1 Introducción

Las infecciones del tracto urinario son una de las causas más comunes de supervisión veterinaria de atención primaria en perros y un desafío de tratamiento debido a su alta recurrencia e implicaciones terapéuticas. Escherichia coli es la bacteria más común aislada en infecciones urinarias en perros y humanos (1-3). Además, la bacteriemia por E. coli en humanos (la causa más común de bacteriemia en los países de ingresos altos) es causada por infecciones del tracto urinario en más del 50% de los casos (4). Escherichia coli también se ha asociado con un aumento de la resistencia a los antimicrobianos (2, 5). La evidencia sugiere que los perros actúan como reservorio de infecciones humanas por E. coli uropatógena (UPEC) y son una fuente de propagación de la resistencia a los antimicrobianos (6).

Escherichia coli se clasifica en varios patotipos en función de la presencia de factores de virulencia. Las E. coli uropatógenas se incluyen dentro del grupo de E. coli patógenas extraintestinales (ExPEC) y se caracterizan por un factor de virulencia específico. Algunos de estos factores de virulencia son las p-fimbrias (papC), la α-hemolisina (hlyA) y el factor necrotizante citotóxico tipo 1 (cnf1) (7). La Eae, el gen que codifica la intimina y está asociada con las cepas diarreicas, también se puede encontrar en cepas uropatógenas (8). Otros factores virulentos relevantes de E. coli incluyen las toxinas Shiga (Stx), también conocidas como verotoxinas y características de la E. coli productora de toxina Shiga (STEC), que están relacionadas con la diarrea hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico, y se han descrito en varias especies, aunque las infecciones naturales rara vez se describen en perros (9, 10 ). Existe un riesgo zoonótico potencial asociado a la presencia de estos elementos genéticos en animales de compañía y otras especies (11, 12). Las cepas híbridas han ganado atención recientemente, especialmente aquellas que albergan varios factores de virulencia tradicionalmente asociados con diferentes patotipos. Estos nuevos tipos de cepas se consideran «heteropatógenas» o híbridas, como las cepas STEC/UPEC (2), y se consideran capaces de producir ambos resultados, diarrea o ITU (13).

Los genes de virulencia están codificados por plásmidos, bacteriófagos o islas de patogenicidad (PAI). Las islas de patogenicidad son fragmentos móviles e inestables de ADN presentes en las cepas patógenas, pero ausentes en las cepas no patógenas relacionadas, que pueden ser compartidas por transmisión horizontal. PapC, hlyA y cnf1, entre otros genes de virulencia, suelen estar codificados simultáneamente dentro de los PAI en UPEC (14, 15). Las p-fimbrias, codificadas por el gen papC, juegan un papel importante en la adherencia renal y en la respuesta inflamatoria (16). α-Hemolisina es una toxina conocida por producir lesiones renales, y aunque el mecanismo aún no está claro, cnf1 no juega un papel importante en la gravedad de la enfermedad, pero generalmente se asocia con otros genes de virulencia (15).

Se ha demostrado previamente que algunos aislados caninos de UPEC son clonales con los aislados de humanos, lo que sugiere su potencial zoonótico. También se ha propuesto que los perros podrían actuar como reservorio de este patotipo de E. coli, de ahí la importancia del estudio de las posibles implicaciones de las ITU en esta especie animal (17, 18).

En las últimas décadas ha habido una creciente preocupación por el aumento en el número de aislados de E. coli que presentan un perfil multirresistente (MDR) (19, 20). Se ha descrito que la tenencia de animales de compañía podría ser un factor de riesgo en la propagación de cepas patógenas de E. coli entre humanos y mascotas, favoreciendo también la diseminación de resistencia a los antimicrobianos en la comunidad (21-23).

Es común encontrar resistencia a antibióticos en aislados de E. coli de casos de ITU, lo que resalta la importancia de monitorear la susceptibilidad de la cepa al tratamiento antibiótico, incluso si ya se ha implementado un tratamiento experimental. De hecho, las cepas de UPEC aisladas de perros han sido descritas como reservorios de MDR en varios países (24, 25) y como portadoras de genes betalactamasas de espectro extendido (BLEE) (5). La E. coli productora de BLEE se ha encontrado previamente en gatos y perros, y también se ha demostrado la portación conjunta de humanos y perros en el mismo hogar en muestras fecales (26-28). En general, la BLEE y la presencia de otros mecanismos de resistencia a los antibióticos pueden dificultar el tratamiento de enfermedades infecciosas y, por lo tanto, dar lugar a infecciones crónicas complicadas.

Aunque se recomienda el cultivo microbiológico y las pruebas de susceptibilidad antes de establecer cualquier tratamiento antimicrobiano, con frecuencia se establece un tratamiento empírico y las recomendaciones más comunes para tratar estas infecciones en animales de compañía incluyen amoxicilina (sin ácido clavulánico) y trimetoprim-sulfonamidas como primer abordaje (29). Por lo tanto, se necesita información actualizada sobre los patrones de susceptibilidad a los antimicrobianos.

El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de E. coli en muestras de orina de una población canina española que presentaba signos clínicos de infecciones del tracto urinario y caracterizar los aislamientos según los factores de virulencia seleccionados y su patrón de resistencia a los antimicrobianos, un campo de investigación escasamente investigado en España.

