y fecales se descontaminaron con 38 ml de cloruro de hexadecilpiridinio y se homogeneizaron en una licuadora de estómago (Masticator, IUL) durante aproximadamente 15 s. Después de 18 horas de descontaminación, se utilizaron 200 μL de la suspensión para inocular dos tubos que contenían el medio de yema de huevo de Herrold suplementado con piruvato de sodio y micobactina J (MJ) y dos tubos que contenían 7H9 OADC suplementados con MJ, penicilina, anfotericina y clor Los cultivos se incubaron a 37 °C ± 1°C, y el crecimiento se comprobó mediante un examen bajo un microscopio estereoscópica después de 8, 12, 16 y 20 semanas de postnoculación. Los cultivos se consideraron positivos si se observaban una o más colonias de mapas características en cualquier tubo. Las colonias aisladas en ambos medios fueron confirmadas por una PCR múltiplex en tiempo real que detecta secuencias de mapas IS900 e ISMap02 (45).

Análisis citometrico de flujo de PBMC y leucocitos tisulares

Se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo de un solo color para la caracterización fenotípica de PBMC aislados en 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv y leucocitos mononucleares aislados del íleon distal, parches de Peyer yeyunales y ganglio linfático mesenérico. Un número total de 2 × 105 células por pozo se sembraron en una placa de 96 pozos (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) y se incubaron con anticuerpos primarios contra los marcadores de la superficie de los linfocitos detallados en la Tabla 1 durante 1 h a 4°C. Después, las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados apropiados durante 1 h a 4 °C (Tabla 1). Finalmente, las células se fijaron con el 1 % de CellFIXTM (Becton Dickinson and Company, Erembodegem, Bélgica) hasta que se analizaron. La adquisición de muestras de 10.000 eventos se realizó utilizando un citómetro de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec^®), donde los eventos se bloquearon durante el análisis de adquisición como se describió anteriormente en otra parte (35) para descartar la presencia de aire y dobles. Luego, el análisis de los datos se llevó a cabo utilizando el software MACSQuantify10 SoftwareTM (Miltenyi Biotec^®), y los resultados se expresaron como porcentaje de células positivas.

Examen histopatológico

Los tejidos fijos para el examen histopatológico se procesaron convencionalmente para la incrustación de parafina y se tiñeron con la técnica hematoxilina-eosina y Ziehl-Neelsen para la detección rápida de bacilos al ácido (46).

Las lesiones consistentes con la infección de Map se clasificaron como focales, multifocales a y multifocales b, o formas difusas de acuerdo con la presencia y ubicación de granulomas y siguiendo las pautas descritas anteriormente para los rumiantes pequeños (8, 46). En resumen, las lesiones se caracterizaron como formas focales cuando los granulomas estaban restringidos al tejido linfoide de los parches de Peyer; formas multifocales cuando los granulomas estaban ubicados en la lámina propia adyacente al tejido linfoide (multifocal a) o no (multifocal b) y formas difusas cuando los granulomas se propagan a amplias áreas de la La clasificación de cada animal se basó en su lesión granulomatosa más grave. Después del examen histopatológico, el número de granulomas por sección de tejido se cuantificó en todas las muestras de tejido como se describe en otra parte (11, 46). Se seleccionaron tres secciones de tejido de cada sitio intestinal (es decir, íleon, zonas proximales, medias y distales; zonas proximales, medias y distales; válvulas ileocecales y parches de Peyer jejunales, zonas proximales, medias y distales) y dos secciones de cada ganglio linfático (es decir, gang

Análisis estadístico

La distribución normal de los resultados de los anticuerpos específicos de Map y Mbv, la producción local y periférica de IFN-γ y la proporción de subpoblaciones de linfocitos periféricos y tisulares se evaluaron para la normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk. Los datos de la producción de IFN-γ y las pruebas ELISA de anticuerpos se transformaron logarítmicamente. Luego, se analizaron los resultados de la citometría de flujo y ELISA de la producción periférica de IFN-γ y anticuerpos utilizando el procedimiento de modelo lineal generalizado (GLM) para evaluar los principales efectos de la vacunación, el desafío, el tiempo y sus interacciones. Posteriormente, se estimaron las diferencias entre los grupos de vacunación para cada vez que se tomó la muestra utilizando la corrección de Tukey-Kramer para múltiples comparaciones. Del mismo modo, los principales efectos de la vacunación, el tejido y sus interacciones se estimaron en los resultados de la producción local de IFN-γ, seguido de la evaluación de las diferencias entre los grupos de vacunación y los tejidos utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer. Además, las diferencias entre los grupos en el número de cabras con lesiones se evaluaron utilizando χ2 y las pruebas exactas de Fisher. Además, después de la transformación logarítmica, las diferencias en los recuentos de granulomas entre los grupos de vacunación se calcularon utilizando la prueba t de Student. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el software GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, EE. UU.), excluyendo los GLM que se realizaron utilizando el software R 3.5.3 (R Development Core Team, 2019). P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Respuesta inmune mediada por células periféricas y locales (IFN-γ)

