Influencia de las vacunas heterólogas y homólogas, y sus componentes, en la respuesta inmune del huésped y la protección contra la paratuberculosis experimental de Caprinos

Influencia de las vacunas heterólogas y homólogas, y sus componentes, en la respuesta inmune del huésped y la protección contra la paratuberculosis experimental de Caprinos, foto de lesiones granulomatosas paratuberculosas

 

Influencia de las vacunas heterólogas y homólogas, y sus componentes, en la respuesta inmune del huésped y la protección contra la paratuberculosis experimental de Caprinos

Noive Arteche-Villasol1,2*†,  Daniel Gutiérrez-Expósito1,2, Natalia Elguezabal3, Iker A. Sevilla3,  Raquel Vallejo1,2José Espinosa1,2,  María del Carmen Ferreras1,2, Julio Benavides2 y Valentín Pérez1,2
  • 1Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de León, León, España
  • 2Departamento de Sanidad Animal, Instituto de Ganadería de Montaña (CSIC-ULE), León, España
  • 3Departamento de Sanidad Animal, NEIKER-Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario, Derio, España

 

La vacunación contra la paratuberculosis, una enfermedad crónica de rumiantes causada por Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis (Mapa), se ha considerado como el método de control más eficaz. Sin embargo, la protección está incompleta y los mecanismos que operan en la respuesta de los animales a la vacunación no se entienden completamente. Por lo tanto, este estudio analizó la respuesta inmunitaria y los efectos sobre la protección contra la infección de Map, provocadas por las vacunas contra la paratuberculosis (Silirum®) y la tuberculosis (M. bovis inactivada por calor [HIMB]) y sus componentes en un modelo experimental caprino. Cincuenta niños cabra se dividieron en 10 grupos (n = 5) de acuerdo con su vacunación (Silirum®, HIMB y no vacunados), inmunización (bacterias inactivadas o adyuvantes) y/o infección. El desafío oral con Map se realizó 45 días después de la vacunación/inmunización (dpv), y los animales fueron sacrificados a 190 dpv. La respuesta inmune periférica y la proporción de subpoblaciones de linfocitos se evaluaron mensualmente mediante un ensayo de inmunoabsorción enzimática y un análisis de citometría de flujo, respectivamente. La respuesta inmunitaria local, la proporción de subpoblaciones de linfocitos tisulares, la detección de mapas (reacción en cadena de la polimerasa) y el examen histológico se llevaron a cabo en tejidos linfoides asociados al intestino. Todos los grupos infectados desarrollaron lesiones de paratuberculosis granulomatosas a pesar de la vacunación o la inmunización. Los grupos vacunados con Silirum® e HIMB mostraron una reducción considerable de la lesión consistente con una respuesta inmune celular y humoral periférica significativa. Además, se observó un menor número de granulomas en grupos inmunizados con bacterias inactivadas y adyuvantes en comparación con los grupos no vacunados e infectados. Sin embargo, a pesar de no ser significativa, esta reducción fue aún mayor en los grupos inmunizados adyuvantes, que desarrollaron una lesión granulomatosa más leve sin respuestas inmunitarias periféricas detectables asociadas con la inmunización. No se detectaron cambios en la proporción periférica y local de subconjuntos de linfocitos ni en la respuesta inmunitaria local en relación con la vacunación/inmunización o la infección. A pesar de que la vacunación contra la paratuberculosis y la tuberculosis mostró una protección parcial y cruzada contra la infección de Map, respectivamente, solo el examen histológico pudo evaluar la progresión de la infección en estos animales. Además, el patrón observado en la reducción de las lesiones en grupos inmunizados adyuvantes sugiere la posible implicación de una respuesta inmunitaria inespecífica que reduce el desarrollo de lesiones granulomatosas.

Introducción

La paratuberculosis es una enfermedad crónica y debilitante de los rumiantes causada por Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis (Mapa) (1) y responsable de pérdidas económicas globales significativas estimadas en aproximadamente 12,61 millones de dólares y 364,31 millones de dólares en ganado lechero de España y de la Unión Europea, respectivamente (2, 3). El mapa es una bacteria ubicua transmitida entre el ganado a una edad temprana a través de la vía fecal-oral, aunque las manifestaciones clínicas pueden aparecer varios años después de la infección (4). La respuesta inmune protectora inicial contra Map se ha relacionado con una fuerte respuesta inmune mediada por células caracterizada por la liberación de la citoquina proinflamatoria interferón γ (IFN-γ), la formación de granulomas y el aclaramiento de las micobacterias (5, 6). En este sentido, los animales infectados por el mapa pueden mostrar una variedad de lesiones que han demostrado estar estrechamente relacionadas con las diferentes fases de la enfermedad. Las lesiones paratuberculosas tempranas se caracterizan por granulomas pequeños y bien demarcados, llamados formas focales o multifocales, ubicados dentro del tejido linfoide intestinal que también se pueden ver en animales adultos, donde se consideran formas de latencia o resistencia; la interrupción de la respuesta inmune protectora mediada por células conduce al desarrollo de lesiones difusas y a la evolución Los métodos patológicos para la caracterización de la lesión paratuberculosa se han aplicado con éxito en trabajos anteriores como un indicador fiable de la presencia de la infección de Map y la forma de la enfermedad mostrada por los animales infectados (del 9 al1).

El largo período de incubación y la capacidad de Map para persistir en el medio ambiente obstaculizan los programas de control basados en medidas de gestión de la higiene o el diagnóstico y sacrificio temprano de animales positivos (12, 13). Por esta razón, la vacunación con vacunas de muerte por calor disponibles en el mercado se ha considerado la medida más rentable para el control de la paratuberculosis, ya que su uso reduce la incidencia de la enfermedad dentro del rebaño (14, 15). La vacunación conduce a una reducción tanto de la colonización de los tejidos intestinales como del número de animales clínicamente afectados, logrando una disminución de aproximadamente el 90 % en la presencia de animales que se derraman en mapas (16-18).

Sin embargo, los mecanismos que podrían estar involucrados en la protección asociada con la vacunación aún no se entienden completamente (12, 13). La protección conferida por las vacunas contra la infección de Map se ha correlacionado con una respuesta inmune temprana y fuerte mediada por células (19-21), a pesar del hecho de que hay un bajo porcentaje de fracaso de la vacunación, donde algunos animales vacunados podrían seguir siendo altamente infecciosos y desarrollar lesiones graves (16, 22, 23).

La mayoría de las vacunas paratuberculosas causadas por calor se basan en la cepa Map 316F, que ha demostrado una virulencia reducida (carga bacteriana de los tejidos) durante la infección experimental de los terneros con este aislado vivo, probablemente debido a pasajes continuos in vitro (24). En este sentido, la inmunización subcutánea de ovejas con cepa Map 316F muerta por calor por sí sola no mostró una respuesta inmune significativa mediada por células y humoral (25). La suplementación con adyuvantes de aceite mineral es un principio básico para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos y su liberación continua con el fin de promover una respuesta inmunitaria robusta a través de la formación de una fuerte inflamación local en el lugar de la inyección (26). En un experimento anterior, se encontraron variaciones significativas en la respuesta inmunitaria cuando las vacunas paratuberculosis hechas con diferentes adyuvantes se administraron por vía subcutánea a las ovejas (25). Por otro lado, se ha demostrado que la administración única de adyuvantes provoca una respuesta inmune inespecífica cuyo efecto protector no se ha evaluado en detalle (27-29). En el caso de las vacunas paratuberculosas, no se ha aclarado completamente el efecto que cada componente podría tener en una respuesta protectora contra la infección de Map.

Además, Map comparte un alto número de antígenos comunes con micobacterias relacionadas como Mycobacterium bovis (Mbv) o Mycobacterium caprae, responsables de la tuberculosis en rumiantes, un hecho que está más allá de las reacciones cruzadas que aparecen cuando se utilizan pruebas basadas en inmunológicas para el diagnóstico de tuberculosis en animales infectados o vacunados con paratuber Esto también podría estar asociado con la reducción significativa de las lesiones relacionadas con la tuberculosis lograda después de la vacunación contra la paratuberculosis en cabras y terneros (32, 33). A pesar de este hecho, aún se desconoce el efecto de la inmunización con micobacterias relacionadas con la tuberculosis en el desarrollo de la paratuberculosis.