2 Materiales y métodos

2.1 Colección de aislados de Escherichia coli

Este estudio se realizó en un total de 52 aislamientos de E. coli. Esta colección de aislados provino de muestras de orina de perros diagnosticados con ITU. Las muestras se recogieron asépticamente mediante cistocentesis como parte de la actividad diaria de los veterinarios privados en Zaragoza, España. Los criterios seguidos para diagnosticar la ITU fueron los utilizados en la clínica diaria, que incluyen micción frecuente, dolor al orinar, fiebre o vómitos, entre otros. El período de muestreo osciló entre 2017 y 2019, y todas las muestras de orina se tomaron antes de establecer cualquier tratamiento. La edad media de los individuos fue de 8,97 años (IC 95%: 4,11-13,83%). En cuanto al sexo de estos individuos, 21 de ellos eran hombres y 31 mujeres.

Los aislados se identificaron utilizando VITEK® (bioMérieux, Francia) y los confirmados como E. coli se almacenaron a -20 °C para su posterior análisis.

2.2 Detección del gen de la virulencia

El ADN se extrajo hirviendo de 3 a 5 colonias de cultivos puros y luego se realizó una PCR convencional para la detección de genes relacionados con la virulencia. Estos genes incluían eae (intimina), Stx1 y Stx2 (toxinas Shiga 1 y 2), papC (P-fimbrias), hlyA (α-hemolisina) y cnf1 (factor necrotizante citotóxico tipo 1). Los cebadores utilizados en este estudio fueron los descritos en la Tabla 1. La PCR se realizó en un termociclador BiometraTRIO 48 (Analytik Jena, Alemania), y los productos de PCR se analizaron bajo luz UV en geles de agarosa al 1,5% teñidos con GelGreen® (Biotium, Estados Unidos).

Tabla 1. Primeros utilizados en la PCR convencional realizada en este estudio.

La cepa CECT 4783 se utilizó como control positivo para los genes eae, Stx1 y Stx2; La cepa C136b fue el control positivo para los genes hlyA y cnf1, amablemente proporcionado por el Dr. J. A. Orden, Universidad Complutense de Madrid, España. Se utilizó una cepa canina previamente aislada por nuestro grupo de investigación (cepa Pe8, número de acceso GenBank MK034302) como control positivo para el gen papC.

Los aislamientos de Escherichia coli se clasificaron en patotipos según la presencia de los genes del factor de virulencia analizados. Las E. coli enterohemorrágicas (EHEC) se describen como aquellas cepas de E. coli que albergan tanto la intimina como las toxinas Shiga (12). Cuando solo uno de estos factores de virulencia estaba presente, los aislados se clasificaron como E. coli enteropatógena (EPEC) o STEC, respectivamente. Si se encontró alguno de los otros genes del factor de virulencia analizado, es decir, hlyA, PapC y/o cnf1, los aislados se clasificaron como E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) (34).

2.3 Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos

La susceptibilidad a 74 antimicrobianos diferentes se determinó utilizando VITEK® (bioMérieux, Francia). Los agentes antimicrobianos seleccionados para probar la susceptibilidad de cada cepa aislada dependieron de las directrices de VITEK, ya que los antimicrobianos clínicamente relevantes recomendados por VITEK®® variaron durante el período en el que se realizó el estudio. Los antimicrobianos se clasificaron en 12 categorías: aminoglucósidos, anfenicoles, carbapenémicos, fluoroquinolonas, nitrofuranos, otros β-lactámicos, penicilinas, tetraciclinas, sulfonamidas, cefalosporinas de 1ª-2ª generación, cefalosporinas de 3ª generación y cefalosporinas de 4ª-5ª generación, como se muestra en la Tabla 2. Todos los aislados se probaron con al menos un antibiótico de cada categoría, excepto las cefalosporinas de 4ª y 5ª generación, que se añadieron a mitad del estudio. En el caso de los aislados que no tenían información sobre las cefalosporinas de 4ª y 5ª generación, no se incluyeron ni la susceptibilidad ni la resistencia, por lo que se excluyeron del análisis de prevalencia para ese grupo. La resistencia a una categoría de antimicrobianos se definió como la resistencia a al menos uno de los agentes de esa categoría. Los aislados de MDR se definieron como aquellos aislados con no susceptibilidad a tres o más categorías de antimicrobianos (35).

Tabla 2. Antimicrobianos probados en aislamientos de E. coli y clasificación por categorías.

Además, se utilizó la prueba VITEK 2 ESBL (bioMérieux) en estos aislados para la detección rápida de la producción de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), que se basa en la evaluación simultánea de los efectos inhibidores de cefepima, cefotaxima y ceftazidima, solos y en presencia de clavulanato.

Los puntos de corte para la interpretación de los resultados de la concentración inhibitoria mínima (CMI) se aplicaron de acuerdo con los criterios establecidos por bioMérieux para animales pequeños (AST-GN97, bioMérieux, Francia), que incluyen la resistencia natural y los puntos de corte del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (36).

La categoría de resistencia intermedia proporciona una información flexible en la práctica clínica. Sin embargo, se ha encontrado previamente que los aislados de E. coli albergan genes de resistencia (37) Por esta razón, cuando tuvieron que ser categorizados en variantes dicotómicas fueron evaluados como resistentes.