Los resultados de GLM mostraron que los valores del índice de aves y bovino alcanzaron niveles significativos de 60 a 190 dpv en los grupos VS, VSI, VH y VHI (p < 0,001 y p < 0,01 respectivamente) (Figuras 2A, B). Además, la inmunización contra la vacuna Silirum^® (VS y VSI) e HIMB (VH y VHI) ejerció un efecto considerable en los valores del índice de aves independientemente del estado de infección (p < 0,01 y p < 0,001, respectivamente) (Figura 2A), pero solo los grupos VHI, VH y StrHI mostraron un efecto significativo en los valores Además, el desafío oral impactó significativamente en los niveles de índice aviar de los grupos VSI, VHI (p < 0,001) e NVI (p < 0,05) y en los valores del índice bovino de los grupos VSI, VHI (p < 0,01) y StrHI (p < 0,05).

El análisis de comparaciones múltiples mostró que el grupo VSI tenía valores de índice avial más altos que NV, NVI, StrSI, AdjSI y AdjHI a 60 y 120 dpv, mientras que el grupo VS mostró estas diferencias solo a 120 dpv (Figura 2A). Por el contrario, estos grupos no mostraron ninguna diferencia significativa en los niveles de índice bovino (Figura 2B). Además, no se observaron diferencias entre VS y VSI, ya sea en los valores de índice aviáve o bovino en ningún momento. Por otro lado, el grupo VHI mostró mayores valores de índice avial que NVI, NV, StrSI, AdjSI y AdjHI a 120 dpv (Figura 2A). Además, los valores del índice bovino de este grupo fueron significativamente más altos que NV, NVI, StrSI, AdjSI y AdjHI a 90, 120, 150 y 190 dpv y mayores que VH a 120 dpv (Figura 2B).

La producción local de IFN-γ en leucocitos mononucleares purificados de los tejidos y estimulados con PPDa y PPDb fue menor que la observada en los PBMC. Además, los valores del índice de aves fueron más heterogéneos que los niveles del índice bovino debido a la mayor variabilidad individual observada en el primero (Figuras 3A, B), específicamente en los grupos NVI, VH, VHI, StrHI y AdjSI (Figura 3A). Los parches de Peyer y el ganglio linfático mesenteric del grupo NVI mostraron los valores de índice avial más altos, seguidos por el íleon, los parches de Peyer y el ganglio linfático mesenteric del grupo StrHI (Figura 3A). Sin embargo, el análisis estadístico no mostró un efecto significativo de la vacunación o la ubicación del tejido en los valores del índice avial o bovino (p > 0,05). Además, tampoco se observaron diferencias significativas entre los grupos vacunados en el análisis de comparaciones múltiples (p < 0,05). Mientras tanto, se observaron diferencias significativas en los valores del índice de aviarios dentro del grupo de IPN, donde la producción de IFN-γ fue mayor en los parches de Peyer y el ganglio linfático mesentérico que en el íleon (p < 0,05) (Figura 3A). Además, a pesar de la alta variabilidad dentro de los grupos observados en los valores del índice bovino, los valores del ganglio linfático mesentérico del grupo VH fueron considerablemente más altos que los de los parches de íleon y Peyer (p < 0,01) (Figura 3B).

Respuesta humorística periférica

Los resultados de GLM estimaron que la producción de anticuerpos específicos de Map y Mbv alcanzó niveles significativos de 60 a 190 dpv (p < 0,001 y p < 0,0001, respectivamente) en los grupos vacunados con Silirum^® e HIMB (Figuras 4A, B). Además, el desafío oral aumentó la producción de anticuerpos específicos del mapa en los grupos vacunados VSI, VHI (p < 0,001) y NVI (p < 0,05) (Figura 4A) y la producción de anticuerpos específicos de Mbv en VHI (p < 0,001) (Figura 4B). Además, el análisis de comparaciones múltiples mostró que solo VSI tenía valores de S/P significativamente más altos en los específicos del mapa en comparación con los grupos inmunizados con adyuvantes, bacterias inactivadas y no vacunados a 90, 120, 150 y 190 dpv, mientras que no se observaron diferencias significativas en VHI (Figura 4A). Además, no se observaron diferencias significativas en los niveles de anticuerpos de Map, ya sea entre los grupos de vacunación Silirum^® e HIMB o entre los grupos vacunados infectados y no infectados.

