Introducción

El sistema inmunitario adaptativo posee múltiples mecanismos para contener las infecciones virales. Las respuestas celulares suelen ser críticas para el aclaramiento de las células infectadas por el virus. Las células T citotóxicas pueden reconocer los péptidos virales presentados en la superficie celular y eliminar las células infectadas (1). La producción de anticuerpos neutralizantes también se asocia a menudo con la protección de enfermedades virales (2). La unión de anticuerpos neutralizantes a la partícula viral puede bloquear la unión del virus a la célula huésped, perjudicar la fusión del virus con la membrana de la célula huésped y/o eliminar las partículas del virus a través del mecanismo dependiente de Fc, como la activación del complemento (2, 3). La producción de anticuerpos no neutralizantes también puede contribuir a la protección en algunas enfermedades virales (4). Los anticuerpos no neutralizantes pueden reconocer los antígenos virales expresados en la superficie celular de las células infectadas y mediar en la citotoxicidad, ya sea a través de la activación del complemento o, más comúnmente, a través de mecanismos mediados por células. La citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) es intrínseca a la eliminación de algunas infecciones virales (5). Por ejemplo, la transferencia adoptiva de anticuerpos promotores de ADCC protegió a los ratones contra el desafío del virus del herpes simple-2 (6). La actividad de ADCC se ha relacionado con la protección in vivo del virus de la gripe A (IAV) (7) y se ha correlacionado con la protección en un estudio de la vacuna contra el VIH (8). El mecanismo ADCC también es parte integral de la eficacia de la terapia de infusión de anticuerpos monoclonales en modelos de infección por el virus del Ébola (9). Por lo tanto, el ADCC podría contribuir significativamente al aclaramiento de la enfermedad para algunas infecciones virales y la transferencia adoptiva de anticuerpos que promueven el ADCC podría tener potencial terapéutico.

ADCC se activa cuando una célula diana recubierta de anticuerpos es reconocida por una célula efectora a través de sus receptores Fc (5). La reticulación del receptor Fc en las células efectoras desencadena un mecanismo de citotoxicidad mediado por células que, canónicamente, implica la liberación de gránulos citotóxicos de las células efectoras hacia la célula diana infectada. Tres tipos de receptores Fc están involucrados en los mecanismos ADCC mediados por la unión IgG en las células diana: FcγRI (CD64) expresada en monocitos y macrófagos; FcγRII (CD32) expresada en monocitos, macrófagos y granulocitos; y FcγRIIIa (CD16) expresada en células En el caso de las infecciones virales, los antígenos virales expresados en la superficie celular durante la infección son los objetivos de anticuerpos más probables para el ADCC.

En el presente trabajo queríamos evaluar si el mecanismo ADCC podría participar en la respuesta inmunitaria y la limpieza viral en dos enfermedades virales de rumiantes económicamente importantes de notificación obligatoria a la OIE: la fiebre catarral ovina (BT) y peste des petits ruminants (PPR). El virus de la lengua azul (BTV) es el agente causante de la enfermedad de la lengua azul transmitida por artrópodos que afecta a todos los rumiantes y a las ovejas más graves. BTV es el miembro prototipo del género Orbivirus que pertenece a la familia Reoviridae (10). El genoma de BTV consta de 10 segmentos de dsRNA que codifican para 12 proteínas. BTV es ahora endémico en Europa y está presente en todos los continentes (excepto la Antártida). Los anticuerpos neutralizantes se utilizan para definir los serotipos de BTV (11); y hasta ahora se han notificado 27 serotipos de BTV (12) [posiblemente 30 (13-15). La protección BTV es específica del serotipo, y existe poca o ninguna protección en todos los serotipos (16). Como tal, la vacunación BTV, que generalmente consiste en extractos de virus inactivados, solo proporciona una protección específica del serotipo.

El virus de los rumiantes de los pequeños (PPRV) causa la PPR, una enfermedad altamente contagiosa que afecta a los pequeños rumiantes y produce una morbilidad grave y una alta mortalidad en rebaño ingenuos, especialmente en las cabras (17). El PPRV se distribuye por África Central y Oriental, Oriente Medio, Turquía e India. La enfermedad ha llegado a la puerta de Europa con casos notificados en Marruecos (18), Turquía (19) y Georgia (20). El PPRV es un virus envuelto en ARN de sentido negativo de una sola cadena del género Morbillivirus que pertenece a la familia Paramyxoviridae. El genoma viral codifica 6 proteínas estructurales y 2 o 3 proteínas no estructurales (17). El VRPP puede producir una inmunosupresión grave (21) que puede conducir a infecciones patógenas oportunistas que complican aún más la recuperación de la enfermedad en el ganado afectado. Las vacunas actuales de PPRV consisten en cepas vivas atenuadas que aún pueden ser inmunosupresoras, aunque en menor medida que las cepas virulentas.

