1. Introducción

El diflubenzurón [1-(4-clorofenil)-3-(2,6-difluorobenzoil) urea] es un producto químico de la clase benzoilfenil urea (BPU) ampliamente utilizado desde la década de 1970 para el control de plagas, tanto en áreas urbanas como en agricultura y ganadería (1). Inhibe la síntesis del exoesqueleto de quitina y actúa como un regulador del crecimiento de larvas de artrópodos, siendo utilizado como insecticida y acaricida. En el ganado bovino, el diflubenzurón se ha utilizado como aditivo dietético para controlar la mosca del cuerno (Haematobia irritans), la mosca doméstica (Musca domestica), la mosca del establo (Stomoxys calcitrans), así como las garrapatas (Rhipicephalus microplus). El diflubenzurón es mal absorbido por la vía gastrointestinal del ganado, ampliamente metabolizado y casi totalmente excretado en las heces y la orina, lo que resulta en concentraciones muy bajas de residuos en la leche y la carne (2, 3). Dentro de las dosis recomendadas, estos residuos suelen ser indetectables o inferiores a los valores de ingesta diaria admisible (IDA) (4) y, por lo tanto, es poco probable que presenten un problema de salud pública (1, 5). Por lo tanto, no hay tiempo de retiro, y el diflubenzurón se puede usar en ganado lechero lactante (6).

Aunque el diflubenzurón se ha considerado seguro para su uso en el ganado, los resultados de los estudios toxicológicos sobre especies no objetivo son controvertidos. No se observó ningún efecto carcinogénico del diflubenzurón in vitro (7, 8), mientras que los efectos genotóxicos y mutagénicos dependientes de la dosis se observaron in vivo en algunos modelos animales (9), pero no en otros (10). Tales inconsistencias pueden estar asociadas con el efecto indirecto de metabolitos, como la 4-cloroanilina, que se forman in vivo a partir de la pequeña proporción del diflubenzurón que realmente se absorbe (11). Recientemente, se demostró que el diflubenzurón induce la apoptosis celular y la generación de ROS en células epiteliales mamarias (12). Los efectos potencialmente perjudiciales para las células y especialmente para la integridad del ADN son particularmente importantes para los gametos y embriones y, por lo tanto, para la toxicidad reproductiva. También es de destacar que el diflubenzurón, además de actuar sobre la síntesis de quitina sobre las larvas, también perjudica la ovogénesis y reduce la población de folículos ováricos en insectos adultos (13). A este respecto, las posibles acciones sobre la gametogénesis en otras especies deben ser un objetivo para la evaluación del riesgo. Sin embargo, muy pocos estudios han abordado la posible toxicidad reproductiva del diflubenzurón en el ganado.

La producción de embriones in vitro (PIV) se ha convertido en la técnica de elección para la producción de embriones en muchos países, y en 2020 el número de embriones producidos in vitro fue tres veces mayor que el número de embriones recolectados in vivo en todo el mundo (14). Además de su papel clave como herramienta para los programas de cría de animales, IVEP también proporciona una plataforma importante para el estudio de los efectos ambientales, incluidos los disruptores endocrinos, en la reproducción. La maduración in vitro (MIV) de ovocitos bovinos, por ejemplo, se ha propuesto como un método potencial para evaluar los peligros químicos sobre la fertilidad, que requiere que muchos menos animales demuestren posibles efectos perjudiciales en la reproducción que los modelos in vivo (15). La especie bovina también es un modelo adecuado para estudios de toxicología reproductiva humana, debido a las similitudes entre la fisiología ovárica bovina y humana (16). Del mismo modo, los avances en la evaluación del semen bovino, como el uso del análisis de esperma asistido por computadora (CASA), han proporcionado herramientas más precisas para identificar posibles interferencias en la fisiología reproductiva masculina, por ejemplo, cambios menores en la calidad del esperma no detectables en los exámenes andrológicos de rutina.