Los valores S/P específicos de Mbv fueron significativamente más altos al comparar el grupo VHI con los grupos VS, VSI, StrSI, StrHI, AdjSI y AdjHI en 60, 90, 120, 150 y 190 dpv (Figura 4B). Sin embargo, se observaron diferencias significativas entre VHI y VH solo en 120, 150 y 190 dpv (Figura 4B).

PCR cuantitativa y bacteriología de tejidos y heces

La detección del mapa fue confirmada por qPCR (n = 4) y cultivo bacteriológico (n = 3) dentro de cabras infectadas (n = 35). Los animales positivos a qPCR correspondían a (i) dos cabras de StrHI (nido linfático mesentérico y parches de Peyer, respectivamente), (ii) una de VHI (parches de Peyyer) y (iii) una de AdjSI (parches de Peyer). Además, los animales positivos al cultivo bacteriológico correspondieron a una cabra cada uno de NVI, VHI (ileo, parches de Peyer y positivos para los ganglios linfáticos mesenteric) y VSI (positivos positivos para el telio y los ganglios linfáticos mesentéricos). Solo los parches de Peyer de la cabra de VHI mostraron resultados positivos para ambas técnicas de detección. Todas las muestras de tejido de grupos no infectados fueron negativas a la amplificación de la secuencia IS900 por qPCR o cultivo bacteriológico. El cultivo bacteriológico de Map fue negativo en cada muestra fecal analizada.

Subconjuntos relativos de linfocitos de sangre periférica y tejidos

Las desviaciones medias y estándar de las proporciones relativas de tres linfocitos T (CD4⁺, CD8⁺ y CD3+), un linfocito γδ T y dos marcadores de superficie de linfocitos B (CD21⁺ y CD20+) se estimaron mediante citometría de flujo.

A lo largo de todos los grupos, la mayor proporción relativa de células positivas en PBMC aislados de sangre total correspondió a linfocitos γδ T (30,46 % ± 3,5 %), mientras que la proporción más baja se observó en los linfocitos CD20⁺ B (5,96 ± 1,48%) a lo largo del estudio (Tabla complementaria 1). Sin embargo, a pesar del análisis estadístico que muestra oscilaciones significativas (p < 0,001) de las proporciones relativas de linfocitos CD4⁺, CD8⁺, WC1⁺, CD21⁺, CD3⁺ y CD20⁺ en diferentes muestreos, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p > 0,05).

La citometría de flujo llevada a cabo en células purificadas a partir de muestras de tejido mostró que los niveles de proporción relativa más altos correspondían a los linfocitos CD21⁺ B en el íleon (39,47 ± 4,71%), los parches de Peyer (26,81 ± 3,59%) y el ganglio linfático mesentérico (44,90 ± 3,52 %), mientras El análisis estadístico mostró una influencia significativa de la vacunación e inmunización con bacterias inactivadas y adyuvantes en la proporción relativa de subconjuntos de linfocitos tisulares (p < 0,05). Sin embargo, los resultados de las comparaciones entre grupos no mostraron un patrón claro entre la proporción relativa de subpoblaciones de linfocitos y los diferentes grupos, probablemente debido a la variabilidad individual observada dentro de los grupos. La media, la desviación estándar y los resultados de las múltiples comparaciones de subpoblaciones relativas de linfocitos en el íleon, los parches de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos se resumen en las Tablas Suplementarias 2-4.