Por lo tanto, hay margen para mejorar las estrategias de vacunación actuales para ambas enfermedades. Lo ideal es que una vacuna sea segura y replique la inmunidad protectora que se provoca durante la infección. Por lo tanto, es fundamental entender los mecanismos exactos que impulsan la inmunidad protectora contra estos virus para diseñar vacunas más eficaces. La protección contra ambas enfermedades virales parece requerir componentes celulares y humorales de la inmunidad adaptativa. Dado que la inmunidad a BTV y PPRV se basa en parte en anticuerpos, algunos de los cuales probablemente no sean neutralizantes, queríamos evaluar si ADCC podría contribuir al aclaramiento de la enfermedad. Por lo tanto, evaluamos en el presente trabajo la capacidad de los sueros inmunes BTV y PPRV para reconocer las células infectadas ovinas. También medimos la capacidad de estos sueros inmunes para inducir ADCC contra las células infectadas e intentamos identificar algunos de los antígenos virales que son atacados por este mecanismo citotóxico. Los datos presentados aquí destacan la importancia de que las vacunas desencadenen una amplia gama de funciones efectores de inmunidad adaptativa para eliminar las infecciones virales.

Materiales y métodos

Células, virus y sueros inmunes anti-PPRV y anti-BTV

293 células T (ATCC: CRL-3216) y línea celular STC ovina (una línea celular timica de oveja transformada por SV40 establecida en el laboratorio) se cultivaron en DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamina + 1% 100X aminoácidos no esenciales + 1 mM de piruvato de sodio + 100 U/ml de penicilina/100 Las células BHK-21 (ATCC: CCL-10) y Vero (ATCC: CCL-81) se cultivaron en DMEM + 5% FBS + 2 mM de L-glutamina + 100 U/ml de penicilina/100 μg/ml de estreptomicina. Vero expresa Dog-SLAM (VDS) (Dr. Parida, Pirbright, Reino Unido) se cultivaron en DMEM + 1% FBS + 2mM L-Gln + 1% 100X aminoácidos no esenciales + 1 mM de piruvato de sodio + 100 U/ml de penicilina/100 μg/ml de estreptomicina + 1 μg/ml de zecina. Se realizaron cultivos mononucleares de células mononucleares de sangre periférica de ovina (PBMC), células NK y de fracciones de células B en RPMI + 10% FBS + 2 mM L-Gln + 1% 100X aminoácidos no esenciales + 1 mM de piruvato de sodio + 100 U/ml de penicilina/100 μg/ml de estre

Virus Virulent Peste des Petits Ruminants Costa de Marfil’89 (PPRV IC’89, linaje I) aislado, vacuna PPRV cepa Nigeria’75/1 (PPRV Nig’75, linaje II) (Dr. En el presente trabajo se utilizaron el sario Batten, Pirbright, Reino Unido) y el sereotipo 8 del virus de la lengua azul (BTV-8) Belgium’06 (Prof Palmarini, Universidad de Glasgow, Reino Unido). Las acciones de BTV se cultivaron en células BHK-21 y las acciones de PPRV se cultivaron en VDS como se describió anteriormente (22, 23). Las existencias de virus fueron estimuladas por los ensayos de placas como se describe en Rodríguez-Calvo et al. (24). Las células diana se infectaron a una multiplicidad de infección (MOI) de tres 24 horas antes de los ensayos de citotoxicidad para BTV y 48 horas antes de los ensayos de citotoxicidad para PPRV. Estos puntos de tiempo se eligieron cuando los efectos citopáticos se hicieron evidentes después de 48 horas para las células infectadas por BTV y 72 horas para las infectadas por PPRV.

Los sueros inmunes anti-PPRV y anti-BTV se obtuvieron de ovejas que se recuperaron de infecciones experimentales con cepas virulentas de PPRV-IC’89 o BTV-8 (días 23-30 después de la infección) (22, 25). Los sueros de los mismos animales antes de la infección por PPRV o BTV se utilizaron como controles ingenuos. Todos los sueros de oveja se inactivaron por calor antes de su uso (56 °C, 30 minutos).

Anticuerpos

En el presente trabajo se utilizaron los siguientes anticuerpos para caracterizar las poblaciones de células PBMC: CD16 antihumano (clone KD1, Biorad), anti-CD3 (clone CD3-12, Biorad), marcador antibovino de células B (clone BAQ44A, Kingfisher Biotech), CD14 antihumano (clone TÜK4, Biorad Se utilizaron anticuerpos anti-FLAG (F7425, Sigma) y anti-HA (clone 6E2, Cell Signaling) para detectar la expresión de proteínas en células transfectadas. El anticuerpo anti-GAPDH se utilizó como control de carga de muestras para Western blot. El anticuerpo anti-ovino MHC-I (clone 41.17, Biorad) se utilizó como control positivo para etiquetar las células en ensayos de citotoxicidad celular dependientes de anticuerpos. Se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-PPRV-N 1:100 para la detección de PPRV (Dr. Libeau, CIRAD, Montpellier, Francia) en experimentos de citometría de flujo. Se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-BTV-VP7 (VMRD; CJ-F-BTV-MAB-10 ML) para la detección de BTV. Rat anti-mouse IgM-FITC (Clone II/41, BD biosciences), anti-mouse IgG-Alexa 488 o 647 (Thermofisher), anti-sheep-IgG Alexa 488 (Thermofisher) se utilizaron como anticuerpos secundarios para la citometría de flujo e inmunofluorescencia. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados contra el IgG del ratón o anti-Rabbit IgG HRP (GE Healthcare) para las manchas occidentales.