2.4 Secuenciación del genoma completo

Los aislados que mostraban la tasa más alta de resistencia fenotípica, es decir, resistencia a seis o más categorías de antimicrobianos, se seleccionaron para su posterior caracterización mediante secuenciación del genoma completo (WGS). Un total de diez aislados de E. coli se cultivaron durante 24 h en agar nutriente (Oxoid, Reino Unido) y luego se extrajo el ADN utilizando el kit de purificación de ADN genómico Wizard (Promega, Madison, WI, Estados Unidos). Los parámetros de calidad del ADN se comprobaron tanto en el Qubit 4 (Invitrogen) como en la electroforesis en gel. La secuenciación del genoma se realizó en una plataforma Illumina Miseq con una longitud de lectura de extremo pareado de 150 pb. Las secuencias se recortaron en Galaxy (versión 0.3.8.1) y se ensamblaron con Unicycler (versión Galaxy 0.5.0 + Galaxy 1). Todos los datos de secuenciación se han enviado a la base de datos genómica del NCBI en el marco del PRJNA1031085 BioProject, y los números de acceso individuales son los siguientes: SAMN37924970 (aislado 258.883), SAMN37926527 (aislado 262.947), SAMN37926528 (aislado 263.715), SAMN37926529 (aislado 266.493), SAMN37926530 (aislado 267.252), SAMN37926531 (aislado 269.901), SAMN37926532 (aislado 271.550), SAMN37926533 (aislado 271.758), SAMN37926534 (aislado 271.811) y SAMN37926535 (aislado 271.960).

Los genes de resistencia a los antibióticos, los factores de virulencia, los serotipos y los tipos de secuencia (ST) se asignaron a estos genomas secuenciados utilizando herramientas que incluían ResFinder 4.1 (38-40), PathogenFinder 1.1 (41), VirulenceFinder 2.0 (39, 42), MLST 2.0 (E. coli #1 y #2) (39, 43-48), cgMLSTFinder 1.2 (42, 49), MGE v1.0.3 (39, 50-52) y SeroTypeFinder 2.0 (53). La visualización de los datos genómicos se llevó a cabo con Prok (ver 54). Se creó un árbol filogenético con la tubería Roary (55) basado en la anotación Prokka (56), y seguido por el uso del software IQ-TREE (57).

2.5 Análisis estadístico

La prevalencia se calculó con intervalos de confianza (IC) del 95%. Para probar la relación simple entre los factores de virulencia y los antibióticos, se utilizó la Prueba Exacta de Fisher y se determinaron los valores de p, considerándolos estadísticamente significativos cuando el valor de p ≤0,05. Los valores numéricos se calcularon mediante el coeficiente de Pearson. Los aislados que mostraron resistencia intermedia a los antibióticos se consideraron resistentes para las comparaciones estadísticas. Todos los análisis y cálculos se realizaron utilizando R versión 4.1.1 y RCommander 2.7-1.

3 Resultados

3.1 Análisis factorial de virulencia

Según el análisis del factor de virulencia realizado, la prevalencia de los genes relacionados con la virulencia fue la siguiente: 1,92% para eae (IC 95%: 0-5,66%), 1,92% para Stx2 (IC 95%: 0-5,66%), 59,62% para papC (IC 95%: 46,28-72,95%), 53,85% para hlyA (IC 95%: 40,30-67,4%) y 32,69% para cnf1 (IC 95%: 19,97-45,44%). Sin embargo, no se encontró el gen Stx1 en este estudio.

En cuanto a la clasificación del patotipo de E. coli, el 82,69% (IC 95%: 79-87%) de los aislamientos se clasificaron como ExPEC, y alrededor del 20% (9/43) de ellos albergaban simultáneamente los tres factores de virulencia extraintestinal analizados. Además, el 1,92% (IC 95%: 0-5,66%) de los aislamientos se definieron como EPEC, y el mismo valor se encontró para STEC. Sin embargo, no se detectaron aislamientos de EHEC. Ninguno de los factores de virulencia analizados en este estudio se encontró en el 13,46% (IC95%: 3-23%) de los aislamientos.

3.2 Prevalencia de resistencia fenotípica a los antimicrobianos

De acuerdo con los perfiles de resistencia a los antimicrobianos observados, solo uno de los 52 aislamientos de E. coli (IC 95%: 0-5,66%) fue susceptible a todos los antimicrobianos probados. Además, todas las categorías antimicrobianas presentaron aislamientos resistentes, aunque en un porcentaje variable.

De acuerdo con los niveles de resistencia a los antimicrobianos definidos por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (58), se encontró un nivel de resistencia extremadamente alto para las categorías de cefalosporinas de 1ª, 2ª y 3ª generación, seguidas de una resistencia muy alta a las penicilinas y fluoroquinolonas. Estos aislados también mostraron un alto nivel de resistencia a los anfenicoles (Figura 1). Se encontró un bajo nivel de resistencia en 5 de las 12 categorías: carbapenémicos, nitrofuranos, otros β-lactámicos, cefalosporinas de 4ª-5ª generación y aminoglucósidos.