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue analizar el efecto de la vacunación homóloga o heteróloga de cabras, y un desafío posterior con Map, en la respuesta inmunitaria y la protección y evaluar si los diferentes componentes de estas vacunas (bacterias inactivadas o adyuvantes) podrían participar en la respuesta del huésped vacunado contra Map.

Materiales y métodos
Declaración ética

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las leyes europeas (86/609) y españolas (R.D. 223/1988, R.D. 1021/2005, R.D. 53/2013) y aprobado por el gobierno local tras el informe y las sugerencias del Subcomité de Experimentos y Bienestar Animal de la Universidad de León (ULE) (OEBA-ULE-016-2017).

Vacunas, productos de inmunización y inóculo de desafío

La vacuna comercial Silirum® contra la paratuberculosis y sus componentes (el adyuvante MontanideTM y la cepa Map 316F incluida en la vacuna) fueron preparadas por separado y enviadas por el fabricante, CZ Vaccines (Porriño, España), mientras que la vacuna Mbv inactivada por calor (HIMB) y sus componentes (un adyuvante En pocas palabras, cada dosis de la vacuna HIMB (1 ml) consistió en una suspensión acuosa de 107 unidades formadoras de colonias (CFU) inactivadas por calor de la cepa de Mbv 1403 NEIKER (84-85 °C durante 45 minutos) emulsionada en el adyuvante MontanideTM ISA 50 V 2 (Seppic, Francia). Además, cada bacteria inactivada y productos de inmunización adyuvante se ajustaron a la misma dosis administrada en las vacunas Silirum® e HIMB. Por lo tanto, cada dosis (1 ml) de bacterias inactivadas (109 UFC del mapa 316F y 107 UFC de cepas de Mbv 1403) se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS), mientras que cada dosis de adyuvante MontanideTM (1 mL) (utilizada en las vacunas Silirum® e HIMB) se

Además, se preparó la cepa bovina Map 764 para el desafío, como lo describió anteriormente Fernández et al. (11). En pocas palabras, la cepa Map 764 se cultivó en caldo Middlebrook 7H9 enriquecido con ácido oleico-albúmina-dextrosa-catalasa al 10% (OADC) y 2 mg · L-1 Mycobactin J (7H9 OADC MJ) durante 3 semanas a 37 ± 1°C. Luego, los cultivos se cosecharon por centrifugación a 3.000 g durante 10 minutos, y los gránulos bacterianos se lavaron dos veces y se resuspendieron en PBS. Con el fin de interrumpir los grupos bacterianos, la suspensión resultante se pasó hacia arriba y hacia abajo a través de una aguja de calibre 27 varias veces y se revizó. La concentración bacteriana se estimó por la densidad óptica (O.D.) y la estimación de UFC de diluciones seriadas de 10 veces chapadas en 7H9 OADC MJ consolidado con agar. Finalmente, las suspensiones se ajustaron a 1,2 × 1010 UFC · mL-1 y se mantuvieron a 4 °C durante todo el período de desafío (2 semanas), y los grupos bacterianos se interrumpieron de nuevo antes de la inoculación oral, como se mencionó anteriormente.

Diseño experimental

En este estudio se utilizaron un total de 50 hembras de cabras de raza Murciano-Granadina de 1 mes de edad. Los animales fueron seleccionados de una bandada sin signos clínicos y dieron negativo para la paratuberculosis y tuberculosis en los últimos 10 años. Además, no se identificaron reactores positivos en las campañas anuales oficiales de erradicación de la tuberculosis, basadas en la prueba cutánea intradérmica, realizadas por las autoridades sanitarias animales regionales durante los últimos 5 años. El estado libre de paratuberculosis y tuberculosis de los animales de experimentación se confirmó utilizando el ensayo de inmunoabsorción enzimática de anticuerpos (ELISA) contra Map (ID Screen® Paratuberculosis indirecto, IDVet, Gabrels, Francia) y Mbv (INgezim Tuberculosis DR, Eurofins Technology, Madrid, España) y Después de un período de adaptación de 15 días en las instalaciones del Instituto de Ganadería de Montaña (IGM-ULE) en León (España), los niños de cabra fueron asignados al azar en corrales separados, sometidos a prácticas de gestión estándar, y su estado de salud y bienestar se revisaba diariamente.

Al principio del estudio, y de acuerdo con el protocolo de vacunación y/o infección que se debe seguir, las cabras se clasificaron en 10 grupos (n = 5) y se distribuyeron en diferentes corrales para evitar el contacto directo entre los grupos de acuerdo con el siguiente esquema (Figura 1):

www.frontiersin.orgFIGURA 1. Esquema de diseño experimental. Las cabras se dividieron en siete grupos y se vacunaron con diferentes componentes a los 0 días posteriores a la vacunación (dpv). Desde entonces, hasta el sacrificio (190 dpv), se tomaron muestras de sangre (B) en un intervalo de 30 días. Cinco cabras de cada grupo fueron desafiadas por vía oral con la cepa Map 764 a 45 dpv y divididas en 10 grupos: NV, no vacunadas y no infectadas; NVI, no vacunadas e infectadas; VS, Silirum® vacunadas y no infectadas; VSI, Silirum® vacunadas e infectadas; VH, HIMB vacunadas y no Finalmente, a 190 dpv, se recogieron heces (F) y se llevaron a cabo macha y necropsias completas para la recolección de muestras de tejido (T).

VS: Silirum® vacunado y no infectado

VSI: Silirum® vacunado e infectado

VH: HIMB vacunado y no infectado

VHI: HIMB vacunado e infectado

StrSI: inmunizado con la cepa Map 316F Silirum® e infectado

StrHI: inmunizado con la cepa Mbv 1403 HIMB e infectado

AdjSI: inmunizado con el adyuvante MontanideTM Silirum® e infectado

AdjHI: inmunizado con el adyuvante de la vacuna MontanideTM HIMB e infectado

NV: no vacunados y no infectados

NVI: no vacunados e infectados

No se incluyó a animales no infectados en grupos inmunizados con bacterias inactivadas o adyuvantes, debido al hecho de que el estudio se centró en la evaluación del efecto de los componentes de las vacunas en la protección, después de la infección del mapa, y esto implicaría la inclusión de un gran número de animales y grupos que obstaculizarían el estudio.

La vacunación se realizó al principio del experimento, el día 0, mediante una inyección subcutánea en la pechuga con 1 ml de vacuna Silirum®, 109 Map 316F cepas de la vacuna Silirum® CFU, 1 ml de adyuvante MontanideTM Silirum® (CZ Vaccines, Porriño, España), 1 ml de vacuna HIMB,

Cuarenta y cinco días después de la vacunación (dpv), los animales fueron desafiados por vía oral (Figura 1) utilizando una jeringa automática con una cantidad total de 1,2 × 1010 Mapa 764-CFU diluidos en 40 ml de PBS como se describió anteriormente por Fernández et al. (11), mientras que 40 ml de PBS se administraron por vía oral a A lo largo del ensayo experimental, todas las cabras fueron monitoreadas diariamente para detectar signos clínicos y muestreadas cada 30 días hasta el sacrificio (Figura 1). A 190 dpv, se realizaron necropsias completas y muestreo post mortem en todas las cabras después de ser sacrificadas humanamente por sedación profunda con xilazina (XILAGESIC®, Laboratorios Calier, Barcelona, España) y una posterior inyección intravenosa de T61® (MSD Animal Health, Salamanca, España) seguida de exsanguinación (Figura 1).