El objetivo del presente estudio fue evaluar los posibles efectos perjudiciales potenciales a corto plazo del tratamiento con diflubenzurón sobre la cantidad, la calidad y el potencial de desarrollo de gametos en el ganado bovino. Nuestra hipótesis era que, dentro de las dosis recomendadas actuales, el tratamiento con diflubenzurón no afectaría la calidad de los gametos o embriones y el potencial de desarrollo en el ganado. La justificación de este estudio fue que el uso de nuevos métodos analíticos, como CASA, y modelos experimentales in vivo in vitro, como la asociación de la recuperación de ovocitos in vivo con la EPIV, son importantes para validar evaluaciones toxicológicas previas sobre la seguridad del diflubenzurón en el ganado.

2. Material y métodos

2.1. Animales y ubicación

El experimento 1 se llevó a cabo en una granja privada de carne ubicada en Formosa, GO, Brasil. Se inscribieron toros puberales Nelore (Bos taurus indicus) (n = 14), sin anomalías detectables durante los exámenes andrológicos. Los toros se mantuvieron bajo pastos de Brachiaria sp. con acceso ad libitum al agua, y recibieron 2 Kg/cabeza/día de suplemento concentrado con una mezcla mineral. El experimento 2 se realizó en la Estación Experimental Sucupira de Embrapa, en Brasilia, DF, Brasil. Se reclutaron novillas nulíparas, pubertales y ciclistas de Nelore (Bos taurus indicus) (n = 16), sin patologías detectadas durante el examen ginecológico. Las novillas fueron confinadas y recibieron una dieta de mantenimiento que consistía en ensilaje de maíz y mezcla mineral (100 g / día / cabeza), comenzando en un período de adaptación 2 semanas antes del comienzo del experimento. Ambos experimentos se realizaron de junio a agosto (invierno, estación seca).

2.2. Diseño experimental

Este estudio se subdividió en dos experimentos (para toros y novillas, respectivamente), ambos siguiendo un diseño experimental similar (Figura 1). En ambos experimentos, los animales se distribuyeron en un grupo de control (GC) o tratamiento (DIF). Los toros se asignaron al azar a los grupos experimentales, mientras que las novillas se clasificaron primero según el recuento de folículos antrales (AFC), tal como se define en otra parte (17) y, de la posición más alta a la inferior, se asignaron alternativamente a los grupos GC o DIF. El equilibrio de la distribución fue confirmado por la falta de diferencia (P > 0,05) en AFC entre los dos grupos al comienzo del experimento. Los grupos experimentales recibieron una mezcla mineral añadida (DIF) o no (CG) con diflubenzurón, calculada para satisfacer los requerimientos minerales diarios y, en los grupos DIF, para asegurar el consumo diario de 1 g de una formulación comercial (Difly S3, Champion, Anápolis, Brasil) con diflubenzurón al 3% (30 mg por cabeza/día, según recomendación de la etiqueta del producto, https://www.champion.ind.br/produto/difly-s3-6-kg-2/), durante 8 semanas (56 días). El consumo de la mezcla mineral de cada grupo fue monitoreado diariamente, confirmando la ingestión de la dosis esperada de diflubenzurón. Se evaluó el peso corporal y se recolectaron muestras de sangre semanalmente en las vaquillas, y cada 15 días en los toros. Comenzando inmediatamente antes de los tratamientos, cada dos semanas los toros fueron sometidos a la recolección de semen, y las novillas a la aspiración transvaginal guiada por ultrasonido del folículo (OPU), en un total de cinco sesiones en cada experimento. El semen se sometió a una evaluación física y morfológica, y las muestras se almacenaron para un análisis de esperma asistido por computadora (CASA). Los complejos cúmulo-ovocitos (AOC) recuperados fueron evaluados según la morfología y enviados a un laboratorio comercial para la EPIV.

2.3. Muestreo de sangre y análisis de sangre

Las muestras de sangre se recogieron mediante punción de la vena o arteria coccígea, utilizando agujas de doble extremo 21G. Se recogieron dos muestras de cada animal en tubos de vacío de 5 mL, uno con y otro sin EDTA K3 (Vacutainer Systems; Becton Dickinson, São Paulo, SP, Brasil). Las muestras se mantuvieron refrigeradas (5 °C) y se transportaron a un laboratorio comercial de análisis clínicos veterinarios. Cada muestra fue evaluada para hemograma y criterios de valoración bioquímicos.