ELISA de IgG anti-BTV

Se realizó ELISA para IgG específica de BTV-8 en sueros según lo descrito por Martin et al. (25). En pocas palabras, las placas Maxisorp (Thermofisher) se cubrieron con diluciones en serie de BTV-8 durante la noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con PBS + 0,05 % Tween + 2% de leche durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron con PBS + 0,05 % de tween e incubaron con suero inmune o ingenuo (dilución 1:200) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se incubaron durante 1 hora con anticuerpos secundarios conjugados con IgG HRP de burro (Biorad) (dilución 1:10,000) y después de extensas reacciones de lavado se revelaron con 3, 3′, 5′-tetrametil-benzidina (TMB, Thermofisher) y se detuvieron con ácido sulfúrico La absorción se leyó a 450 nm en un lector de microplacas Fluostar Omega.

Aislamiento De Células Mononucleares De Sangre Periférica

La sangre se obtuvo de ovejas donantes sanas alojadas en el Departamento de Reproducción Animal (INIA, Madrid España) y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) purificadas mediante técnicas de centrifugación estándar utilizando la separación de gradiente de Ficoll como se describe en Rojas et al. (23).

Enriquecimiento celular y expansión celular NK

Las células CD14^{+ se} agotaron de PBMC utilizando el kit de aislamiento CD14 humano (Miltenyi) y de acuerdo con el protocolo del fabricante. El enriquecimiento de la célula T/NK y la célula B se obtuvo mediante la separación de la columna de lana de nylon (26). Brevemente, el PBMC agotado en CD14 se incubaron en una columna de lana de nylon de equilibrio medio durante 45 minutos a 37 °C, 5% de CO2. Las células fueron eluidas en 2 fracciones. El primer eluado de 13-14 ml se enriqueció en células T y NK (normalmente >70% y 15-20%, respectivamente). El segundo eluado que consiste en la fracción celular descargada de la columna se enriqueció en células B (>80% típicamente). La eficiencia de la separación se evaluó mediante citometría de flujo.

Para la expansión de las células NK, las células CD16⁺ se aislaron de la fracción enriquecida con T/NK obtenida después de la separación de la columna de lana de nylon. Las células que expresan CD16 se etiquetaron con 0,5 μg/ml de anticuerpo CD16 antihumano (Clone KD1, Biorad) por 107 células durante 20 minutos en PBS + 0,2 % BSA + 2 mM de EDTA a 4 °C. Después del lavado, las células se incubaron con microesferas IgG anti-ratón (Miltenyi) (20 μl/107 células) durante 20 minutos en PBS + 0,2 % BSA + 2 mM de EDTA a 4 °C, se lavaron y eluieron en la columna LS de acuerdo con el protocolo del fabricante (Mil Las células aisladas ^de CD16⁺ (2 × 105 por pozo) se ampliaron con 2.000 UI/ml de IL-2 humana o 100 ng/ml de IL-2 ovina durante 21-28 días en 96 placas de fondo U del pozo (27, 28). Los medios suplementarios con IL-2 se reponeban cada 2-3 días, y las células se dividieron 1:2 cada 5-7 días. La expresión de CD16 se evaluó mediante citometría de flujo antes de su uso y los cultivos normalmente contenían >40 % de células CD16⁺ después de la expansión.

Ensayos de citometría de flujo y citotoxicidad

Para la tinción por citometría de flujo, las células se incubaron con anticuerpos o suero naïve/inmune (dilución (1:400) durante 20 minutos en hielo en tampón de tinción PBS (PBS + 2% FBS + 0,03% de azida sódico). Luego, las células se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios si era necesario durante 20 minutos en hielo en el tampón de manchas PBS. Las células se fijaron en un 1 % de paraformaldehído (PFA) antes de la adquisición. Para la tinción intracelular, las células se fijaron en un 4 % de PFA, se permeabilizaron y se tiñieron en un tampón de tinción PBS suplementado con un 0,2 % de saponina. Se realizaron todos los controles apropiados de isotipo, anticuerpos secundarios solos, suero ingenuo y fluorescencia menos un canal.

Los ensayos de citotoxicidad basados en la citometría de flujo se realizaron como se describe (29, 30). Las células objetivo breves (fracción enriquecida por células B o células transfectadas 293T) se etiquetaron con PKH67 (Sigma). Las células diana se incubaron con suero naïve/inmune (dilución (1:400) o anticuerpo anti-MHC-I (como control positivo) durante 1 hora, se lavaron y se cultivaron con células efectoras en diferentes proporciones durante 4 h. El yoduro de propidio (PI) se utilizó para etiquetar las células muertas y se añadió antes del análisis de citometría de flujo. Se incluyó la muerte espontánea y máxima celular (medida por la adición de 0,2 % de saponina) para todas las células diana. La lisis celular específica se midió utilizando la siguiente fórmula: % de lisis específica = (% células diana PI⁺ – % de muerte espontánea de células diana)/(% de muerte máxima de células diana – % de muerte espontánea de células diana) × 100. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo FACScalibur y se realizaron análisis con el software FlowJo.

Transfección

Los genes PPRV-P, -F y -H de la cepa de la vacuna PPRV Nig’75 se clonaron en vectores de plásmido de expresión del ADNc obtenidos de células infectadas por VDS. El gen PPRV-P se clonó en un plásmido de expresión pIRES que expresaba una etiqueta de epítopo FLAG. Los genes PPRV-F y -H se clonaron en plásmidos de expresión pCAGG que expresaban una etiqueta de epítopo HA. 293 células T se transfectaron en 6 placas de pozo a ~60% de confluencia con 1 μg de ADN plásmido utilizando el reactivo de transfección Mirus T siguiendo las instrucciones del fabricante. El plásmido vacío pCAGG se utilizó como control de transfección. Las células transfectadas se utilizaron para la expresión de proteínas o como células diana 48 horas después de la transfección.