Colección de muestras

Las muestras de sangre se recogieron mensualmente de la vena yugular en los tubos de Vacutainer con heparina de litio (Becton Dickinson and Company, Reino Unido) y sin anticoagulante (Becton Dickinson and Company, Reino Unido). Luego, las muestras heparinizadas se procesaron inmediatamente para la prueba de liberación de IFN-γ en respuesta a los antígenos derivados de proteínas aviar (PPDa) y bovino (PPDb) a 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv (Figura 1). Al mismo tiempo, también se recogió sangre heparinizada para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (35) y su posterior caracterización por citometría de flujo. Además, se procesaron muestras no heparinizadas para las pruebas de determinación de anticuerpos Map (ID Screen® Paratuberculosis indirect, IDVet, Gabrels, Francia) y Mbv-específicas (INgezim Tuberculosis DR, Eurofins Technology, Madrid, España) a 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv (Figura

Las muestras fetales de cada cabra se recogieron por separado en guantes de plástico desechables directamente del recto a 190 dpv, antes de la eutanasia del animal, y se congelaron a -20 °C hasta su procesamiento para la detección de mapas a través del cultivo bacteriológico.

Los animales fueron sacrificados en el día 190 dpv y se realizó una necropsia regulada, ordenada y completa. Después del examen macrodo de las vísceras, se tomaron muestras de íleon (zonas proximal, media y distal), yéjuno (zonas proximal, media y distal), válvula ileocecal y parches de Peyer yeyuno (al menos tres parches de cada zona: proximal, medio y distal), junto con los ganglios linfáticos mes Además, también se recogieron y almacenaron muestras de íleon distal, parches de Peyer y ganglio linfáticos mesentéricos a -20 °C para el aislamiento del mapa por cultivo y la detección por reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR), así como procesadas inmediatamente para el aislamiento de leucocitos con el fin

Aislamiento de PBMC y leucocitos tisulares

Los PBMC se aislaron como se describió anteriormente (35). En pocas palabras, se centrifugaron 30 ml de sangre periférica heparinizada y los PBMC se aislaron por centrifugación de gradiente utilizando LymphoprepTM (STEMCELL Technologies®, Colonia, Alemania). Los PBMC resultantes se lavaron tres veces con PBS, y las suspensiones celulares se suspendieron en el medio RPMI1640 suplementado + GlutaMaxTM (Gibco, Paisley, Reino Unido) y se contaron en una cámara Neubauer y se ajustaron a una concentración final de 106 células · mL-1. Las muestras intestinales y los ganglios linfáticos mesentéricos se recogieron y lavaron en PBS durante la necropsia, se pusieron en tubos de halcón individuales que contenían 30 ml de medio rPMI1640 suplementado estéril, y se procesaron en el laboratorio dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Para el aislamiento de linfocitos tisulares, se abrieron 5 cm de parches de íleon y Peyer jejunal mostrando la mucosa y se lavaron con PBS hasta que se eliminaron los restos fecales, mientras que la grasa pericapsular se eliminó de los ganglios linfáticos. Se eliminó el exceso de tejido alrededor de cada parche de Peyer, y se raspó y picó la mucosa de los parches de íleon y Peyer. Además, 50 mg de tejido del ganglio linfático mesentérico se cortaron en trozos pequeños y se cortaron con una cuchilla de bisturí. El tejido picado se suspendió en 11 ml de PBS con EDTA (2 mM) y se procesó con una licuadora de estómago (Masticator, IUL) durante 2,5 minutos. Luego, 10 ml de la porción homogeneizada superior se pasaron a través del filtro de 40 μm (Thermo Fisher Scientific, Madrid, España), y la suspensión resultante se superponó en un volumen igual de LymphoprepTM y se centrifugó a 800 g durante 30 minutos sin parar ni aceleración. Las células de la capa de interfaz se lavaron tres veces con PBS/EDTA, se contaron en una cámara Neubauer y se suspendieron en RPMI1640 suplementado a una concentración final de 106 células · mL-1.

La viabilidad celular determinada por la exclusión del tinte azul de trypan fue generalmente >90% tanto para los PBMC como para los linfocitos tisulares (los datos no se muestran).

Respuesta inmune humoral periférica y mediada por células locales y periféricas

Las muestras enteras de sangre periférica heparinizada tomadas a 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv se procesaron dentro de las 3 horas posteriores a la recogida. Para cada animal, tres pozos de una placa de tejido de 24 pozos (Thermo Fischer Scientific, Rochester, NY) se llenaron con 1,5 ml de sangre cada uno y se mezclaron con 100 μL de PBS estéril (control negativo) o se estimularon con 100 μL de PPDa o PPDb (CZ Vaccines, Porr Después de 22 h de estimulación, las placas se centrifugaron a 750 g durante 15 minutos, y el plasma se recogió y almacenó a -20 °C hasta que se probara.

Para el análisis de la respuesta inmune local mediada por células, un total de 2 × 106 leucocitos mononucleares aislados de íleon, parches de Peyer y ganglio linfático mesentérico se sembraron por pozo en tres pozos cada uno de una placa de tejido de 24 pozos y se estimularon como se describe para la sangre completa. Después de 22 h de estimulación, las placas se centrifugaron a 750 g durante 15 minutos, y los supernatantes se recogieron y almacenaron a -20 °C hasta que se probaran.

La producción de IFN-γ en estos ensayos se evaluó por duplicado utilizando ELISA comercial para IFN-γ bovino siguiendo las instrucciones del fabricante (prueba de IFN-γ de Bovigam® Mbv para ganado, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.), y los valores de absorbancia se midieron espectrofotométricamente utilizando un lector ELISA ELX800 Los valores de O.D. se ajustaron dividiendo el valor de O.D. de plasma o sobrenadante por el valor de O.D. de control negativo de cada placa para evitar variaciones entre placas. Los resultados se expresaron como valores de índice aviar y bovino por medio del cociente entre el O.D. medio de PPDa o O.D. del plasma estimulado por PPDb, respectivamente, y el O.D medio del plasma de control negativo (11, 36).

Se permitió que las muestras de sangre no heparinizadas se coagularan y se retraieran, y el suero se almacenó a -20 °C hasta que se usara. Cada suero se probó anticuerpos específicos contra Map (37) y Mbv (38) utilizando pruebas ELISA comerciales (ID Screen® Paratuberculosis indirecto, IDVet, Gabrels, Francia; e INgezim Tuberculosis DR Eurofins Technology, Madrid, España, respectivamente) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como la relación S/P de los anticuerpos Map y Mbv calculada dividiendo la O.D. corregida de la muestra por la O.D. corregida del control positivo y multiplicándola por 100 (39).

Detección cuantitativa del mapa en tiempo real

El ADN se extrajo de 50 mg de íleon distal, parches de Peyer yenales y ganglio linfático mesentérico utilizando el kit de purificación de ADN del tejido Maxwell® 16 (Promega, WI, EE. UU.) con el instrumento Maxwell 16 (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Por lo tanto, el ADN se cuantificó utilizando el kit del sistema QuantiFluorTM ONEdsDNA (Promega, WI, EE. UU.) y el fluorómetro QuantusTM (Promega, WI, EE. UU.). El ADN extraído se diluyó a 50 ng · μL-1 y se almacenó a -20 °C hasta que se realizó la qPCR. Se extrajeron y cuantificaron el ADN genómico de 2 × 108 UFC del mapa y el de 50 mg de tejidos de un animal no infectado para generar una curva estándar.

La detección de la secuencia del mapa IS900 se realizó como se describió anteriormente por Arteche-Villasol et al. (40). Además, la cuantificación del ADN del mapa y la sensibilidad analítica de la qPCR se evaluaron mediante la construcción de una curva estándar diluida de 10 veces utilizando ADN map-genómica que va de 1.000 pg a 0,001 pg/reacción mezclada con 100 ng/reacción de ADN tisular de un animal no infectado. Las muestras se consideraron positivas cuando el pico de disociación (Tm) fue de 89,1 ± 1,5 °C y los ciclos umbral (Ct) fueron ≤ 37 (41, 42). Los resultados de la qPCR se analizaron utilizando 7500 Software v2.0.6 (Applied BiosystemsTM). La cantidad de ADN del mapa (pg) de cada pozo se calculó mediante la interpolación de sus valores de Ct con la curva estándar como se describió anteriormente (43), y la cantidad media se calculó a partir de ambos duplicados.