Hallazgos patológicos

No se encontraron lesiones gruesas compatibles con la paratuberculosis en ningún animal. Se detectaron lesiones granulomatosas microscópicas características de la infección de Map en todos los grupos infectados, con diferencias en la gravedad y la distribución. El número de cabras por grupo con lesiones según el tejido y el número de cabras por grupo clasificados en términos de gravedad de las lesiones se muestran en la Tabla 2.Las cabras con granulomas pequeños y bien definidos compuestos de macrófagos, con un citoplasma pálido abundante y un núcleo grande, escoltados por unos pocos linfocitos ubicados exclusivamente en el área interfollicular del tejido linfoide intestinal, se clasificaron como focales (n = 5) (Figura 5A). Además, las cabras con granulomas bien definidos en el área interfolicular de los parches de Peyer y también en la lámina propia estrechamente asociada con el tejido linfoide intestinal se clasificaron como multifocal a (n = 5) (Figura 5B). Finalmente, la presencia de lesiones granulomatosas no solo en los parches de Peyer y la lámina propia relacionada, sino también en áreas de la mucosa sin ninguna asociación con el tejido linfoideo, se consideró como multifocal b (n = 13) (Figura 5C). No se notaron lesiones difusas en los tejidos de ninguna cabra (n = 0). Los grupos VSI y VHI fueron los menos afectados con solo un animal de cada grupo que desarrolló lesiones granulomatosas, mostrando diferencias significativas en comparación con la NVI en la que las lesiones estaban presentes en todos los animales (p < 0,05). Además, las lesiones de la cabra VSI se clasificaron como focales, mientras que la cabra del grupo VHI mostró lesiones más graves, categorizadas como multifocal b como todas las cabras del NVI. Además, la mayoría de las cabras inmunizadas con cepas (StrSI y StrHI) desarrollaron formas b multifocales, a excepción de un animal de StrHI con una lesión focal. Por el contrario, entre los animales inmunizados con adyuvantes (AdjSI y AdjHI), solo un animal del AdjSI mostró lesiones multifocales b, mientras que se encontraron lesiones focales y multifocales a en las cabras restantes. No se detectaron diferencias significativas en el número de cabras con lesiones granulomatosas en grupos inmunizados con bacterias inactivadas o adyuvantes (p > 0,05). Las lesiones granulomatosas se localizaron principalmente en los parches de Peyer yeyunales, seguidas de íleon distal, ganglios linfáticos, válvula ileocecal y y jejunio, aunque las lesiones observadas en los ganglios linfáticos siempre se asociaron con la presencia de lesiones granulomatosas en el intestino (Tabla 3). No se observaron lesiones microscópicas en los grupos que permanecieron como no infectados. No se detectaron bacilos ácidos en las lesiones de ninguna de las cabras infectadas.

El número total de granulomas por grupo se resumió en la Tabla 3. El grupo NVI mostró el número más alto, mientras que el más bajo correspondía a los grupos VSI y VHI. Además, el número de granulomas observados en los grupos StrSI y StrHI fue mayor que los observados en AdjSI y AdjHI. Se observaron diferencias significativas en el número medio de granulomas por grupo (Figura 6) entre los grupos NVI (159,60 ± 27,90) y VSI (4,60 ± 10,29) y VHI (6,20 ± 13,86) (p < 0,05). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en los grupos StrSI (57,60 ± 61,54), StrHI (61,40 ± 83,22), AdjSI (20.00 ± 26,82) y AdjHI (29,20 ± 33,86) (p > 0,05).

Discusión

Los estudios de vacunación contra la paratuberculosis realizados en rumiantes han demostrado resultados valiosos en la reducción del número de animales clínicamente afectados y la prevalencia de la enfermedad (16, 23). Sin embargo, la incapacidad de la respuesta inmune protectora provocada por la vacunación para prevenir completamente la infección y su progresión y propagación se está alejando del término «vacuna ideal» (47, 48). Esta desventaja se debe en parte a la falta de conocimiento sobre los mecanismos periféricos y locales relacionados con el éxito o el fracaso de la protección contra las micobacterias. Aquí, este trabajo analiza la respuesta inmune local y periférica provocada por la vacunación homóloga (Silirum^®) y heteróloga (vacuna HIMB) y la inmunización con sus componentes por separado y su relación con el grado de protección estimado por la evaluación de las lesiones granulomatosas microscópicas y la presencia de Map en los tejidos.

A pesar de la identificación de lesiones granulomatosas distintivas paratuberculosis en todos los grupos de cabras infectadas, independientemente de su estado de vacunación o inmunización, la variación en su gravedad refleja las observaciones de los estudios de campo y experimentales, ya que las lesiones observadas en cabras vacunadas contra la paratuberculosis fueron leves (focales) y escasas, mientras que No se observaron lesiones difusas, posible debido al corto período de incubación de este trabajo (4-5 meses), en línea con otros estudios en los que se observaron lesiones b multifocales hasta 7 meses después de la infección, mientras que las lesiones de tipo difuso no se notificaron hasta 12 meses (46,49). A pesar de este hecho, los resultados obtenidos aquí coinciden con otros estudios experimentales en los que las lesiones observadas en animales vacunados se limitaron a formas regresivas (focales), contenidas en el área interfolicular del tejido linfoide intestinal, evitando su diseminación a través del intestino pero sin prevenir la infección, como se confirmó mediante la detección de Map en tejidos de una cabra