Figura 1. Prevalencia de resistencia a diferentes categorías antimicrobianas encontradas en aislados de E. coli de orina de perro.

Varios aislamientos mostraron resistencia a los antibióticos, que se consideran antimicrobianos de importancia crítica y están clasificados en la categoría A (59). Por ejemplo, tres (de 30) aislados fueron resistentes al β-lactámico aztreonam, y hubo varios otros que se encontraron resistentes a los antibióticos de categoría A del grupo de penicilina: tres (de 17) aislados fueron resistentes a la carbenicilina, 18 (de 31) a la ticarcilina, uno (de 33) a la piperacilina y tres (de tres) a la mezlocilina. También hubo un aislado que mostró resistencia intermedia, y por lo tanto clasificado como resistente, a un agente de la categoría de carbapenémicos (imipenem).

Aparte de eso, el 13,46% (IC 95%: 4,17-22,73%) de los aislados se consideraron productores de BLEE, y casi el 60% (4/7) de ellos mostraron resistencia a 9 o más de las 12 categorías de antibióticos probadas.

3.3 Perfiles multirresistentes

Un total del 71,15% (IC 95%: 58,84-83,46%) de los aislados estudiados se describieron como MDR.

Se observaron dos perfiles principales de MDR, con una prevalencia del 7,69% (IC 95%: 0,45-14,93%) cada uno de ellos. Los aislamientos incluidos en uno de estos perfiles mostraron resistencia a las siguientes categorías antimicrobianas: penicilinas, cefalosporinas de 1ª-2ª y 3ª generación; mientras que el otro perfil comprendió aquellos aislados resistentes a anfenicoles, fluoroquinolonas, penicilinas y cefalosporinas de 1ª, 2ª y 3ª generación.

3.4 Análisis genómico de aislados seleccionados

La tipificación molecular in silico se realizó en los genomas secuenciados de los aislados fenotípicamente resistentes seleccionados (Tabla 3). Se asignaron tres nomenclaturas diferentes para la tipificación de secuencias a cada aislado de acuerdo con el esquema MLST de Achtman, el esquema MLST de Pasteur y el genoma central (cg)-MLST.

Tabla 3. Tipos de secuencia (ST) y serogrupos de aislados de E. coli secuenciados.

Tres de estos aislamientos, es decir, 258.883, 262.947 y 263.715, compartían el mismo serotipo (O5H20), y el tipo de secuencia correspondiente (Pasteur ST 901 / Achtman ST 6448) y el tipo de secuencia del genoma central (cg-ST 174146), lo que convierte a este tipo de E. coli en el más prevalente entre los aislados estudiados. El resto de los aislados presentaron tipos moleculares únicos, aunque los aislados 271.758 y 269.901 pertenecían al mismo complejo clonal (CC ST23) y estaban emparejados en el árbol filogenético (Figura 2). La comparación anotada de los aislados (Figura 3) no mostró ninguna región faltante importante.

Figura 2. Árbol filogenético que incluye los aislados secuenciados de E. coli. Los metadatos se añadieron mediante la aplicación web Phandango (60).

Figura 3. Comparación del genoma de referencia de E. coli K12 con aislados secuenciados. La anotación de genes seleccionados de resistencia a los antimicrobianos se llevó a cabo en Proksee Server del Grupo de Investigación Stothard (Universidad de Alberta, Canadá) que utiliza el análisis BLAST para ilustrar secuencias genómicas conservadas y faltantes (disponible en línea: https://proksee.ca/).

Se detectaron varios genes y mutaciones asociados con resistencia a diferentes categorías de antimicrobianos en los aislados secuenciados y se detallan en la Tabla 4. Además, algunos de estos genes se asociaron a elementos genéticos móviles (MGE), que se describen en la Tabla 5.

Tabla 4. Genes de resistencia a los antimicrobianos y mutaciones encontradas en los genomas secuenciados de los aislados de E. coli seleccionados, así como el patrón de resistencia fenotípica correspondiente mostrado en el ensayo de prueba de susceptibilidad.

Tabla 5. Presencia de elementos genéticos móviles (MGE) en aislados secuenciados, y resistencia a antibióticos y genes de virulencia asociados.

Curiosamente, hubo dos MGE de particular interés debido a su asociación con genes de resistencia importantes o un alto número de ellos, es decir, IS6100 e ISEc9, que se pueden ver en la Figura 4.

Figura 4. Se seleccionaron contigs de diferentes aislados que contenían genes de resistencia a los antimicrobianos, así como MGE anotados con Prokka (56). (A) Organización de un fragmento de contig 27 en el aislado 266.493, que contiene los genes aadA5, dfrA17, qacE, sul1 y mphA. (B) Organización del contig 42 en el aislado 269.901, que contiene los genes aph(6)-Id, aph(3″)-Ib y sul2. (C) Organización de un fragmento de contig 11 en el aislado 258.883, que contiene bla_CTX-M-55 gen. (D) Organización de un fragmento de contig 36 en el aislado 271.960, que contiene varios genes de resistencia, como aadA1, sul2 y tet(A). (E) Organización de un fragmento de aislado 263.715, que contiene el gen de resistencia tet(M).