Mapa de cultivo de tejidos y febos

El íleon distal, los parches de Peyer jejunal y el ganglio linfático mesentérico de cada animal se probaron individualmente, mientras que las muestras fecales se agruparon en grupos de tres cabras cada una. Los segmentos de parche de íleon y Peyer (12 cm) y 2 gramos de ganglio linfático mesentérico se procesaron como se describe para el aislamiento de leucocitos tisulares y siguiendo los métodos descritos anteriormente (44). En pocas palabras, 2 g de cada grupo de muestras de tejido y heces se descontaminaron con 38 ml de cloruro de hexadecilpiridinio y se homogeneizaron en una licuadora de estómago (Masticator, IUL) durante aproximadamente 15 s. Después de 18 h de descontaminación, se utilizaron 200 μL de la suspensión para inocular dos tubos que contenían el medio de yema de huevo de Herrold suplementado con piruvato de sodio y micobactina J (MJ) y dos tubos que contenían 7H9 OADC suplementados con MJ, penicilina, anfotericina Los cultivos se incubaron a 37 °C ± 1°C, y el crecimiento se comprobó mediante un examen bajo un microscopio estereoscópico después de 8, 12, 16 y 20 semanas de post-noculación. Los cultivos se consideraron positivos si se observaban una o más colonias características del mapa en cualquier tubo. Las colonias aisladas en ambos medios fueron confirmadas por una PCR múltiplex en tiempo real que detectó secuencias de mapas IS900 e ISMap02(45).

Análisis citométrico de flujo de PBMC y leucocitos de tejido

Se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo de un solo color para la caracterización fenotípica de PBMC aislados a 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 190 dpv y leucocitos mononucleares aislados de íleon distal, parches de Peyer jejunal y ganglio linfático mesentérico. Un número total de 2 × 105 células por pozo se sembraron en una placa de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) y se incubaron con anticuerpos primarios contra los marcadores de superficie de los linfocitos detallados en la Tabla 1 durante 1 h a 4 °C. Después, las células se lavaron dos veces con PBS e incubaron con anticuerpos secundarios conjugados apropiados durante 1 hora a 4 °C (Tabla 1). Finalmente, las células se fijaron con un 1 % de CellFIXTM (Becton Dickinson and Company, Erembodegem, Bélgica) hasta que se analizaron. La adquisición de la muestra de 10.000 eventos se realizó utilizando un citómetro de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec®), donde los eventos se cerraron durante el análisis de adquisición como se describió anteriormente en otra parte (35) para descartar la presencia de aire y dobles. Luego, el análisis de los datos se llevó a cabo utilizando el MACSQuantify10 SoftwareTM (Miltenyi Biotec®), y los resultados se expresaron como porcentaje de células positivas.

www.frontiersin.orgTABLA 1. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados en el análisis de citometría de flujo de PBMC y subpoblaciones de linfocitos tisulares.

Examen histopatológico

Los tejidos fijos para el examen histopatológico se procesaron convencionalmente para la incrustación de parafina y se tiñeron con la técnica de hematoxilina-eosina y Ziehl-Neelsen para la detección de bacilos con rápido ácido (46).

Las lesiones consistentes con la infección de Map se clasificaron como focales, multifocales a y multifocales b, o formas difusas de acuerdo con la presencia y ubicación de los granulomas y siguiendo las pautas descritas anteriormente para los pequeños rumiantes (8, 46). En pocas palabras, las lesiones se caracterizaron como formas focales cuando los granulomas estaban restringidos al tejido linfoide de los parches de Peyer; formas multifocales cuando los granulomas estaban ubicados en la lámina propia adyacente al tejido linfoide (multifocal a) o no (multifocal b) y formas difusas cuando los granulomas se propagan a La clasificación de cada animal se basó en su lesión granulomatosa más grave. Después del examen histopatológico, el número de granulomas por sección de tejido se cuantificó en todas las muestras de tejido como se describe en otra parte (11, 46). Se seleccionaron tres secciones de tejido de cada sitio intestinal (es decir, íleon – zonas proximal, media y distal; zonas de yeyuno – proximal, media y distal; válvula ileoccal y parches de Peyer de Peyer proximal, media, y distal) y dos secciones de cada ganglio linfático (es decir, ganglios linfáticos mesentérico

Análisis estadístico

La distribución normal de los resultados de los anticuerpos específicos de Map y Mbv, la producción local y periférica de IFN-γ y la proporción de subpoblaciones de linfocitos periféricos y tisulares se evaluaron para determinar la normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk. Los datos de la producción de IFN-γ y las pruebas ELISA de anticuerpos se transformaron logarítmicamente. Luego, los resultados de la citometría de flujo y ELISA de la producción periférica de IFN-γ y anticuerpos se analizaron utilizando el procedimiento de modelo lineal generalizado (GLM) para evaluar los principales efectos de la vacunación, el desafío, el tiempo y sus interacciones. Posteriormente, las diferencias entre los grupos de vacunación para cada vez que se muestrearon se estimaron utilizando la corrección de Tukey-Kramer para comparaciones múltiples. Del mismo modo, los principales efectos de la vacunación, los tejidos y sus interacciones se estimaron en los resultados de la producción local de IFN-γ, seguida de la evaluación de las diferencias entre los grupos de vacunación y los tejidos utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer. Además, las diferencias entre los grupos en el número de cabras con lesiones se evaluaron utilizando las pruebas exactas χ2 y Fisher. Además, después de la transformación logarítmica, las diferencias en los recuentos de granulomas entre los grupos de vacunación se calcularon utilizando la prueba t de Student. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el software GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, EE. UU.) excluyendo los GLM que se realizaron utilizando el software R 3.5.3 (R Development Core Team, 2019). P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados
Respuesta inmunitaria periférica y de medios de células locales (IFN-γ)

Los resultados de GLM mostraron que los valores del índice aviar y bovino alcanzaron niveles significativos de 60 a 190 dpv en los grupos VS, VSI, VH y VHI (p < 0,001 y p < 0,01 respectivamente) (Figuras 2A,B). Además, la inmunización con la vacuna Silirum® (VS y VSI) y HIMB (VH y VHI) ejerció un efecto considerable sobre los valores del índice aviar, independientemente del estado de la infección (p < 0,01 y p < 0,001, respectivamente) (Figura 2A), pero solo los grupos VHI, VH y StrHI mostraron un efecto significativo en Además, el desafío oral impactó significativamente en los niveles de índice aviar de los grupos VSI, VHI (p < 0,001) y NVI (p < 0,05) y en los valores de índice bovino de los grupos VSI, VHI (p < 0,01) y StrHI (p < 0,05).

www.frontiersin.orgFIGURA 2. Cinética de la producción de IFN-γ por sangre completa estimulada con antígenos aviar (PPDa) y bovino (PPDb). Los resultados se expresan como valores del índice O.D. aviar (A) y bovino (B) de cada grupo de vacunación (n = 5) (NV, no vacunados y no infectados; NVI, no vacunados e infectados; VS, Silirum® vacunados y no infectados; VSI, Silirum® vacunados e infectados; VH, HIMB La línea roja de puntos vertical representa el tiempo del desafío oral del mapa (45 dpv). Las diferencias significativas determinadas por comparaciones múltiples se representaron como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001,****p < 0,0001.

El análisis de comparaciones múltiples mostró que el grupo VSI tenía valores de índice aviar más altos que NV, NVI, StrSI, AdjSI y AdjHI a 60 y 120 dpv, mientras que el grupo VS mostró estas diferencias solo a 120 dpv (Figura 2A). Por el contrario, estos grupos no mostraron ninguna diferencia significativa en los niveles del índice bovino (Figura 2B). Además, no se observaron diferencias entre VS y VSI ni en los valores del índice aviar o bovino en ningún momento. Por otro lado, el grupo VHI mostró valores de índice aviar mayores que NVI, NV, StrSI, AdjSI y AdjHI a 120 dpv (Figura 2A). Además, los valores del índice bovino de este grupo fueron significativamente más altos que NV, NVI, StrSI, AdjSI y AdjHI en 90, 120, 150 y 190 dpv y mayores que VH a 120 dpv (Figura 2B).