2.4. Recogida y análisis del esperma

Las muestras de semen se recogieron por electroeyaculación, como se describe en otra parte (18). Brevemente, los toros fueron contenidos en un conducto de compresión de ganado de carne, y la eyaculación fue inducida usando un electroeyaculador, en el preajuste # 4 (Autojac 3, Neovet, Uberaba, Brasil). Las muestras (20 μL) de semen fresco se evaluaron bajo aumento x200 para movimiento de masa, vigor y motilidad, y bajo aumento x1000 para análisis morfológico de los espermatozoides, como se describió anteriormente (19). El semen se diluyó 1:1 en un extensor de semen (Optixcell, IMV Technologies Brasil, Campinas, Brasil) y se mantuvo bajo refrigeración (5°C) hasta su transporte al laboratorio. El semen fresco de cada toro se rediluyó 1:10 en Optixcell y se analizó una muestra de 3 μL en una cámara de conteo (Leja, IMV Technologies) utilizando CASA (SpermVision Minitube GMBH, Tiefenbach, Alemania), con el preajuste estándar del equipo. El semen restante se diluyó, de acuerdo con la concentración de espermatozoides determinada por CASA, a una concentración final de 50 x 10⁶ esperma/ml, llenado en pajitas de 0,5 ml, estabilizado a 4 °C durante 4 h y congelado con una máquina de congelación (Cryogen, Neovet) con la curva de congelación estándar para el ganado. Las muestras de semen congelado también fueron analizadas por CASA, inmediatamente después de la descongelación o después de ser sometidas a una prueba de termorresistencia (TRT) durante 4 h.

2.5. Recuperación de ovocitos y producción embrionaria in vitro

Todos los exámenes ecográficos y procedimientos de OPU se realizaron utilizando un dispositivo de ultrasonido portátil (MyLab 30 Gold Vet, Esaote, Génova, Italia) equipado con una sonda rectal lineal de 7,5 MHz o una sonda vaginal microconvexa de 7,5 MHz montada en una guía de agujas de polietileno hecha a medida (WTA Tecnologia Aplicada, Cravinhos, Brasil). Antes de la primera OPU, el número de folículos detectables por sonografía (AFC) en los ovarios se registraba y se usaba para equilibrar la distribución de novillas entre los tratamientos.

Los procedimientos OPU-IVEP utilizados fueron los mismos que se describen en otra parte (20). Brevemente, se recolectaron AOC inmaduros por punción y aspiración de folículos visibles (>2 mm), utilizando agujas de 20 G y una presión de vacío de aproximadamente 80 mm/Hg. El líquido aspirado con el contenido del folículo se recuperó en tubos de 50 ml que contenían DPBS agregado con 1% de FCS y 125 UI / ml de heparina sódica. La calidad de los AOC se evaluó bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de x40 y aquellos clasificados morfológicamente como viables, como se describió anteriormente (21), se transfirieron a criotubos de 1,2 mL (Corning, Nueva York, EE.UU.) que contenían medio de maduración y se transportaron en una incubadora portátil (Minitub do Brasil, Porto Alegre, Brasil) a 38 ° C al laboratorio IVEP.