3.5 Asociación entre la resistencia a los antimicrobianos y los factores de virulencia

Al probar las relaciones simples entre la resistencia fenotípica a los antimicrobianos y la presencia de factores de virulencia en estos aislados, el porte del gen cnf1 mostró una asociación significativa con la resistencia a varias penicilinas, así como con la propia categoría de penicilina (Valor de p = 0,01). El gen Cnf1 también mostró una asociación significativa (Valor de p = 0,019) con la categoría MDR. Aparte de eso, la edad de los individuos se asoció significativamente con los aislados de E. coli que mostraron resistencia a varias cefalosporinas y a la categoría de cefalosporinas de 4ª-5ª generación (valor de p = 0,034). El sexo se asoció con los aislados resistentes a aminoglucósidos (Valor de p = 0,007).

La producción de BLEE se asoció con la resistencia a cinco de las 12 categorías antimicrobianas analizadas (anfenicoles, otros β lactámicos, cefalosporinas de 4ª-5ª generación, sulfonamidas y fluoroquinolonas). No se observó una relación significativa entre el número de genes relacionados con la virulencia y la producción de BLEE, sin embargo, se encontró una relación negativa entre el número de categorías antimicrobianas a las que los aislados mostraron resistencia y el número de genes relacionados con la virulencia (coeficiente de Pearson = 0,33, valor de – = 0,014).

4 Discusión

Este estudio ha evaluado la resistencia antimicrobiana tanto fenotípica como genotípica, así como la presencia de genes de virulencia seleccionados en aislamientos de E. coli de perros españoles con ITU y ha demostrado que los perros pueden ser reservorios de cepas uropatógenas resistentes de E. coli.

Comparando con los resultados obtenidos en un estudio previo (61) en el que se recogieron muestras en un tiempo y ubicación geográfica similares, aunque tenían un origen diferente (heces), encontramos que los aislamientos de E. coli en orina eran más susceptibles a los aminoglucósidos que los obtenidos en heces de perro (resistencia fenotípica encontrada en el 9,62% frente al 40% de los aislados). En general, la prevalencia de resistencias antimicrobianas encontradas es similar a la encontrada en E. coli aislada de pacientes con ITU (62, 63), excepto en el grupo de penicilina, que fue ligeramente mayor en este estudio (67,31% vs. ~ 45-50%). Esta alta prevalencia también es contraria a la tendencia decreciente de la resistencia a la penicilina en aislados de E. coli en Europa (20). Algunas hipótesis para este fenómeno podrían ser la tendencia al aumento de la resistencia a los antibióticos año tras año o el hecho de que en este trabajo se estudiaron más antibióticos del grupo de la penicilina.

La resistencia a los aminoglucósidos de Escherichia coli fue el único tipo de resistencia ligada al sexo del animal, encontrándose exclusivamente en individuos machos. De hecho, el sexo masculino se ha asociado previamente con la resistencia a los aminoglucósidos en bacterias gramnegativas (64).

Al tener en cuenta algunos de los antibióticos considerados clínicamente importantes para la salud humana y animal por la Agencia Europea del Medicamento (59), vale la pena mencionar que en este estudio se detectaron aislamientos de E. coli que mostraban resistencia a varios de estos antibióticos, incluso a antibióticos de categoría A («Evitar», incluye antibióticos no autorizados en medicina veterinaria en la Unión Europea). como ciertas penicilinas o carbapenémicos. Otra categoría relevante de antibióticos es la categoría B («Restringida»), que incluye aquellos enumerados como antimicrobianos de importancia crítica de mayor prioridad (HP-CIA) según la categorización de la Organización Mundial de la Salud, por ejemplo, cefalosporinas de 3ª generación o fluoroquinolonas. De hecho, hasta el 80,77 y el 53,85% de estos aislados se consideraron resistentes a las cefalosporinas y fluoroquinolonas de 3ª generación, respectivamente. La alta cantidad de resistencia general encontrada entre todas las categorías podría estar sesgada por el hecho de que las ITU complicadas se solicitan con más frecuencia para las pruebas de cultivo y antibiograma que los casos más simples de ITU.

Actualmente se recomienda el tratamiento con amoxicilina o trimetoprim-sulfonamidas como agentes de primera línea para el manejo de las infecciones urinarias bacterianas en perros (29). Sin embargo, teniendo en cuenta estos resultados, parece que el uso de estos antimicrobianos puede ser ineficaz en un alto porcentaje de casos, ya que el 58,33% de los aislados se encontraron resistentes a la amoxicilina y el 30,77% a la trimetoprima-sulfonamidas. Antes de sugerir cualquier cambio en las guías actuales para el tratamiento antibiótico en las infecciones urinarias caninas, hay que tener en cuenta que E. coli no es el único patógeno responsable de las infecciones urinarias y que los datos analizados en este estudio podrían estar sobreestimando la resistencia basal, principalmente debido a la selección de los pacientes. En cualquier caso, el uso de pruebas de resistencia a antibióticos como rutina permite no solo el seguimiento de la epidemiología de los perfiles de resistencia a los antibióticos, sino también la implementación más rápida de un tratamiento en caso de fracaso del empírico.