La producción local de IFN-γ en leucocitos mononucleares purificados de tejidos y estimulados con PPDa y PPDb fue menor que la observada en los PBMC. Además, los valores del índice aviar fueron más heterogéneos que los niveles de índice bovino debido a la mayor variabilidad individual observada en el primero (Figuras 3A,B), específicamente en los grupos NVI, VH, VHI, StrHI y AdjSI (Figura 3A). Los parches de Peyer y el ganglio linfático mesentérico del grupo NVI mostraron los valores más altos del índice aviar seguidos del íleon, los parches de Peyer y el ganglio linfático mesentérico del grupo StrHI (Figura 3A). Sin embargo, el análisis estadístico no mostró ningún efecto significativo de la vacunación o la ubicación de los tejidos en los valores del índice aviar o bovino (p > 0,05). Además, tampoco se observaron diferencias significativas entre los grupos vacunados en el análisis de comparaciones múltiples (p < 0,05). Mientras tanto, se observaron diferencias significativas en los valores del índice aviar dentro del grupo NVI, donde la producción de IFN-γ fue mayor en los parches de Peyer y el ganglio linfático mesentérico que en el íleon (p < 0,05) (Figura 3A). Además, a pesar de la alta variabilidad dentro de los grupos observados en los valores del índice bovino, los valores del ganglio linfático mesentérico del grupo VH fueron considerablemente más altos que los de los parches de íleon y Peyer (p < 0,01) (Figura 3B).

www.frontiersin.orgFIGURA 3. Producción de IFN-γ por leucocitos de íleon (IL), parches de Peyer yeyuno (JPP) y ganglio linfático mesentérico (MLN) estimulados con antígenos aviar (PPDa) y bovino (PPDb). Los resultados se expresan como valores del índice O.D. aviar (A) y bovino (B) de cada grupo de vacunación (n = 5) (NV, no vacunados y no infectados; NVI, no vacunados e infectados; VS, Silirum® vacunados y no infectados; VSI, Silirum® vacunados e infectados; VH, HIMB Las barras y las líneas verticales representan valores medios y desviaciones estándar, respectivamente. Las diferencias significativas determinadas por comparaciones múltiples se representaron como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001,****p < 0,0001.

Respuesta Humoral Periférica

Los resultados de GLM estimaron que tanto la producción de anticuerpos específicos de Map como la Mbv alcanzó niveles significativos de 60 a 190 dpv (p < 0,001 y p < 0,0001, respectivamente) en los grupos vacunados con Silirum® e HIMB (Figuras 4A,B). Además, el desafío oral aumentó la producción de anticuerpos específicos de Map en los grupos vacunados VSI, VHI (p < 0,001) y NVI (p < 0,05) (Figura 4A) y la producción de anticuerpos específicos de Mbv en VHI (p < 0,001) (Figura 4B). Además, el análisis de comparaciones múltiples mostró que solo VSI tenía valores S/P específicos de Map significativamente más altos en comparación con los grupos inmunizados con adyuvantes, bacterias inactivadas y no vacunados a 90, 120, 150 y 190 dpv, mientras que no se observaron diferencias significativas en VHI (Figura 4A). Además, no se observaron diferencias significativas en los niveles de anticuerpos de Map, ni entre los grupos de vacunación de Silirum® e HIMB ni entre los grupos vacunados infectados y no infectados.

www.frontiersin.orgFIGURA 4. Cinética de los niveles de anticuerpos séricos de sangre periférica. Los resultados se expresan como relación S/P de anticuerpos específicos del Mapa (A) y Mbv (B) de cada grupo de vacunación (n = 5) (NV, no vacunados y no infectados; NVI, no vacunados e infectados; VS, Silirum® vacunados y no infectados; VSI, Silirum® vacunados e infectados; VH, HIM La línea roja de puntos vertical representa el tiempo del desafío oral del mapa (45 dpv). Las diferencias significativas determinadas por comparaciones múltiples se representaron como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001,****p < 0,0001.

Los valores de S/P específicos de Mbv fueron significativamente más altos al comparar el grupo VHI con los grupos VS, VSI, StrSI, StrHI, AdjSI y AdjHI en 60, 90, 120, 150 y 190 dpv (Figura 4B). Sin embargo, solo se observaron diferencias significativas entre VHI y VH a 120, 150 y 190 dpv (Figura 4B).

PCR cuantitativa y bacteriología de tejidos y heces

La detección del mapa se confirmó mediante qPCR (n = 4) y cultivo bacteriológico (n = 3) en cabras infectadas (n = 35). Los animales positivos a qPCR correspondieron a (i) dos cabras de StrHI (núdico linfático mesentérico y los parches de Peyer, respectivamente), (ii) una de VHI ( parches de Peyer) y (iii) una de AdjSI ( parches de Pey). Además, los animales positivos para el cultivo bacteriológico correspondían a una cabra cada uno de NVI, VHI (ileum, parches de Peyer y positivos de ganglio linfáticos mesentérico) y VSI (positivos de íleon y ganglios linfáticos mesentéricos). Solo los parches Peyer de la cabra de VHI mostraron resultados positivos para ambas técnicas de detección. Todas las muestras de tejido de grupos no infectados fueron negativas a la amplificación de la secuencia IS900 por qPCR o cultivo bacteriológico. La cultura bacteriológica de Map fue negativa en todas las muestras fecales analizadas.

Subconjuntos relativos de linfocitos de sangre y tejidos periféricos

Las desviaciones medias y estándar de las proporciones relativas de tres linfocitos T (CD4+, CD8+ y CD3+), un linfocitos T γδ y dos linfocitos B (CD21+ y CD20+) marcadores de superficie se estimaron mediante citometría de flujo.

En todos los grupos, la proporción relativa más alta de células positivas en PBMC aisladas de sangre completa correspondió a linfocitos T γδ (30,46 % ± 3,55%), mientras que la proporción más baja se observó en linfocitos B CD20+ (5,96 ± 1,48%) a lo largo del estudio (Tabla complementaria 1). Sin embargo, a pesar de que el análisis estadístico mostró oscilaciones significativas (p < 0,001) de las proporciones relativas de linfocitos CD4+, CD8+, WC1+, CD21+, CD3+ y CD20+ en diferentes muestreos, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p > 0,05).

La citometría de flujo realizada en células purificadas a partir de muestras de tejido mostró que los niveles de proporción relativa más altos correspondían a los linfocitos B CD21+ en el íleon (39,47 ± 4,71%), parches de Peyer (26,81 ± 3,59%) y los ganglios linfáticos mesentéricos (44,90 ± 3,5 El análisis estadístico mostró una influencia significativa de la vacunación y la inmunización con bacterias inactivadas y adyuvantes en la proporción relativa de subconjuntos de linfocitos tisulares (p < 0,05). Sin embargo, los resultados de las comparaciones entre grupos no mostraron un patrón claro entre la proporción relativa de subpoblaciones de linfocitos y los diferentes grupos probablemente debido a la variabilidad individual observada dentro de los grupos. La media, la desviación estándar y los resultados de las comparaciones múltiples de las subpoblaciones relativas de linfocitos en íleon, los parches de Peyer y los ganglios linfáticos mesentérico se resumen en las tablas suplementarias 2-4.