Hasta la fecha, los estudios de eficacia de la vacunación in vivo se han centrado principalmente en la inducción temprana y sostenida de IFN-γ periférico (20, 21, 52), ya que la liberación de esta citocina se ha asociado con la activación de los mecanismos antimicobacterianos y la prevención del crecimiento bacteriano intracelular (53, 54). Ciertamente, la dinámica de producción de IFN-γ observada en los grupos vacunados por Silirum^® (es decir, VS y VSI) fue consistente con otros estudios realizados con cabritos vacunados con vacunas muertas por calor (52, 55). Además de la respuesta inmunitaria mediada por células, los animales vacunados con Silirum^® también mostraron un aumento de los niveles de anticuerpos de Map. El papel de la respuesta humoral ha sido subestimado, ya que se ha considerado ineficaz contra los patógenos intracelulares (56, 57). Sin embargo, un número emergente de estudios realizados en condiciones experimentales han sugerido el posible efecto positivo de los anticuerpos en el control de la paratuberculosis, incluso en relación con la vacunación (58-60). Esto está respaldado por la fuerte respuesta humoral inicial observada en las ovejas vacunadas contra la paratuberculosis y la capacidad de estos animales para modular esa respuesta en etapas posteriores para prevenir la progresión de la infección (60). Tanto las respuestas celulares como las humorales se mejoraron significativamente en este estudio después del desafío experimental con Map. Estos resultados imitan el aumento de IFN-γ observado en las cabras vacunadas contra la paratuberculosis y con exposición natural en condiciones de campo (61), aunque el aumento significativo en la producción de anticuerpos después del desafío oral de Map observado aquí contrasta con estudios anteriores en los que la infección oral experimental en ovejas vacunadas no exhibió diferencias con animales no vacunados o incluso condujo Sin embargo, el aumento de las respuestas celulares y humorales observadas aquí no impidió la aparición de lesiones granulomatosas en el grupo VSI. Por lo tanto, a pesar de que la vacunación podría estar limitando la progresión y la gravedad de las lesiones, ya que solo una cabra VSI desarrolló un bajo número de granulomas focales, la respuesta celular y humoral periférica no permitió predecir la presencia de lesiones o infección en animales vacunados.

Además, los cambios en la proporción relativa de subpoblaciones de linfocitos también se han relacionado con infecciones micobacterianas (62–64). En este sentido, las vacas con enfermedad clínica han mostrado proporciones más bajas de linfocitos CD4⁺, CD8⁺ y γδ T que las vacas subclínicas en PBMC recién aislados (65). Además, en otro estudio, se detectaron porcentajes más altos de linfocitos γδ T y B y una disminución en CD4⁺ en los tejidos de las ovejas infectadas durante la infección experimental temprana del mapa (10). Con respecto al efecto de la vacunación, se ha informado que la infección de ovejas vacunadas por Gudair^® con Map conduce a una disminución en las proporciones de linfocitos CD4⁺ y B periféricos a los 13 días posteriores al desafío evaluados en PBMC in vitro estimulados por Map, pero esto no se evaluó en células no estimuladas y recién aisladas (22). Por el contrario, no se detectaron cambios en la proporción relativa de linfocitos T periféricos (CD4, CD8⁺, γδ y CD3+) o linfocitos B (CD20⁺ y CD21+) en PBMC recién aislados entre ningún grupo de este estudio. Además, se estimaron diferencias en la proporción relativa tisular de subpoblaciones de linfocitos, pero no se observó una relación clara entre estos resultados y la vacunación/inmunización y/o infección, probablemente debido a la alta variabilidad individual dentro de los grupos examinados. Del mismo modo, no se observó ninguna relación entre la producción local de IFN-γ y el desarrollo de lesiones, ya sea en VSI u otros grupos infectados. En este sentido, solo los parches de Peyer y el ganglio linfático mesenteric del grupo NVI produjeron una producción de IFN-γ ligeramente más alta. Este resultado es consistente con el mayor número de granulomas detectados en este grupo, ya que un mayor número de lesiones granulomatosas se han relacionado con un mayor número de células inmunomarcadas IFN-γ (6) y es probable que las lesiones presentes en los grupos infectados restantes podrían no ser suficientes para generar una respuesta inmune sustancial mediada por células locales en respuesta a los Por lo tanto, ni las respuestas inmunes celulares y humorales periféricas ni la evaluación de la proporción relativa de subpoblaciones de linfocitos en sangre y tejidos enteros, ni la producción local de IFN-γ fueron capaces de predecir aquellos animales que permanecen desprotegidos temprano después de la infección. Además, se ha demostrado que la vacunación reduce el número de bacterias excretadas tanto en condiciones de campo como experimentales (17, 21, 37, 66). En este estudio, Map no se aisló en las heces de ninguna cabra. Se ha detectado un aumento de la derramamiento de mapas en relación con el desarrollo de lesiones graves y signos clínicos en animales infectados de forma natural y experimental (67, 68), aunque podría detectarse de forma intermitente en animales con paratuberculosis subclínica (53, 69). Sin embargo, las heces se recogieron solo en el momento del sacrificio (145 días después de la infección), por lo que la presencia de Map podría haber sido subestimada debido al corto tiempo posterior al desafío y al tiempo limitado muestreado. Además, se ha observado que el desprendimiento fecal se asocia con frecuencia con animales con un alto número de tejidos positivos para cultivos y lesiones graves (70). Además, el bajo número de tejidos Map-positivos detectados por cultivo bacteriológico o qPCR (7 de 35 cabras infectadas) no fue sorprendente, ya que en varios trabajos anteriores, ya sea en casos naturales o experimentales (46, 71), se ha demostrado que la carga bacteriana en animales con lesiones similares a las encontradas en este estudio estaba ausente o era muy baja.