Western Blot

Los lisados celulares se obtuvieron como se describe (31). El kit de ensayo de proteínas MicroBCA (Thermofisher) se utilizó para medir el contenido de proteínas en lisados celulares y se resolvieron 20 μg de proteína por carril en un 10 % de SDS-PAGE. Después de la transferencia a la membrana PVDF, la mancha se sondeó con los anticuerpos primarios y secundarios apropiados y se reveló con el reactivo ECL (Thermofisher). Se detectó quimioluminiscencia usando una película o un Chemidoc (Biorad).

Inmunofluorescencia y microscopía confocal

Las células Vero se cultivaron en cubreobjetos y se transfectaron con 1 μg de ADN plásmido utilizando el reactivo Lipofectamina 3000 (Invitrogen, Thermofisher) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, las células se fijaron con un 4 % de PFA durante 20 minutos, se permeabilizaron en PBS +0,05 % de Tritón X-100 y se bloquearon con un diluyente reactivo de anticuerpos Dako. Los cubreobjetos se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en el diluyente del reactivo de anticuerpos Dako durante la noche a 4 °C. Los cubreobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios diluidos en el diluyente del reactivo de anticuerpos Dako durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se vieron recubiertas con DAPI antes de montarlos con el medio de montaje Prolong. Las imágenes se capturaron con un objetivo 63x utilizando un microscopio confocal LSM 880 (Zeiss). Se utilizó el software ImageJ para el análisis de imágenes.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el software Graphpad Prism. Las pruebas estadísticas utilizadas para el análisis de datos se describen en la leyenda de la figura. Los niveles de significación fueron los siguientes: *p < 0,05; **p < 0,01; y ***p < 0,001.

Resultados

IgG de PPRV pero no de BTV Los sueros inmunes pueden reconocer antígenos virales en la superficie de las células infectadas

Para que ADCC se lleve a cabo la unión de IgG a la superficie de las células infectadas es necesaria. Esta unión puede desencadenar la muerte celular a través del reconocimiento por los receptores Fc presentes en las células efectoras (5). Para determinar si los sueros inmunes de las ovejas infectadas por PPRV IC’89 o BTV-8 podían reconocer las células infectadas, evaluamos mediante citometría de flujo la unión superficial de estos sueros en las células del huésped natural (ovejas) infectadas con PPRV IC’89 o BTV-8 (Figura 1). La entrada de células PPRV está mediada por la unión a los receptores SLAM en las células inmunitarias (32) o a la nectina-4 en las células epiteliales (33). Elegimos evaluar la infección por PPRV en las células inmunitarias, ya que estos son objetivos tempranos durante el ciclo infeccioso del virus. Enriquecimos PBMC ovino en células B usando el fraccionamiento de lana de nylon e infectamos estas células con PPRV IC’89 en MOI 3. La infección por PPRV se pudo detectar mediante citometría de flujo en PBMC ovino enriquecido con células B con anticuerpo anti-PPRV-N (Figura 1A). Los sueros inmunes de la PPRV podrían unirse específicamente a PBMC enriquecido con células B infectados con PPRV IC’89 en comparación con los sueros naïve (Figura 1B). Los sueros inmunes de PPRV también podrían reconocer los antígenos intracelulares de PPRV cuando se realizaba tinción en células permeabilizadas (Figura 1C). Detectamos un aumento en la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las células infectadas utilizando tres sueros inmunes PPRV de ovejas diferentes, lo que indica que los ráles inmunes PPRV podrían detectar antígenos PPRV de superficie en las células infectadas (Figura 1D). Para la infección por BTV, se utilizó una línea celular STC ovina establecida, ya que el virus puede infectar un amplio espectro de tipos de células in vitro. La infección por BTV (MOI 3) se detectó en las células STC mediante citometría de flujo con anticuerpo anti-BTV-VP7 (Figura 1E). Los sueros inmunitarios BTV-8 no podían unirse específicamente a la superficie de las células STC infectadas con BTV-8 (Figura 1F). Sin embargo, los sueros inmunes BTV-8 podían reconocer específicamente las células infectadas por BTV-8 cuando las preparaciones celulares estaban permeabilizadas (Figura 1G). La capacidad del suero inmune a la BTV para reconocer el virus y las células infectadas se confirmó mediante ELISA e inmunofluorescencia (Figura complementaria 1). Se evaluó la unión de varios sueros inmunes BTV-8 a células infectadas por STC para confirmar este hallazgo (Figura 1H). Si bien los sueros inmunes podían reconocer los antígenos intracelulares de BTV en las células STC infectadas, la intensidad de fluorescencia de estos sueros en la tinción de la superficie era equivalente a la de los sueros de BTV ingenuos. Esto indicó que las células infectadas por BTV-8 solo expresaban en la superficie celular bajos niveles de antígenos BTV reconocibles por los sueros inmunitarios. Por el contrario, los sueros inmunes de PPRV podrían detectar antígenos de PPRV en la superficie de las células infectadas.