Hallazgos patológicos

No se encontraron lesiones gruesas compatibles con la paratuberculosis en ningún animal. Se detectaron lesiones granulomatosas microscópicas características de la infección de Map en todos los grupos infectados, con diferencias en la gravedad y la distribución. El número de cabras por grupo con lesiones según el tejido y el número de cabras por grupo clasificadas en términos de gravedad de las lesiones se muestran en la tabla 2. Las cabras con granulomas pequeños y bien definidos compuestos de macrófagos, con un abundante citoplasma pálido y un núcleo grande, escoltados por unos pocos linfocitos ubicados exclusivamente en el área interfolicular del tejido linfoide intestinal, se clasificaron como focales (n = 5) (Figura 5A). Además, las cabras con granulomas bien definidos en el área interfollicular de los parches de Peyer y también en la lámina propia estrechamente asociada con el tejido linfoide intestinal se clasificaron como multifocal a (n = 5) (Figura 5B). Finalmente, la presencia de lesiones granulomatosas no solo en los parches de Peyer y la lámina propia relacionada, sino también en áreas de la mucosa sin ninguna asociación con el tejido linfoide se consideró multifocal b (n = 13) (Figura 5C). No se notaron lesiones difusas en los tejidos de ninguna cabra (n = 0). Los grupos VSI y VHI fueron los menos afectados, ya que solo un animal de cada grupo desarrollaba lesiones granulomatosas, mostrando diferencias significativas en comparación con las NVI en las que las lesiones estaban presentes en todos los animales (p < 0,05). Además, las lesiones de la cabra VSI se clasificaron como focales, mientras que la cabra del grupo VHI mostró lesiones más graves, categorizadas como multifocal b como todas las cabras de la NVI. Además, la mayoría de las cabras inmunizadas con cepas (StrSI y StrHI) desarrollaron formas b multifocales, excepto un animal de StrHI con una lesión focal. Por el contrario, entre los animales inmunizados con adyuvantes (AdjSI y AdjHI), solo un animal del AdjSI mostró lesiones b multifocales, mientras que se encontraron lesiones afocales y multifocales en las cabras restantes. No se detectaron diferencias significativas en el número de cabras con lesiones granulomatosas en grupos inmunizados con bacterias inactivadas o adyuvantes (p > 0,05). Las lesiones granulomatosas se localizaron principalmente en los parches de Peyer jejunales, seguidos de íleon distal, ganglios linfáticos, válvula ileocecal y yeyuno, aunque las lesiones observadas en los ganglios linfáticos siempre se asociaron con la presencia de lesiones granulomatosas en el intestino (Tabla 3). No se observaron lesiones microscópicas en los grupos que permanecieron como no infectados. No se detectaron bacilos de alta velocidad del ácido en las lesiones de ninguna de las cabras infectadas.

www.frontiersin.orgTABLA 2. Número de animales de cada grupo con lesiones microscópicas consistentes con la paratuberculosis según el tejido examinado y su gravedad (focal, multifocal a, multifocal b y difuso).

www.frontiersin.orgFIGURA 5. Tipos de lesiones granulomatosas paratuberculosas encontradas en el estudio. (A) Lesión focal: granulomas bien demarcados compuestos por pequeños grupos de macrófagos ubicados en el área interfollicular de los parches de Peyer. (B) Lesión multifocal a: pequeños granulomas ubicados en el área interfollicular del tejido linfoide (asterisco) y en la lámina propia asociada (cabezas de flecha). (C) Lesión multifocal b: granulomas ubicados en la lámina propia en un área desprovista de tejido linfoide.

www.frontiersin.orgTABLA 3. Resultados del recuento de granulomas. Número de granulomas según su ubicación para cada grupo y número total y porcentaje (%) de granulomas por grupo.

El número total de granulomas por grupo se resumió en la tabla 3. El grupo NVI mostró el número más alto, mientras que el más bajo correspondió a los grupos VSI y VHI. Además, el número de granulomas observados en los grupos StrSI y StrHI fue mayor que el observado en AdjSI y AdjHI. Se observaron diferencias significativas en el número medio de granulomas por grupo (Figura 6) entre los grupos NVI (159,60 ± 271,90) y VSI (4,60 ± 10,29) y VHI (6,20 ± 13,86) (p < 0,05). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en los grupos StrSI (57,60 ± 61,54), StrHI (61,40 ± 83,22), AdjSI (20,00 ± 26,82) y AdjHI (29,20 ± 33,86) (p > 0,05).

figura 6

www.frontiersin.orgFIGURA 6. Recuento medio de granulomas de los tejidos de los grupos vacunados e infectados. Los datos se expresan como número medio de granulomas por grupo, y las desviaciones estándar en cada grupo (n = 5) y las diferencias significativas se representaron como *p < 0,05, **p <0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Discusión

Los estudios de vacunación contra la paratuberculosis realizados en rumiantes han demostrado resultados valiosos en la reducción del número de animales clínicamente afectados y la prevalencia de la enfermedad (16, 23). Sin embargo, la incapacidad de la respuesta inmune protectora provocada por la vacunación para prevenir completamente la infección y su progresión y propagación es alienante del término «vacuna ideal» (47, 48). Esta desventaja se debe en parte a la falta de conocimiento sobre los mecanismos periféricos y locales relacionados con el éxito o el fracaso de la protección contra las micobacterias. Aquí, este trabajo analiza la respuesta inmunitaria local y periférica provocada por la vacunación homóloga (Silirum®) y heteróloga (vacuna HIMB) y la inmunización con sus componentes por separado y su relación con el grado de protección estimado por la evaluación de las lesiones granulomatosas microscópicas y la presencia de Map en los tejidos.

A pesar de la identificación de lesiones granulomatosas paratuberculosas distintivas en todos los grupos de cabras infectadas, independientemente de su estado de vacunación o inmunización, la variación en su gravedad refleja las observaciones de los estudios de campo y experimentales, ya que las lesiones observadas en las cabras vacunadas con paratuberculosis fueron leves (focales) y escasas, mientras que No se observaron lesiones difusas, posibles debido al corto período de incubación de este trabajo (3-5 meses), en línea con otros estudios en los que se observaron lesiones b multifocales hasta 7 meses después de la infección, mientras que las lesiones de tipo difuso no se notificaron hasta los 12 meses (46, 49). A pesar de este hecho, los resultados obtenidos aquí coinciden con otros estudios experimentales en los que las lesiones observadas en animales vacunados se limitaron a formas regresivas (focales), contenidas en el área interfollicular del tejido linfoide intestinal, evitando su diseminación a través del intestino, pero sin prevenir la infección, como se confirmó por la detección de Map en los tejidos de

Hasta la fecha, los estudios de eficacia de la vacunación in vivo se han centrado principalmente en la inducción temprana y sostenida de IFN-γ periférico (20, 21, 52), ya que la liberación de esta citocina se ha asociado con la activación de los mecanismos antimicobacterianos y la prevención del crecimiento bacteriano intracelular (53, 54). Ciertamente, la dinámica de producción de IFN-γ observada en los grupos vacunados con Silirum® (es decir, VS y VSI) fue consistente con otros estudios realizados con niños caprinos vacunados con vacunas muertas por calor (52, 55). Además de la respuesta inmune mediada por células, los animales vacunados con Silirum® también mostraron un aumento de los niveles de anticuerpos Map. Se ha subestimado el papel de la respuesta humoral, ya que se ha considerado ineficaz contra los patógenos intracelulares (56, 57). Sin embargo, un número emergente de estudios realizados en condiciones experimentales han sugerido el efecto positivo potencial de los anticuerpos en el control de la paratuberculosis, incluso en relación con la vacunación (58-60). Esto está respaldado por la fuerte respuesta humoral inicial observada en ovejas vacunadas con paratuberculosis y la capacidad de estos animales para modular esa respuesta en etapas posteriores para prevenir la progresión de la infección (60). Tanto las respuestas celulares como las humorales mejoraron significativamente en este estudio después de un desafío experimental con Map. Estos resultados imitan el aumento de IFN-γ observado en cabras vacunadas con paratuberculosis y expuestas de forma natural en condiciones de campo (61), aunque el aumento significativo en la producción de anticuerpos después del desafío oral de Map aquí observado contrasta con estudios anteriores en los que la infección oral experimental en ovejas vacunadas no mostró diferencias con animales no vacunados o incluso con Sin embargo, las mayores respuestas celulares y humorales observadas aquí no impidieron la aparición de lesiones granulomatosas en el grupo VSI. Por lo tanto, a pesar de que la vacunación podría estar limitando la progresión y la gravedad de las lesiones, ya que solo una cabra VSI desarrolló un bajo número de granulomas focales, la respuesta celular y humoral periférica no permitió predecir la presencia de lesiones o infección en animales vacunados.