El AOC de cada donante se sometió a maduración in vitro (GIV), fertilización in vitro (FIV) y posterior cultivo embrionario in vitro (VCI) por separado. La MIV se realizó durante 20 h en TCM199 (Gibco, Nueva York, EUA) suplementada con 0,05 UI/ml de FSH (Pluset, Hertape-Calier, Barcelona, España), 1 mg/ml de estradiol y 10% de FCS en una incubadora humidificada al 5% de CO₂ en el aire y 38.5°C. Los AOC expandidos se desnudaron parcialmente y se transfirieron a gotas con el medio piruvato de lactato de albúmina (TALP) de Tyrode, suplementado con 10 μg / ml de heparina, 20 μM de D-penicilamina, 10 μM de hipotaurina y 1 μM de epinefrina. La FIV se realizó con 1 x 10⁶ espermatozoides/ml durante 18 h. El semen de un solo padre Nelore con fertilidad conocida en IVEP se utilizó para todos los lotes de fertilización. Los cigotos presuntivos fueron entonces IVC en gotitas de 50 μL de líquido de oviducto sintético (SOFaa) suplementado con aminoácidos esenciales y no esenciales, tricitrato de sodio de 0,34 mM, mioinositol de 2,77 mM y FCS al 10%, bajo aceite mineral. Las tasas de escisión y blastocisto se determinaron a las 72 y 168 h después de la inseminación. Los blastocistos también se clasificaron según el estadio del desarrollo (blastocistos iniciales, blastocistos, blastocistos expandidos o blastocistos eclosionados). Un subconjunto de los blastocistos expandidos (alrededor de 30/lote/grupo) se transfirieron a portaobjetos de vidrio, se tiñeron con Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) y se evaluaron bajo el microscopio (x1000) para el número total de células (ICM más trofoblasto).

2.6. Análisis de datos

Todos los criterios de valoración relacionados con el peso, los análisis hematológicos y bioquímicos en sangre, la producción y calidad de los espermatozoides en los toros, y el rendimiento de ovocitos y la producción embrionaria in vitro en novillas, se compararon entre los grupos GC y DIF mediante el procedimiento GLIMMIX de SAS (SAS Studio 3.8, University Edition; SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.) con una declaración repetida para tener en cuenta las mediciones a lo largo del tiempo. El modelo incluyó los efectos del tratamiento (control o diflubenzurón), el tiempo (recolección de semen o sesión de OPU-IVEP) y sus interacciones, y se ajustó por el tipo de distribución de cada variable. Debido a las bajas frecuencias individuales, las patologías espermáticas se agruparon como defectos mayores o menores, como se describe en otra parte (22). Del mismo modo, los blastocistos expandidos se agruparon según el recuento de células en aquellos con >100 o < 100 células. Las diferencias entre las medias se determinaron mediante la prueba T de Student. Los resultados se muestran como media ± SEM. Los valores exactos de p se muestran para cada comparación, para indicar cuán cercanas estaban las diferencias medias de la significación (p < 0,05).

3. Resultados

El peso corporal promedio y los parámetros sanguíneos en toros Nelore y novillas de los grupos CG y DIF se muestran en la Tabla 1. En general, no hubo efecto (p > 0,05) del tratamiento en ninguno de los criterios de valoración analizados tanto para hombres como para mujeres. Se observó un efecto de tiempo (P > 0,05) sobre el peso en los hombres y en la mayoría de los parámetros sanguíneos tanto en los grupos como en el sexo, pero solo se observó una interacción tratamiento x tiempo para la creatinina y la fosfatasa alcalina (ALP) en los hombres.

3.1. Experimento 1

Dos toros no se adaptaron a la rutina de recolección de semen y fueron retirados del experimento, por lo tanto, los grupos CG y DIF consistieron en cinco y siete toros, respectivamente. El tratamiento con diflubenzurón no tuvo efecto (P > 0,05) sobre ningún parámetro físico o de espermatozoides de CASA, independientemente de si los análisis se realizaron con semen fresco, congelado-descongelado o congelado-descongelado más TRT (Tabla 2). Por el contrario, hubo un efecto temporal (P < 0,05) en la mayoría de los criterios de valoración. Rara vez se observaron efectos de tratamiento x tiempo, en todos los casos asociados con fluctuaciones en los valores, en lugar de con tendencias crecientes o decrecientes a lo largo del período experimental.