Curiosamente, solo una cabra del grupo VHI desarrolló lesiones granulomatosas paratuberculosis, aunque clasificadas como multifocal b, que muestran la eficacia de la protección heteróloga que la vacunación contra la tuberculosis confiere contra la infección de Map. Al igual que la vacunación homóloga, los grupos vacunados con HIMB (es decir, VH y VHI) mostraron una producción significativa de IFN-γ y anticuerpos como se describió anteriormente en las cabras (66, 72), incluso cuando se estimuló la sangre con PPDa. Además, también se observó un aumento en la producción de IFN-γ en cabras vacunadas por vía subcutánea con la vacuna HIMB y desafiadas endobronicamente con una micobacteria estrechamente relacionada (M. caprae) en condiciones experimentales (66), lo que demuestra una vez más que la elevación de estas respuestas no garantiza el éxito de la vacunación, ya que El efecto de protección cruzada relacionado con la vacunación se ha informado previamente, ya que se observó una reducción de las lesiones pulmonares en cabras vacunadas contra la paratuberculosis (32) o terneros (33) infectados endobronquialmente con M. caprae o Mbv, respectivamente. Además, a pesar de este efecto beneficioso, se observó una reacción cruzada contra los antígenos micobacterianos estándar en el ensayo de liberación de IFN-γ y la determinación de anticuerpos específicos del mapa e implicó una desventaja relevante para la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DIVA) (31). Esta reacción cruzada se ha descrito previamente en respuesta a los antígenos micobacterianos PPDa y PPDb, aunque por lo general esta producción está sesgada hacia el antígeno relacionado con la estimulación homóloga (73–75). Es notable que los anticuerpos específicos contra Mbv se detectaran solo en el grupo VHI y, durante un corto tiempo, en el grupo VH, mientras que los anticuerpos específicos contra Map se encontraron fácilmente no solo en el grupo VSI, sino también en los grupos VS, VH y VHI. Los avances recientes en la evaluación de proteínas recombinantes para las pruebas serológicas de Mbv, como la utilizada aquí (MBP83), han hecho posible minimizar la reacción cruzada inducida por la vacunación contra la paratuberculosis en el diagnóstico de tuberculosis (38, 76). Por lo tanto, el desarrollo y el uso/implementación de antígenos más específicos (reactivos DIVA) tanto para el ensayo IFN-γ como para la detección de anticuerpos son necesarios con el fin de mejorar el diagnóstico inmunológico de la paratuberculosis y la tuberculosis y para superar las interferencias producidas por la vacunación (31).