Además, los cambios en la proporción relativa de subpoblaciones de linfocitos también se han relacionado con infecciones micobacterianas (62-64). En este sentido, las vacas con enfermedad clínica han mostrado proporciones más bajas de linfocitos T CD4+, CD8+ y γδ que las vacas subclínicas en PBMC recién aislados (65). Además, en otro estudio, se detectaron porcentajes más altos de linfocitos γδ T y B y una disminución del CD4+ en los tejidos de ovejas infectadas durante la infección experimental temprana de Map (10). Con respecto al efecto de la vacunación, se ha informado que la infección de ovejas vacunadas por Gudair® con Map conduce a una disminución en las proporciones de linfocitos periféricos CD4+ y B a los 13 días posteriores a la desafío evaluados en PBMC estimulados in vitro Map, pero esto no se evaluó en células no estimuladas y recién aisladas (22). Por el contrario, no se detectaron cambios en la proporción relativa de linfocitos T periféricos (CD4+, CD8+, γδ y CD3+) o de linfocitos B (CD20+ y CD21+) en PBMC recién aislados entre ningún grupo en este estudio. Además, se estimaron diferencias en la proporción relativa tisular de las subpoblaciones de linfocitos, pero no se observó una relación clara entre estos resultados y la vacunación/inmunización y/o infección, probablemente debido a la alta variabilidad individual dentro de los grupos probados. Del mismo modo, no se observó ninguna relación entre la producción local de IFN-γ y el desarrollo de lesiones ni en VSI u otros grupos infectados. En este sentido, solo los parches de Peyer y el ganglio linfático mesentérico del grupo NVI produjeron una producción de IFN-γ ligeramente mayor. Este resultado es consistente con el mayor número de granulomas detectados en este grupo, ya que un mayor número de lesiones granulomatosas se han relacionado con un mayor número de células inmunomarcadas por IFN-γ (6) y es probable que las lesiones presentes en los grupos infectados restantes no sean suficientes para generar una respuesta inmune sustancial mediada por células locales en respuesta a los antígeno Por lo tanto, ni las respuestas inmunitarias celulares y humorales periféricas, ni la evaluación de la proporción relativa de subpoblaciones de linfocitos en sangre y tejidos enteros, ni la producción local de IFN-γ, fueron capaces de predecir aquellos animales que permanecen desprotegidos temprano después de la infección. Además, se ha demostrado que la vacunación reduce el número de bacterias excretadas tanto en condiciones de campo como experimentales (17, 21, 37, 66). En este estudio, Map no se aisló en las heces de ninguna cabra. Se ha detectado un mayor desprendimiento del mapa en relación con el desarrollo de lesiones graves y signos clínicos en animales infectados de forma natural y experimental (67, 68), aunque podría detectarse de forma intermitente en animales con paratuberculosis subclínica (53, 69). Sin embargo, las heces se recogieron solo en el sacrificio (145 días después de la infección), por lo que la presencia de Map podría haberse subestimado debido al corto tiempo posterior al desafío y al tiempo limitado de muestra. Además, se ha observado que la excreción fecal se asocia con frecuencia con animales con un alto número de tejidos positivos para el cultivo y lesiones graves (70). Además, el bajo número de tejidos Map positivos detectados por cultivo bacteriológico o qPCR (7 de 35 cabras infectadas) no fue sorprendente, ya que en varios trabajos anteriores, ya sea en casos naturales o experimentales (46, 71), se ha demostrado que la carga bacteriana en animales con lesiones similares a las encontradas en este estudio estaba ausente o era muy baja.

Curiosamente, solo una cabra del grupo VHI desarrolló lesiones granulomatosas paratuberculosis, aunque clasificadas como b multifocal, que muestra la eficacia de la protección heteróloga que la vacunación contra la tuberculosis confiere contra la infección de Map. Al igual que la vacunación homóloga, los grupos vacunados con HIMB (es decir, VH y VHI) mostraron una producción significativa de IFN-γ y anticuerpos como se describió anteriormente en cabras (66, 72), incluso cuando la sangre se estimuló con PPDa. Además, también se observó un aumento en la producción de IFN-γ en cabras vacunadas por vía subcutánea con la vacuna HIMB y desafiadas endobronquialmente con una micobacteria estrechamente relacionada (M. caprae) en condiciones experimentales (66), lo que demuestra una vez más que la elevación de estas respuestas no garantiza el éxito de la vacunación, ya El efecto de protección cruzada relacionado con la vacunación se ha notificado anteriormente, ya que se observó una reducción de las lesiones pulmonares en cabras vacunadas con paratuberculosis (32) o terneros (33) infectados endobronquialmente con M. caprae o Mbv, respectivamente. Además, a pesar de este efecto beneficioso, se observó una reacción cruzada contra los antígenos micobacterianos estándar en el ensayo de liberación de IFN-γ y en la determinación de anticuerpos específicos de Map e implicó una desventaja relevante para la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DIVA) (31). Esta reacción cruzada se ha descrito previamente en respuesta a los antígenos micobacterianos PPDa y PPDb, aunque generalmente esta producción está sesgada hacia el antígeno relacionado con la estimulación homóloga (73-75). Es notable que se detectaran anticuerpos específicos contra Mbv solo en el grupo VHI y, durante un corto tiempo, en el grupo VH, mientras que se encontraron fácilmente anticuerpos específicos contra Map no solo en el grupo VSI, sino también en los grupos VS, VH y VHI. Los avances recientes en la evaluación de proteínas recombinantes para las pruebas serológicas de Mbv, como la utilizada aquí (MBP83), han permitido minimizar la reacción cruzada inducida por la vacunación contra la paratuberculosis en el diagnóstico de tuberculosis (38, 76). Por lo tanto, el desarrollo y el uso/implementación de antígenos más específicos (reactivos DIVA) tanto para el ensayo IFN-γ como para la detección de anticuerpos son necesarios para mejorar el diagnóstico inmunológico de paratuberculosis y tuberculosis y para superar las interferencias producidas por la vacunación (31).

Al abordar el efecto de las cepas inactivadas de Silirum® e HIMB individualmente, se observó que las cabras de StrSI y StrHI mostraron un mayor número de lesiones granulomatosas que afectaban a un mayor número de animales que las de los grupos VSI o VHI. Además, a pesar del hecho de que el número de granulomas fue menor que en las cabras de las NVI, estos también se clasificaron como b multifocales, lo que demuestra la progresión de la infección en estos grupos. Con respecto a las respuestas inmunitarias periféricas, solo el grupo StrHI mostró altos niveles periféricos de IFN-γ en respuesta a ambos antígenos micobacteribacterianos, pero no a la producción de anticuerpos periféricos, lo que podría sugerir la capacidad de esta cepa para estimular solo la respuesta inmunitaria celular periférica. En este sentido, en un estudio realizado en ganado, la administración oral de la cepa inactivada Mbv 1403 suspendida en PBS no mostró un aumento de la producción de IFN-γ en respuesta al antígeno bovino, mientras que la inmunización parenteral con esta cepa homogeneizada en el adyuvante MontanideTM ISA 50 V 2 (vacuna HIMB) mostró una elevación Por el contrario, no se detectaron respuestas inmunitarias celulares o humorales periféricas evidentes en el grupo StrSI, aunque IFN-γ aumentó a 150 dpv. En este sentido, es factible que este aumento tardío fuera el efecto de la infección de Map en lugar de la inmunización en sí, ya que los animales con la respuesta inmune periférica mediada por células más alta correspondían a aquellos con las lesiones granulomatosas más numerosas (datos no mostrados). Por lo tanto, esta respuesta inmunitaria periférica limitada provocada por las bacterias inactivadas podría ser una consecuencia de su débil inmunogenicidad en ausencia de adyuvantes (78, 79).

Además, la inmunización con adyuvantes (es decir, AdjSI y AdjHI) en ausencia de antígenos bacterianos dio lugar a un menor número de lesiones granulomatosas que en el grupo StrSI, StrHI o incluso NVI. Además, estas lesiones se clasificaron principalmente como a focal y multifocal, y solo un animal del AdjSI desarrollaba lesiones b multifocales. En este sentido, no se detectaron respuestas inmunitarias celulares o humorales periféricas significativas en grupos inmunizados adyuvantes. Esto está de acuerdo con un estudio anterior en el que no se registró ninguna respuesta inmunitaria periférica específica en terneros inmunizados adyuvantes MontanideTM ISA 50 V 2 (80). Sin embargo, solo AdjSI mostró un aumento posterior en la respuesta periférica IFN-γ (150 dpv) y los anticuerpos específicos de Map (190 dpv) posiblemente asociados con la presencia de lesiones multifocales a y b en contraste con AdjHI que mostraron principalmente lesiones focales similares al grupo VSI, aunque el principal efecto de los adyuvantes no se pudo Esto es similar al aumento posterior observado en StrSI, StrHI y NVI, en los que también se detectaron lesiones b multifocales. Por lo tanto, es posible que el mayor número y extensión de las lesiones en estos grupos se correlacionara con una mayor respuesta de los linfocitos sensibilizados que podrían haber migrado del intestino a la sangre, como se había planteado anteriormente (6).