Cabe destacar el alto porcentaje de aislamientos de MDR encontrados (71,15%). Entre los aislamientos de MDR encontrados, más del 80% (30/37) fueron clasificados como ExPEC, y uno de ellos correspondió al patotipo EPEC. Este tipo de cepas poseen un riesgo zoonótico potencial y también pueden servir como reservorio de genes de resistencia (18), contribuyendo aún más a la diseminación de la resistencia a los antibióticos y limitando las opciones para el tratamiento de enfermedades infecciosas tanto en humanos como en animales.

La alta resistencia a los antibióticos se ha asociado con MGE en Enterobacteriaceae. Las bacterias que albergan estos elementos móviles pueden convertirse en un reservorio de resistencias a los antibióticos y transmitirse de las mascotas a sus dueños o al medio ambiente. Este fenómeno plantea un grave problema de salud debido a la propagación de la resistencia y al fracaso de los tratamientos antibióticos actuales (65).

De especial interés es la presencia del transposón Tn6009 portador del gen tet(M) en el aislado 263.715. Este elemento ha sido descrito previamente en otras bacterias Gram-negativas, como Enterococcus fecalis (66), y se asocia con resistencia a tetraciclina debido a la presencia de tet(M) (Figura 4E). Este transposón conjugativo no compuesto es de importancia clínica en bacterias Gram-positivas y tiene un papel potencial en la diseminación de la resistencia (67, 68). La resistencia a los betalactámicos fue codificada por bla_CTX–M–55 gen en tres aislados, que se localizó en una secuencia de inserción ISEc9 (similar a IS 1380). La región ISEc9 se ha asociado previamente con genes BLEE (69) y se ha descrito en otras bacterias como Vibrio vulnificus (70). En todos los casos, el gen y la secuencia de inserción estaban a 46 pb de distancia. Uno de ellos (aislado 263.715) también albergaba un bla_Z y otro (aislado 263.715) tenía una copia de BLA_TEM-1B. Genes que codifican para betalactamasas como el bla_TEM-1B y BLA_OXA-1 también se identificaron en otros aislamientos. Por ejemplo, bla_TEM-1B estuvo presente en dos aislamientos que no mostraron resistencia fenotípica a betalactámicos (aislados 271.550 y 271.811), y en uno que sí lo hizo (aislado 267.252). Solo había un aislado (269.901) que contenía un bla_OXA-1 gen. Como era de esperar, este aislado fue resistente a varios antibióticos en el grupo de penicilina (ampicilina, amoxicilina + ácido clavulánico, amoxicilina), y fue negativo en la prueba de producción de BLEE Bla_OXA-1 se ha encontrado en ST131 o se ha asociado con otros genes en plásmidos (71). A pesar de que este gen se describió originalmente en MGE (72), solo identificamos plásmido IncI1 en este aislado, y no se asoció con ningún gen de resistencia a antibióticos. En la mayoría de los genomas secuenciados (7/10) se encontraron genes de resistencia a sulfonamida (sul 1 o 2), y en cinco de ellos estos genes se localizaron en un MGE (IS6100 e IncQ1 para sul1, e ISVsa3, IncQ1 o IncFII para sul2). Todos estos MGE también albergaban otros genes de resistencia, incluidos los relacionados con la estreptomicina (aadA5, aph(6)-Id, aph(3″)-Ib y aadA1 en IS 6100, IncFII e IncQ1) (73-76), trimetoprima (dfrA17 y dfrA1 en IS 6100 e IncQ1) (77, 78), antisépticos (qacL y qacE en IS 6100 e IncQ1, aunque todos los genes de resistencia a los antisépticos estaban incompletos) (79), eritromicina (mph(A) en IS6100) (80), doxiciclina y tetraciclina (tet(A) en IncQ1) (81) y cloranfenicol (catA1 en IncQ1) (82).

La transposasa ISVsa3 se encontró en uno de los aislados secuenciados (262.947) y contenía el gen sul2, que también se ha identificado en otros enteropatógenos (83-85). El aislado 266.493 albergaba la estructura de integrón dfrA17-aadA5-qacEdelta1-IS6100-mph(A)-sul1, que se identifica comúnmente en el patotipo ExPEC (86).

En cuanto a los plásmidos identificados, se ha documentado previamente en España que el plásmido IncFII está frecuentemente relacionado con la producción de BLEE (87). En este estudio, el plásmido solo se identificó en un aislado, aunque se clasificó como no productor de BLEE.

Otro plásmido identificado fue IncQ1, comúnmente encontrado en E. coli y con capacidad de transferencia entre diferentes especies bacterianas y cepas, lo que facilita la diseminación de resistencia a antibióticos en poblaciones bacterianas (88). Este plásmido se detectó en los genomas de tres aislados (267.252, 271.550 y 271.960) y se encontró cerca de genes de resistencia relacionados con la resistencia a aminoglucósidos (aph(6)-Id y aph(3″)-Ib). Estos tres aislados estaban distantes en el árbol filogenético, lo que sugiere que el plásmido probablemente se adquirió de forma independiente. Uno de estos aislados albergaba nueve genes de resistencia más cerca del plásmido detectado (Figura 4D), lo que indica un punto caliente potencial para la diseminación de resistencia a los antibióticos.