FIGURA 1. Los sueros inmunes del PPRV pero no del BTV se unen a las células infectadas. (A-D) Histogramas de flujo representativo (n = 3) de PBMC ovino enriquecido con células B simulados infectados o infectados con PPRV IC’89 en MOI 3 durante 48 h y teñidos con (A) anticuerpo anti-PPRV-N, (B) manchados en la superficie, o (C) teñidos intracelularmente con suero (D) Intensidad media de fluorescencia (MFI) de PBMC ovino enriquecido con células B infectadas con PPRV IC’89 teñido con anticuerpo anti-PPRV-N, sueros no ingenuos o inmunes con PPRV. Se representa la media ± SD MFI para 3 sueros ingenuos e inmunes. **p < 0,01 ANOVA unidireccional con la prueba posterior de Bonferroni. (E-H) Histogramas de flujo representativo de células STC (n = 2–4) simuladas infectadas o infectadas con BTV-8 en MOI 3 durante 24 h y (E) teñidas con anticuerpo anti-BTV-VP7; (F) superficie teñida con suero no ingenuo o inmune a BTV o, como control, anticuerpo(H) Intensidad media de fluorescencia (MFI) de las células STC infectadas por BTV-8, teñidas con anticuerpos anti-BTV-VP7, sueros naïve o inmunes a BTV. Se representa la media ± SD MFI para 2 a 4 sueros ingenuos e inmunes. ***p < 0,001 ANOVA unidireccional con la prueba posterior de Bonferroni.

El Suerno Inmune De Las Ovejas Infectadas Por PPRV Induce ADCC Contra Las Células Infectadas

ADCC se evalúa clásicamente utilizando células NK derivadas de PBMC como células efectoras. ADCC está mediado por la reticulación de CD16 en estas células por IgG unida a la superficie de la célula diana. CD16 se expresa en varias poblaciones de células mononucleares periféricas (células NK y subconjuntos de células T γδ, monocitos y macrófagos). Sin embargo, las células NK solo representan una pequeña proporción del total de PBMC (normalmente < 5 %); por lo tanto, necesitábamos obtener una fracción de PBMC ovino enriquecida en células NK frescas. Dado que las células NK también pueden mediar la matanza alogénica de las células diana, decidimos evaluar ADCC en un sistema autólogo para minimizar la matanza no específica de las células diana. Por lo tanto, también necesitábamos obtener una fracción de células diana autóloga de las mismas ovejas donantes.

Para obtener nuestra fracción de PBMC ovina enriquecida en células NK, primero eliminamos los monocitos CD14⁺ (ya que estas células también pueden expresar CD16) utilizando cuentas magnéticas comerciales recubiertas de anticuerpos anti-CD14 y el agotamiento confirmado por citometría de flujo. Se utilizaron parcelas de puntos FSC/SSC para la discriminación celular y la tinción de control de isotipos para el ajuste de la puerta (Figuras 2A, B). La fracción PBMC agotada en CD14, que siempre contenía < 1 % de células CD14⁺ y retuvo una población de CD16^+. Las figuras 2B, se separó en columnas de lana de nylon. La primera fracción eluida de la columna de lana de nylon se enriqueció en células T y NK. Esta fracción normalmente contenía >70% de células CD3⁺ y 15-20% de células CD16⁺, y se utilizaba como células efectoras (Figura 2C). La segunda fracción eluida al enjuagar las células atrapadas en la columna de lana de nylon se enriqueció en células B (>70% de marcadores de células B ⁺ células) y se utilizó como células diana (Figura 2D). Esta fracción podría infectarse eficazmente con PPRV-IC’89 (Figura 1A) o BTV-8 (Figura 2E).

FIGURA 2. Aislamiento de células objetivo y efectora para ensayos ADCC ovinos. (A) Los PBMC ovino se obtuvieron por separación de centrifugación de gradiente estándar. Las células CD14^{+ se} agotaron utilizando microesferas anti-CD14 según lo descrito por el fabricante. La discriminación celular se estableció utilizando tramas de puntos FSC/SSC. (B) Se muestran parcelas de puntos de citometría de flujo representativas (n = 4) para la tinción de CD14 y CD16 en PBMC y en PBMC agotada por CD14. Se utilizaron controles de isotipo para establecer compuertas CD14/CD16. (C) La fracción efectora utilizada en los ensayos de ADCC se obtuvo después de la elución de PBMC agotado por CD14 a partir de columnas de lana de nylon. Esta fracción está enriquecida en células NK y T. Se muestran histogramas de citometría de flujo representativo (n = 6) después de la tinción de CD3 y CD16 en PBMC y en el el eluato enriquecido con células NK/T. (D) La fracción de células diana autóloga utilizada en los ensayos de ADCC se obtuvo después de limpiar las células atrapadas en la columna de lana de nylon. Esta fracción está enriquecida en las células B. Se muestran histogramas de citometría de flujo representativo (n = 6) para la expresión de marcadores de células B en el eluado enriquecido con PBMC y células B. (E) La fracción enriquecida con células B fue simulada o infectada con BTV-8 (MOI 3). La infección de las células objetivo con BTV-8 se monitoreó mediante citometría de flujo mediante tinción anti-BTV-VP7.