Al abordar el efecto de las cepas inactivadas de Silirum^® e HIMB de forma individual, se observó que las cabras de StrSI y StrHI mostraron un mayor número de lesiones granulomatosas que afectaban a un mayor número de animales que las de los grupos VSI o VHI. Además, a pesar del hecho de que el número de granulomas fue menor que el de las cabras del IN, estos también se clasificaron como multifocales b, lo que demuestra la progresión de la infección en estos grupos. Con respecto a las respuestas inmunitarias periféricas, solo el grupo StrHI mostró altos niveles periféricos de IFN-γ en respuesta a ambos antígenos micobacterianos, pero no a la producción de anticuerpos periféricos, lo que podría sugerir la capacidad de esta cepa para estimular solo la respuesta inmune celular periférica. En este sentido, en un estudio realizado en ganado, la administración oral de la cepa inactivada Mbv 1403 suspendida en PBS no mostró un aumento de la producción de IFN-γ en respuesta al antígeno bovino, mientras que la inmunización parenteral con esta cepa homogeneizada en el adyuvante MontanideTM ISA 50 V 2 (vacuna HIMB Por el contrario, no se detectaron respuestas inmunitarias celulares o humorales periféricas evidentes en el grupo StrSI, aunque el IFN-γ aumentó a 150 dpv. En este sentido, es factible que este aumento tardío fuera el efecto de la infección de Map en lugar de la inmunización en sí, ya que los animales con la mayor respuesta inmune periférica mediada por células correspondían a los que tenían las lesiones granulomatosas más numerosas (no se muestran datos). Por lo tanto, esta respuesta inmune periférica limitada provocada por bacterias inactivadas podría ser una consecuencia de su débil inmunogenicidad en ausencia de adyuvantes (78, 79).

Además, la inmunización con adyuvantes (es decir, AdjSI y AdjHI) en ausencia de antígenos bacterianos dio lugar a un menor número de lesiones granulomatosas que en el grupo StrSI, StrHI o incluso NVI. Además, estas lesiones se clasificaron principalmente como focales y multifocales a, con solo un animal del AdjSI desarrollando lesiones multifocales b. En este sentido, no se detectaron respuestas inmunitarias celulares o humorales periféricas significativas en los grupos inmunizados adyuvantes. Esto está de acuerdo con un estudio anterior en el que no se registró una respuesta inmune periférica específica en terneros inmunizados adyuvantes MontanideTM ISA 50 V 2 (80). Sin embargo, solo AdjSI mostró un aumento posterior en la respuesta IFN-γ periférica (150 dpv) y los anticuerpos específicos de Map (190 dpv) posiblemente asociados con la presencia de lesiones multifocales a y b en contraste con AdjHI que mostraron principalmente lesiones focales similares al grupo VSI, aunque el efecto principal de los adyuvantes no se pudo evaluar Esto es similar al aumento posterior observado en StrSI, StrHI y NVI, en el que también se detectaron lesiones multifocales b. Por lo tanto, es posible que el mayor número y extensión de las lesiones en estos grupos se correlacionaran con una mayor respuesta de los linfocitos sensibilizados que podrían haber migrado del intestino a la sangre, como se había hipoteado anteriormente (6).

El papel principal de los adyuvantes de aceite mineral en la vacunación es aumentar la respuesta inmunitaria a través de la liberación sostenida del antígeno en el lugar de la inyección, asegurando la estimulación constante de la respuesta inmunitaria (78). Los adyuvantes de MontanideTM, tal como se usan aquí, provocan un liposoma que protege el antígeno inactivado de la degradación, llevándolo a drenar los ganglios linfáticos a través del reclutamiento de células y linfocitos que presentan antígenos (79). Sin embargo, se han reportado diferencias en los perfiles de respuesta inmunitaria dependiendo del tipo de adyuvante MontanideTM (25, 81, 82). Por ejemplo, las respuestas de anticuerpos IFN-γ específicas del antígeno y del mapa específicas provocadas por la vacunación de ovejas con la cepa Map 316F muerta por el calor combinada con MontanideTM ISA 50 V 2 fueron más bajas que las provocadas por la vacunación con la vacuna comercial Gudair^® (MontanideTM ISA 103 y 80) (25). Estas diferencias podrían estar relacionadas con la composición de los adyuvantes (tipo de ácidos grasos o emulsionante) y la intensidad de la respuesta inflamatoria en el lugar de la inyección, sin embargo, y a pesar de su importancia en la formulación de la vacuna, su interacción primaria con la respuesta inmune del huésped aún no se entiende completamente, ya que su efecto a menudo se estudia en Por esa razón, a pesar de la ausencia de diferencias estadísticas debido a la alta variabilidad individual, es sorprendente que el número limitado y la gravedad de las lesiones granulomatosas en los grupos AdjSI y AdjHI sin la liberación de un antígeno fueran bastante similares a los observados en los grupos VSI y VHI. En un estudio realizado en terneros, solo dos de los seis terneros inmunizados con MontanideTM ISA 50 V 2 mostraron un cultivo positivo de Mbv en los ganglios linfáticos preescapulares derechos después del desafío intranodular de Mbv (80), lo que sugiere que el adyuvante podría limitar, en cierta medida, la propagación de Se sabe que la aplicación de adyuvantes de agua en el gasoil mostró un claro efecto estimulador sobre la respuesta inmunitaria del huésped antes de la inmunización con un antígeno (27). Sin embargo, en ausencia de una respuesta inmune periférica o local específica clara, es tentador plantear la hipótesis de que esta respuesta inmune protectora podría estar mediada por mecanismos inespecíficos que podrían ayudar al huésped a controlar la infección micobacteriana. Este mecanismo es desconocido, pero otras células inmunes, como las células presentadoras de antígenos (es decir, macrófagos, células dendríticas) podrían estar mediando en esta respuesta, ya que son reclutadas en el sitio de inoculación (26) y posiblemente se están activando debido a la respuesta inflamatoria. De hecho, se ha planteado la hipótesis de que estas células pueden estar involucradas en el desarrollo de una respuesta inmune «entrenada» caracterizada por su respuesta aumentada e inespecífica después de la reinfección independientemente de la respuesta inmune adaptativa a la memoria (83).