Al estudiar los genes de resistencia a antibióticos en aislados secuenciados, hubo en general una correlación consistente entre la resistencia fenotípica y genética. Sin embargo, hubo dos excepciones significativas a este patrón. Al examinar los aminoglucósidos, varios aislados mostraron susceptibilidad a esta categoría a pesar de ser portadores de genes de resistencia relacionados con la estreptomicina y la espectinomicina, que se incluyen en esta categoría de antimicrobianos. La segunda excepción se observó con la tetraciclina, donde la relación entre los genes de resistencia y la resistencia fenotípica no se alineó de manera consistente. Esta discrepancia en el aislado 258.883 puede atribuirse a una sustitución de nucleótidos en la posición 924 dentro del gen tet(A) (posición 3.323, GenBank: AF534183.1), específicamente en la transición de citosina (C) a timina (T). Debido a esta alteración, hay un cambio en la composición de la proteína de la alanina (Ala) en la posición 118 a la treonina (Thr). Aunque estos no son los primeros aislados de E. coli que albergan esta mutación genética (89), hasta donde saben los autores, nuestro estudio es el primero que asocia esta mutación en tet(A) a una falla en la respuesta fenotípica. Además, en más del 40% (4/9) de los aislamientos considerados fenotípicamente resistentes a los anfenicoles, no se encontró ningún gen de resistencia asociado a esta categoría antimicrobiana.

El árbol filogenético (Figura 3) mostró que los aislados caninos se agruparon, excepto el aislado 271.960 (ST 372), que se agrupó con un aislado humano (referencia de ensamblaje OX637964.1) que pertenece a ST131. ST 131 es uno de los tipos de secuencia predominantes dentro del patotipo ExPEC en todo el mundo (71, 90). De hecho, E. coli O25b:H4/ST131 fue descrita como un clon prevalente en la población humana española. De acuerdo con la bibliografía, este aislado canino no se asoció con resistencia a BLEE y tuvo un perfil de resistencia similar al de las cepas humanas (91, 92).

De acuerdo con los factores de virulencia analizados, la mayoría de los aislamientos de E. coli encontrados en las muestras de orina se categorizaron en el patotipo ExPEC, como se esperaba. Los factores de virulencia detectados con mayor frecuencia fueron papC y hlyA, seguidos de cnf1. La prevalencia de Cnf1 en estos aislamientos fue similar a la encontrada en aislamientos tanto de perros como de humanos, mientras que la prevalencia de papC y hlyA fue mayor en este estudio (18, 93-97). Sin embargo, la mayoría de las poblaciones muestreadas en estos estudios incluyen animales sanos, lo que podría reducir la prevalencia de los factores de virulencia de E. coli. La prevalencia de estos tres factores de virulencia fue mayor en los aislados de perros que en los encontrados en humanos (95, 98-100). Algunos de estos factores fueron encontrados en la MGE (Tabla 5), lo que pone de manifiesto su potencial de propagación a otras cepas.

Casi el 20% de estos aislamientos de ExPEC se mostraron en combinación con los tres genes relacionados con la virulencia extraintestinal analizados (papC, hlyA y cnf1), probablemente debido a la presencia de un PAI (101). Este tipo de factores de virulencia se encuentran con frecuencia en cepas de E. coli causantes de enfermedad extraintestinal tanto en humanos como en perros, siendo así esta especie animal un posible reservorio del patotipo ExPEC (102).

Aparte de eso, se estudió un aislado Stx2 positivo, que no albergaba ningún otro factor de virulencia. Se cree que la toxina Shiga 2 está asociada con el desarrollo del síndrome urémico hemolítico (11) y se produce mejor cuando se encuentra en combinación con otras cepas o bacterias (103). Sin embargo, también hay algunas descripciones de aislados de E. coli productores de toxina Shiga asociados con casos de infecciones urinarias, y se ha propuesto que las toxinas Shiga pueden unirse a los receptores de las células epiteliales de la vejiga urinaria y dañarlas (104, 105). Además, también se detectó un aislado de EPEC. No es la primera vez que se encuentra un aislado eae positivo entre las cepas asociadas a ITU, aunque su frecuencia también parece ser bastante baja (8, 106, 107). El papel de este producto génico (es decir, la intimina) en la patogénesis de las infecciones urinarias no se comprende completamente y su importancia aún no se ha estudiado (8).

Teniendo en cuenta que la población fecal de E. coli podría tener una relación con la patogénesis de las infecciones urinarias (108), se puede sugerir que ciertos patotipos diarreicos también tienen el potencial de causar infecciones urinarias, aunque son poco frecuentes. Sin embargo, el papel de estas cepas en el desarrollo de ITU y las causas moleculares y patogénicas detrás de ella aún no se conocen bien, y se necesita más investigación en este campo para comprender los mecanismos y las causas epidemiológicas. Sin embargo, la capacidad de estas cepas para causar una infección extraintestinal en el huésped no solo depende de sus genes relacionados con la virulencia, sino también de factores de riesgo como la edad o la inmunosupresión (106).