ADCC se midió mediante citometría de flujo utilizando células diana etiquetadas con el marcador de membrana PKH67 (Figura 3A) e infectadas con BTV-8 (Figura 3B) o PPRV IC’89 (Figura 3C). La muerte celular se evaluó con tinción de yoduro de propidium. La capacidad de los sueros inmunes de BTV para producir ADCC contra las células infectadas por BTV se evaluó utilizando células efectoras y diana obtenidas de tres ovejas donantes (Figura 3D). Los sueros inmunes de BTV no indujeron una lisis específica de las células diana infectadas por BTV en comparación con las células incubadas con sueros ingenuos de BTV o sin preincubación de suero. Las células objetivo etiquetadas con anticuerpos anti-MHC-I fueron lisadas específicamente por células efectoras que indicaban que las células efectoras podían mediar en ADCC en estos experimentos. La capacidad de 3 sueros inmunes PPRV (A, B y C) para producir ADCC contra las células diana infectadas por PPRV también se evaluó con células efectoras y diana purificadas de tres ovejas donantes PBMC (Figura 3E). Los tres sueros inmunes de PPRV promovieron la lisis específica de las células infectadas por PPRV IC’89 en comparación con las células diana incubadas en ausencia de sueros o con los sueros ingenuos coincidentes. Por lo tanto, los sueros inmunes PPRV contienen anticuerpos que median ADCC contra las células diana infectadas por el virus. No pudimos detectar el mecanismo de ADCC contra las células infectadas por BTV con sueros inmunes.

FIGURA 3. Los sueros de ovejas inmunes al PPRV pueden mediar en ADCC contra las células infectadas por el PPRV. (A) Estrategia de clasificación para ensayos ADCC basados en citometría de flujo. Las parcelas de puntos FSC/SSC discriminaron los escombros y permitieron la ting de eventos. Las células objetivo (eventos PKH67⁺) fueron cerradas para realizar el análisis de viabilidad con tinción de yoduro de propidio (PI). El ataqueo para las células muertas se basó en muestras de PI sin manchar. La muerte máxima de las células diana se midió añadiendo un 0,2 % de saponina. (B,C) Ejemplos de diagramas de puntos de citometría (duplicados de tres experimentos independientes para cada suero) utilizados para medir la lisis específica de las células diana por las células efectoras. Gráficos de puntos representativos de (B) Fracción enriquecida de células B infectadas por BTV o (C) CON PPRV (células diana) cultivadas en ausencia de células efectoras (muerte celular espontánea) o en presencia de células efectoras (fracción autóloga de células NK/T) después de la incubación con anticuerpo anti-MHC- (D) LLISIS específica media (±SEM) en tres experimentos independientes de células infectadas por BTV incubadas con anticuerpos anti-MHC-I como control positivo, sin suero, naïve o sérico inmune a BTV a diferente relación efector/células objetivo (E: T). ***p < 0,001 ANOVA bidireccional con la prueba posterior (E) LLISISespecífica media (±SEM) en tres experimentos independientes contra células infectadas por PPRV incubadas con anticuerpos anti-MHC-I como control positivo, sin suero, suero no apto para PPRV A, B o C, o suero apunitario de PPRV A, B o C a diferente relación efector a célula objetivo (E:

La expresión de la proteína PPRV-F y -H en células infectadas media el reconocimiento de ADCC por el suero PPRV-Immune

A continuación, nos proponíamos determinar qué productos del gen PPRV podrían ser reconocidos por los sueros inmunitarios. La partícula PPRV está envuelta y contiene dos proteínas transmembrana codificadas por el genoma viral: una proteína de fusión (F) responsable de la fusión de la partícula viral con la membrana plasmática celular y una hemaglutinina (H) responsable de la unión del receptor en la célula diana (17). La infección por PPRV también produce sincitis debido a la expresión de la proteína F en la superficie celular de las células infectadas. Además, se cree que el PPRV sale de las células infectadas por brotación y, por lo tanto, las proteínas PPRV-F y PPRV-H probablemente estén presentes en la superficie celular de las células infectadas (34). Se pueden detectar anticuerpos contra las proteínas F y H en individuos que se recuperaron de la infección por Morbillivirus, y la vacunación con adenovirus recombinante que expresa estos genes produce anticuerpos anti-PPRV y protege contra el desafío viral virulento (35-37). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que PPRV-F y-H podrían ser objetivos para ADCC en células infectadas.

Para probar esta hipótesis, el ADNc F y H obtenido de células infectadas por PPRV-Nig’75 se clonaron en vectores de expresión pCAGG que contienen una etiqueta de epítopo HA para su detección. Como control de un producto genético intracelular PPRV, el ADNc del gen de la fosfoproteína P de PPRV-Nig’75 se clonó en un vector de expresión pIRES junto con un epítopo de etiqueta FLAG. La expresión de la proteína PPRV-F, -H y -P se verificó por inmunofluorescencia después de la transfección de las células Vero (Figura 4A). Esto se confirmó además mediante el análisis de western-blot de células 293T (Figura 4B) o células Vero (datos no mostrados) transfectadas con estos plásmidos. La detección de etiquetas HA/FLAG reveló bandas al peso molecular previsto para PPRV-H (~70 kDa), PPRV-F (~59 kDa) y PPRV-P (~75-79 kDa dependiendo de la fosforilación).