El papel principal de los adyuvantes de aceite mineral en la vacunación es aumentar la respuesta inmune a través de la liberación sostenida del antígeno en el lugar de la inyección, asegurando la estimulación constante de la respuesta inmunitaria (78). Los adyuvantes MontanideTM, tal como se utilizan aquí, provocan un liposoma que protege el antígeno inactivado de la degradación, lo que lo lleva a drenar los ganglios linfáticos a través del reclutamiento de células y linfocitos que presentan antígenos (79). Sin embargo, se han notificado diferencias en los perfiles de respuesta inmunitaria dependiendo del tipo de adyuvante MontanideTM (25, 81, 82). Por ejemplo, las respuestas de anticuerpos específicos de IFN-γ y Map específicas del antígeno provocadas por la vacunación de ovejas con cepa Map 316F muerta por calor combinada con MontanideTM ISA 50 V 2 fueron más bajas que las provocadas por la vacunación con la vacuna comercial Gudair® (MontanideTM ISA 103 y 80) (25). Estas diferencias podrían estar relacionadas con la composición de los adyuvantes (tipo de ácidos grasos o emulsionante) y la intensidad de la respuesta inflamatoria en el lugar de la inyección, sin embargo, y a pesar de su importancia en la formulación de la vacuna, su interacción primaria con la respuesta inmunitaria del huésped aún no se entiende completamente, ya que su efecto a menudo se estudia Por esa razón, a pesar de la ausencia de diferencias estadísticas debido a la alta variabilidad individual, es sorprendente que el número y la gravedad limitados de las lesiones granulomatosas en los grupos AdjSI y AdjHI sin la liberación de un antígeno fueron bastante similares a las observadas en los grupos VSI y VHI. En un estudio realizado en terneros, solo dos de los seis terneros inmunizados con MontanideTM ISA 50 V 2 mostraron un cultivo positivo de Mbv en los ganglios linfáticos preescapulares derechos después del desafío intranodular Mbv (80), lo que sugiere que el adyuvante podría limitar, en cierta medida, la propagación de la infección Se sabe que la aplicación de adyuvantes de agua en aceite mostró un claro efecto estimulante sobre la respuesta inmunitaria del huésped antes de la inmunización con un antígeno (27). Sin embargo, en ausencia de una respuesta inmune periférica o local clara y específica, es tentador plantear la hipótesis de que esta respuesta inmune protectora podría estar mediada por mecanismos inespecíficos que podrían ayudar al huésped a controlar la infección micobacteriana. Este mecanismo es desconocido, pero otras células inmunitarias, como las células presentadoras de antígenos (es decir, macrófagos, células dendríticas) podrían estar mediando en esta respuesta a medida que se reclutan en el sitio de inoculación (26) y posiblemente se están activando debido a la respuesta inflamatoria. De hecho, se ha planteado la hipótesis de que estas células pueden estar involucradas en el desarrollo de una respuesta inmune «entrenada» caracterizada por su respuesta aumentada e inespecífica después de la reinfección independientemente de la respuesta inmune adaptativa de la memoria (83).

En conjunto, este estudio ha evaluado los perfiles inmunológicos de dos vacunas inactivadas por calor contra la paratuberculosis y la tuberculosis antes y después del desafío Map. Nuestros resultados destacaron el hecho de que los predictores como la respuesta periférica y local de IFN-γ, la producción de anticuerpos periféricos y la evaluación periférica y local de las subpoblaciones de linfocitos no pueden evaluar el resultado de la vacunación, ya que solo se evalúa de manera efectiva mediante la evaluación de lesiones microscópicas que ha demostrado ser un método eficaz para estimar el estado Sin embargo, tanto la vacunación homóloga como la vacunación heteróloga fueron capaces de conferir una alta respuesta inmunitaria protectora contra la infección de Map, limitando la progresión de las lesiones granulomatosas y, además, demostrando el beneficio potencial de la vacunación contra la tuberculosis en el control de la paratuberculosis. En este sentido, se necesitan más estudios centrados en la reducción de las interferencias en las pruebas serológicas utilizadas para el diagnóstico de paratuberculosis y tuberculosis, posiblemente dirigidos a rutas de vacunación alternativas o diferentes adyuvantes utilizados. Además, se observó un efecto interesante en la reducción del número y la gravedad de las lesiones de paratuberculosis granulomatosas en grupos inmunizados con adyuvantes de aceite mineral altamente refinado. Por lo tanto, se necesitan más estudios para evaluar el efecto de cada componente de la vacuna que podría estar involucrado en la protección contra las micobacterias.

Declaración de disponibilidad de datos

Los autores pondrán a disposición los datos sin procesar que respaldan las conclusiones de este artículo, sin reservas indebidas.

Declaración ética

El estudio sobre animales fue revisado y aprobado por el Subcomité de Experimentos y Bienestar Animal de la Universidad de León (ULE) (OEBA-ULE-016-2017).

Contribuciones del autor

VP, JB, DG-E y NA-V diseñaron y llevaron a cabo el experimento. JE ayudó en el análisis estadístico. VP, JB, DG-E, NA-V, RV y MF participaron en las necropsias, así como en la recolección y el análisis de muestras de sangre y tejido. El mapa del inóculo y la preparación de la vacuna HIMB fueron llevadas a cabo por NE e IS que, junto con NA-V, participaron en el análisis bacteriológico. El manuscrito fue escrito por VP, JB, DG-E y NA-V. La versión final enviada fue leída y aprobada por todos los autores.

Financiación

Este trabajo contó con el apoyo financiero del Ministerio de Ciencia e Innovación de España (proyectos AGL2015-66540-C2-1-R y RTI2018-099496-B-I00), la Junta de Castilla y León (proyecto LE259P18) y el Instituto Nacional de Investigación Agronómica (proyecto RTA 2017-00089-00-00). NA-V recibió un contrato de predoctorado (BES-2016-076513) del Ministerio de Ciencia e Innovación de España y la DG-E y JE de un contrato postdoctoral del Ministerio de Ciencia e Innovación (subvenciones núms. FJCI-2017-32020 y FJC2019-042422-I, respectivamente).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias al personal del Instituto de Ganadería de Montaña (CSIC-ULE) por la entrega de los animales de experimentación. También damos las gracias a CZ Vaccines por proporcionar los productos de inmunización utilizados en el estudio. Además, queremos dar las gracias al personal del laboratorio de técnicas instrumentales de la Universidad de León y la ayuda técnica de Carmen Agudín, Marta Silva, María Teresa Carro, Elena Molina y Ainara Badiola.

Material complementario

El material complementario de este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2021.744568/full#supplementary-material

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Palabras clave: vacunación, paratuberculosis, tuberculosis, HIMB, adyuvante, protección cruzada

Cita: Arteche-Villasol N, Gutiérrez-Expósito D, Elguezabal N, Sevilla IA, Vallejo R, Espinosa J, Ferreras MC, Benavides J y Pérez V (2022) Influencia de las vacunas heterólogas y homólogas, y sus componentes, en la respuesta inmune del huésped y la protección contra la paratuberculosis experimental de la cabra Veterinario. Sci. 8:744568. doi: 10.3389/fvets.2021.744568

Editado por:

Francisco Javier Salguero, Salud Pública, Inglaterra, Reino Unido

Revisado por:

Beatriz Vidana, Universidad de Bristol, Reino Unido
Mourad Tayebi, Universidad Occidental de Sídney, Australia

Copyright © 2022 Arteche-Villasol, Gutiérrez-Expósito, Elguezabal, Sevilla, Vallejo, Espinosa, Ferreras, Benavides y Pérez.

*Correspondencia: Noive Arteche-Villasol, nartv@unileon.es

†Estos autores han contribuido por igual a este trabajo

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