También es importante tener en cuenta que en la literatura se ha descrito una amplia variedad de rasgos de virulencia asociados al sector extraintestinal. Por lo tanto, además de estos genes de virulencia típicos de las cepas diarreicas, estos dos aislados también podrían albergar otros factores de virulencia extraintestinal diferentes a los analizados en este estudio. En este sentido, algunas cepas de E. coli han sido clasificadas recientemente como híbridas por albergar factores de virulencia generalmente asociados con diversos patotipos, por ejemplo, cepas STEC/UPEC (109). La plasticidad del genoma de este microorganismo promueve el intercambio y la combinación de determinantes de virulencia intestinal y extraintestinal, lo que resulta en un potencial heteropatogénico (106, 107). Por lo tanto, debe vigilarse la posible aparición de patotipos híbridos no solo en humanos sino también en animales.

El hallazgo de ocho aislamientos (15,38%) considerados aislados patógenos intestinales ni extraintestinales pudo explicarse por el hecho de que solo se probó una selección de factores de virulencia. Por lo tanto, estas E. coli podrían albergar otros genes diferentes relacionados con la virulencia no analizados en este estudio. Sin embargo, otra explicación podría ser que el agente causal de la infección urinaria en estos perros era diferente de E. coli, o incluso una causa no infecciosa. También cabe destacar que la detección de genes del factor de virulencia no significa que se expresen fenotípicamente, por lo que la gravedad de la enfermedad no podría evaluarse únicamente con esta información. Sin embargo, se sabe que la gravedad de la enfermedad no es causada por un solo factor de virulencia, sino por una combinación de ellos (110, 111).

El serotipo aislado con mayor frecuencia en este estudio fue O5H20. En este sentido, O5:H(−) se ha asociado con cepas STEC, y las toxinas Shiga también se han descrito en cepas de E. coli que causan ITU (112, 113). Sin embargo, estos aislados no albergaban ningún gen de la toxina Shiga. El resto de los serotipos de E. coli se distribuyen a lo largo de diferentes ST y patrones de resistencia a antibióticos, mostrando una distribución heterogénica.

Curiosamente, los patrones de baja resistencia a los antibióticos se relacionaron con un mayor número de factores de virulencia. Existe cierta literatura (114, 115) que sugiere una relación positiva entre los factores de virulencia y el MDR. Sin embargo, en los aislamientos de este estudio, solo el portador de cnf1 mostró una asociación significativa con MDR, mientras que un portador de factor de virulencia alto se asoció con perfiles de baja resistencia. La razón de este mecanismo aún no está clara, pero se plantea la hipótesis de que la adquisición de MDR se «sacrifica» a cambio de factores de virulencia, o que la baja presencia de factores de virulencia facilita la adquisición de resistencia a los antibióticos (116, 117). Al analizar la correlación entre todos los factores de virulencia encontrados y la presencia de genes de resistencia a antibióticos en aislados secuenciados del genoma completo, la relación no fue significativa (p = 0,14). Sin embargo, hubo un sesgo en la selección de los aislados, ya que solo se eligieron los más resistentes.

5 Conclusión

Con base en estos datos, un porcentaje muy alto de aislamientos de E. coli encontrados en muestras de orina de perros que padecían ITU se consideraron MDR, la mayoría de ellos clasificados como ExPEC. También se observó con frecuencia la resistencia fenotípica a los antimicrobianos de primera línea recomendada en el tratamiento de las infecciones urinarias, lo que podría asociarse a un fracaso del tratamiento. Además, se identificaron varios genes de resistencia a los antimicrobianos, algunos de ellos contenidos en MGE, en el genoma de aislados resistentes seleccionados. El uso de la secuenciación del genoma completo pudo identificar algunos de los mecanismos genéticos que subyacen a la resistencia a los antimicrobianos, aunque se encontraron algunas discordancias entre la resistencia fenotípica y los genes. La combinación de datos fenotípicos y genéticos mejora nuestra comprensión de la resistencia a los antibióticos y mejora la eficiencia de la selección de tratamientos.

En general, estos hallazgos son preocupantes tanto para la salud animal como para la salud pública, ya que los perros podrían actuar como reservorios de E. coli patógena MDR y contribuir a la propagación de la resistencia a los antimicrobianos. Por lo tanto, la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos y la revisión de las directrices terapéuticas deben abordarse continuamente en los entornos veterinarios clínicos.

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio están a disposición del público. Estos datos se pueden encontrar en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject; PRJNA1031085.

Declaración ética

No se requirió aprobación ética para los estudios con animales de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales, ya que las muestras se recogieron como parte de la actividad diaria de los veterinarios privados. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones de los autores

AA-F: Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. ES: Curación de datos, Análisis formal, Supervisión, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición. AO: Investigación, Escritura – borrador original. IM-B: Análisis formal, Supervisión, Redacción – revisión y edición. BM: Recursos, Supervisión, Redacción – Revisión y Edición. MM: Conceptualización, Recursos, Supervisión. RB: Conceptualización, Obtención de Fondos, Recursos, Supervisión, Redacción, Revisión y Edición.

Financiación

El/los autor/es declara(n) haber recibido apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Este trabajo fue apoyado por el proyecto Microbiologia Veterinaria (Nº 2019/1180, OTRI UNIZAR).

Reconocimientos

Los autores agradecen al personal de Laboratorios Albéitar S. C. (Zaragoza, España) su excelente asistencia técnica y el suministro de algunas muestras para el estudio. Además, queremos hacer un reconocimiento al Departamento de Microbiología de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza, en el que se realizaron algunas técnicas.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Referencias