FIGURA 4. Expresión de PPRV-P, -F y -H en células transfectadas.( A) Las células Vero se cultivaron en cubreobjetos, se transfirieron con pCAGG-Empty, -PPRV-F-HA, -PPRV-H-HA o pIRES-PPRV-P-FLAG, y la expresión de proteínas se evaluó utilizando anticuerpos antietiquetados (HA/FLAG). Los ácidos nucleicos se visualizaron mediante la tinción DAPI. Se muestran imágenes confocales representativas de células transfectadas. Barra de escala = 20 μm. (B) Las células 293T fueron simuladas (Mock) o transfectadas con pCAGG-Empty, -PPRV-F-HA, -PPRV-H-HA o pIRES-PPRV-P-FLAG, y se obtuvo lysato celular. Las proteínas se resolvieron en un 10 % de SDS-PAGE, se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa y se sondearon (IB) para la expresión de proteínas utilizando anticuerpos antietiquetas (HA/FLAG). Las membranas también fueron sondeadas con anticuerpos anti-GAPDH como control de carga. Las puntas de flecha indican bandas de proteínas al peso molecular previsto para PPRV-H (70 kDa), PPRV-F (59 KDa) y PPRV-P (75-79 kDa dependiendo de la fosforilación).

A continuación, queríamos determinar si los sueros inmunes PPRV podían detectar la presencia de estas proteínas PPRV en la superficie de las células transfectadas. Las células transfectadas 293T se incubaron con sueros inmunes, se tiñeron con anticuerpos IgG secundarios antioveja conjugados con Alexa488 y fluorescencia determinada por citometría de flujo (Figura 5A). Los sueros inmunes PPRV podrían unirse a las células transfectadas PPRV-F y PPRV-H, pero no a las células simuladas, transfectadas con un vector de expresión vacío o con un vector de expresión PPRV-P. Por lo tanto, los sueros inmunes PPRV pueden reconocer las proteínas PPRV-F y -H en la superficie celular. Para determinar si la unión específica de la IgG presente en los sueros inmunes podría desencadenar ADCC contra las células de expresión PPRV-F o -H, utilizamos células transfectadas incubadas con sueros inmunes como objetivos en ensayos de citotoxicidad. Las células NK ovinas con IL-2 se utilizaron como células efectoras (Figura 5B). Se aumentó la lisis específica contra las células diana que expresaban PPRV-F o -H utilizando células NK aisladas de cuatro ovejas donantes diferentes. En conjunto, estos datos muestran que las proteínas PPRV-F y -H pueden ser objetivos de ADCC en células infectadas por PPRV.

FIGURA 5. ADCC se dirige a las proteínas PPRV-F y -H. Las células 293T fueron simuladas, transfectadas con un plásmido de expresión vacía o plásmidos que expresan PPRV -P, -F o -H.( A) Las células 293T transfectadas se incubaron con suero inmunológico anti-PPRV y anticuerpo secundario IgG-alexa488 anti-oveja. La unión de las IgG de las ovejas a las células transfectadas se evaluó mediante citometría de flujo. Se muestran histogramas de citometría de flujo representativo de tres experimentos independientes. (B) Las células 293T transfectadas se incubaron con suero inmunitario PPRV y se utilizaron como células diana. ADCC se midió mediante ensayos de citotoxicidad de citometría de flujo utilizando células NK ovinas expandidas con IL-2 (>40 % de células CD16⁺) de ovejas donantes como células efectoras. Se muestra una lisis específica (media ± SD) en ensayos de ADCC realizados en cuatro ovejas donantes con una relación de efector a célula objetivo diferente (E: T). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 ANOVA bidireccional con la prueba posterior de Bonferroni (PPRV-P, -F o -H vs. vacío

Discusión

Las respuestas ADCC son parte de los mecanismos inmunitarios efectores desencadenados por varias infecciones virales (6-9, 38-40), y en algunos casos se correlacionan mejor con la protección que los anticuerpos neutralizantes (8, 41). De hecho, ADCC representa una de las bases para la protección que le confieren los anticuerpos no neutralizantes. Aquí evaluamos la respuesta ADCC provocada por dos virus rumiantes, BTV y PPRV. En primer lugar, mostramos que BTV no induce una respuesta de ADCC. En segundo lugar, describimos por primera vez que las células ovina infectadas con PPRV pueden ser objetivos de una respuesta ADCC. Además, nuestros resultados muestran que las proteínas PPRV F y H son los principales objetivos de ADCC. Estos datos sugieren que las células ADCC y NK podrían desempeñar un papel importante en la modulación del curso de las infecciones por PPRV.

En trabajos anteriores demostramos que el adenovirus recombinante que expresaba proteínas estructurales BTV o PPRV provocaba inmunidad celular y humoral y protegía a las ovejas contra el desafío del virus (25, 30, 36). En el caso de BTV, la protección se produjo a pesar de que solo se indujeron anticuerpos anti-BTV no neutralizantes. BTV es el miembro prototipo del género Orbivirus no envuelto. BTV solo codifica para una proteína transmembrana (la viroporina NS3) cuyo dominio extracelular corto es glucosilado (10). Sin embargo, las partículas de BTV están estrechamente asociadas con las membranas celulares, ya que la liberación de partículas se ha asociado con la brotación. Por lo tanto, es plausible que los anticuerpos anti-BTV puedan detectar el antígeno BTV en la superficie de las células infectadas. Sin embargo, el trabajo presentado aquí indica que es poco probable que los antígenos BTV sean reconocidos por los sueros inmunes en la superficie de las células infectadas. Demos que los sueros inmunes BTV no contenían anticuerpos que desencadenan ADCC. Por lo tanto, es poco probable que las células infectadas por BTV sean el objetivo de ADCC in vivo. Sería interesante en el trabajo futuro evaluar si los anticuerpos dirigidos a la fracción extracelular de la NS3 podrían mediar en el reconocimiento de las células infectadas o el mecanismo de ADCC. Dada la importancia de NS3 en la liberación de partículas de BTV de células de mamíferos (42), la inducción de anticuerpos anti-NS3 también podría formar la base para una terapia reactiva de serotipo cruzado.