En conjunto, este estudio ha evaluado los perfiles inmunológicos de dos vacunas inactivadas por calor contra la paratuberculosis y la tuberculosis antes y después del desafío del mapa. Nuestros resultados destacaron el hecho de que los predictores como la respuesta IFN-γ periférica y local, la producción de anticuerpos periféricos y la evaluación periférica y local de las subpoblaciones de linfocitos no pueden evaluar el resultado de la vacunación, siendo evaluado solo de manera efectiva mediante la evaluación de las lesiones microscópicas que ha demostrado ser un método eficaz para estimar el estado de Sin embargo, tanto la vacunación homóloga como la vacunación heteróloga fueron capaces de conferir una alta respuesta inmune protectora contra la infección de Map, limitando la progresión de las lesiones granulomatosas y, además, demostrando el beneficio potencial de la vacunación contra la tuberculosis en el control de la paratuberculosis. En este sentido, se necesitan más estudios centrados en la reducción de las interferencias en las pruebas serológicas utilizadas para el diagnóstico de la paratuberculosis y la tuberculosis, posiblemente dirigidas a rutas de vacunación alternativas o a diferentes adyuvantes utilizados. Además, se observó un efecto interesante en la reducción del número y la gravedad de las lesiones granulomatosas de paratuberculosis en grupos inmunizados con adyuvantes de aceite mineral altamente refinado. Por lo tanto, se necesitan más estudios para evaluar el efecto de cada componente de la vacuna que podría estar involucrado en la protección contra las micobacterias.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que respalde las conclusiones de este artículo estarán disponibles por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración ética

El estudio con animales fue revisado y aprobado por el Subcomité de Experimentos y Bienestar Animal de la Universidad de León (ULE) (OEBA-ULE-016-2017).

Contribuciones del autor

VP, JB, DG-E y NA-V diseñaron y llevaron a cabo el experimento. JE ayudó en el análisis estadístico. VP, JB, DG-E, NA-V, RV y MF participaron en las necropsias, así como en la recogida y el análisis de muestras de sangre y tejidos. El inóculo del mapa y la preparación de la vacuna HIMB fueron llevados a cabo por NE e IS que, junto con NA-V, participaron en el análisis bacteriológico. El manuscrito fue escrito por VP, JB, DG-E y NA-V. La versión final presentada fue leída y aprobada por todos los autores.

Financiación

Este trabajo fue apoyado financieramente por el Ministerio de Ciencia e Innovación de España (proyectos AGL2015-66540-C2-1-R y RTI2018-099496-B-I00), la Junta de Castilla y León (proyecto LE259P18) y el Instituto Nacional de Investigación Agronómica (proyecto RTA 2017-00089-00-00). NA-V recibió un contrato predoctoral (BES-2016-076513) del Ministerio de Ciencia e Innovación de España y DG-E y JE de un contrato postdoctoral del Ministerio de Ciencia e Innovación (subvenciones no. FJCI-2017-32020 y FJC2019-042422-I respectivamente).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Agradecimientos

Daríamos las gracias al personal del Instituto de Ganadería de Montaña (CSIC-ULE) por la entrega de los animales de experimentación. También damos las gracias a CZ Vaccines por proporcionar los productos de inmunización utilizados en el estudio. Además, queremos reconocer al personal del laboratorio de técnicas instrumentales de la Universidad de León y la ayuda técnica de Carmen Agudín, Marta Silva, María Teresa Carro, Elena Molina y Ainara Badiola.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2021.744568/full#supplementary-material

Referencias