El PPRV es un morbillivirus, cuya partícula viral envuelta posee dos proteínas estructurales transmembrana que también se expresan en células infectadas (17). Aquí mostramos que las células del huésped natural infectada con PPRV pueden ser objetivos de ADCC. Por lo tanto, los sueros inmunes de las ovejas infectadas por PPRV contienen anticuerpos anti-PPRV que desencadenan ADCC contra las células infectadas. También mostramos que las proteínas de fusión y hemaglutinina codificadas por el PPRV pueden ser atacadas por este mecanismo citotóxico. Por lo tanto, ADCC probablemente esté involucrado en el aclaramiento de las células infectadas por PPRV durante la infección. Para confirmar la relevancia de ADCC en el aclaramiento de PPRV in vivo, sería interesante en el trabajo futuro aislar los anticuerpos monoclonales que median en este efecto y determinar si su administración puede proporcionar protección contra el desafío virulento.

Los anticuerpos que median en ADCC tienen el potencial de proteger todos los serotipos de virus. Esto es sugerido por estudios de IAV donde Ab ampliamente reactivo puede mediar en la protección (43). La inducción de anticuerpos que median en ADCC también se ha correlacionado con una mejor protección después del desafío de IAV en pacientes (44). Este Abs ampliamente interactivo y ampliamente interactivo podría ampliarse después de los brotes estacionales de IAV y formar la base para la protección parcial observada. En el caso del PPRV, los sueros obtenidos de ovejas infectadas por PPRV IC’89 podrían mediar ADCC contra las células diana que expresan las proteínas de fusión y hemaglutinina de la cepa heteróloga PPRV-Nig’75. Por lo tanto, los anticuerpos mediadores de ADCC contra el PPRV podrían contribuir potencialmente a la protección contra varios linajes de PPRV.

Detectamos ADCC contra dos proteínas transmembrana PPRV, pero no contra la fosfoproteína intracelular. Hay poca evidencia de que ADCC pueda atacar antígenos virales intracelulares. En IAV, la transferencia de Ab no neutralizante que reconoce NP proporciona protección en modelos murinos (45, 46). De hecho, el NP podría expresarse transitoriamente en la superficie celular de las células infectadas por IAV (47) y, por lo tanto, podría ser el objetivo de ADCC. Sin embargo, la evidencia es limitada en cuanto a la relevancia de dicho mecanismo citotóxico durante las infecciones por IAV. Sería interesante en futuros trabajos evaluar si ADCC puede apuntar a la nucleoproteína PPRV, ya que los anticuerpos dirigidos contra este abundante antígeno PPRV durante la infección son fácilmente detectables en los sueros animales recuperados.

En conjunto, nuestros datos indican que es poco probable que los sueros inmunes de BTV contengan anticuerpos que mediquen en ADCC. Por el contrario, los sueros inmunes PPRV contienen anticuerpos que desencadenan ADCC contra las células infectadas. Estos anticuerpos se dirigen a la fusión PPRV y a las proteínas de hemaglutinina. Por lo tanto, ADCC podría contribuir al aclaramiento viral de las infecciones por VPP. Este trabajo destaca los diversos mecanismos efectores inmunitarios empleados por el huésped para eliminar el VRP. Dilucidar el mecanismo involucrado en la eliminación efectiva del patógeno podría ayudar a diseñar enfoques de vacunación más racionales contra estas enfermedades económicamente importantes.

Declaración ética

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de las directrices del Código de Métodos y Consideraciones de Bienestar en la Investigación del Comportamiento con Animales (Directiva 86/609EC; RD1201/2005) y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales (CEEA) (número de permiso: 10/142792.9/12) del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraría y Alimentaria (INIA) y la Comisión de ética estatal de bienestar animal (números de permiso: CBS2012/06 y PROEX 228/14).

Contribuciones del autor

JR, DR-M, MA y VM realizaron los experimentos. JR, DR-M y NS analizaron los datos. JR y NS diseñaron el estudio y escribieron el manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la revisión del manuscrito, leyeron y aprobaron la versión presentada.

Financiación

MA fue financiado por una subvención FPI (BES-2013-066406) del Ministerio de Economía y Competitividad de España. Este trabajo fue financiado por las subvenciones AGL2015-64290R, ADENONET Redes de Excelencia del Ministerio Español de Economía y Competitividad; y S2013/ABI-2906-PLATESA de la Comunidad de Madrid y la Unión Europea (Fondo Europeo de Desarrollo Regional, fondos FEDER).

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias por la ayuda técnica, Dr. Ana Villa para microscopía confocal y el Dr. Esther Morel para citometría de flujo. Los autores desean dar las gracias a todos los miembros del laboratorio de Nuevas Estrategias para el Control de Patógenos Relevantes en Sanidad Animal.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.03172/full#supplementary-material

Referencias