3.2. Experimento 2

Los datos relacionados con la recuperación de ovocitos y la producción embrionaria in vitro se muestran en la Tabla 3. Durante las cinco sesiones de la OPU, los grupos GC y DIF produjeron 801 y 986 AOC totales, y 631 y 797 AOC viables, respectivamente. La tercera sesión de IVEP se vio afectada por la contaminación microbiológica en ambos grupos durante la FIV, por lo que los datos de esta sesión de IVEP fueron descartados. De manera similar a lo que se observó para el semen, se observó un efecto temporal para la mayoría de los criterios de valoración de OPU-IVEP, mientras que no hubo efecto (P > 0,05) del tratamiento con diflubenzurón sobre ningún parámetro. Se observó una interacción tratamiento x tiempo en el número de folículos aspirados, que disminuyó (P < 0,05) consistentemente en GC pero aumentó (P < 0,05) de las sesiones tres a cuatro en el grupo DIF, y en la proporción de blastocistos expandidos y de embriones con > 100 células, que fluctuó en ambos grupos.

4. Discusión

Los inhibidores de la quitina benzoilurea, como el diflubenzurón, son pesticidas selectivos con efectos perjudiciales conocidos en los artrópodos, así como en otros organismos que presentan quitina en sus conchas o exoesqueleto, pero no en mamíferos. El diflubenzurón fue aprobado y actualmente se utiliza para el control de una variedad de plagas en la agricultura y parásitos en la ganadería (5). Sin embargo, los estudios de toxicidad han demostrado posibles efectos secundarios en modelos animales no objetivo. Por lo tanto, la seguridad de estos productos químicos debe reevaluarse con el tiempo, especialmente cuando se dispone de nuevos métodos analíticos o modelos experimentales. Nuestra hipótesis era que, dentro de las dosis recomendadas actuales, el tratamiento con diflubenzurón no afectaría la calidad de los gametos o embriones y el potencial de desarrollo en el ganado, según lo determinado por CASA u OPU-IVEP. El presente estudio proporcionó evidencia adicional de la falta de toxicidad reproductiva del diflubenzurón en el ganado.

Aunque el presente estudio se centró en los efectos potenciales sobre gametos y embriones, también monitorizamos el peso y los parámetros hematológicos que podrían indicar toxicidad sistémica. Se evaluaron indicadores de la función del sistema hematopoyético (hematocrito, proteína), hepática (fosfatasa alcalina) y renal (creatinina). El hígado es el principal órgano responsable del metabolismo de los compuestos endógenos y exógenos y, junto con el riñón, es responsable de la excreción de la mayoría de los metabolitos. Por lo tanto, estos órganos son objetivos para las acciones tóxicas de los productos químicos, lo que resulta en concentraciones plasmáticas alteradas de biomarcadores como ALP y creatinina (23, 24). Además, se encontró que la ALT aumentó en ratas macho tratadas con diflubenzurón (11). El sistema hematopoyético, por otro lado, es altamente susceptible a sustancias tóxicas, siendo un criterio de valoración importante en los estudios toxicológicos (25). En el presente estudio, ningún criterio de valoración fisiológico se vio afectado por el tratamiento con diflubenzurón. Como era de esperar, observamos fluctuaciones a lo largo del tiempo, excepto para la creatinina dentro del rango fisiológico para el ganado (26, 27). En ambos grupos, las concentraciones plasmáticas de creatinina fueron consistentemente más altas que los valores de referencia utilizados por el laboratorio que realizó los análisis. Sin embargo, todos los animales permanecieron sanos y no mostraron otros signos de intoxicación potencial durante todo el experimento. Se puede especular si las concentraciones de creatinina más altas observadas se debieron a alguno de los efectos ambientales que pueden afectar los umbrales y la amplitud de los intervalos de referencia, como se informó en otra parte (27). Tampoco hubo efecto del tratamiento con DIF sobre el peso corporal, que se mantuvo constante en las novillas que recibieron una dieta de mantenimiento, mientras que aumentó con el tiempo en los toros criados en pastos.

La fertilidad es un componente clave de las pruebas de toxicidad. Se han descrito varios productos químicos como disruptores endocrinos para el ganado (28) y, por lo tanto, con el potencial de afectar el proceso reproductivo y comprometer la fertilidad (29). Sin embargo, la toxicidad reproductiva del diflubenzurón se evaluó principalmente en especies no objetivo, especialmente en roedores. de Barros et al. (11) observaron que la exposición subaguda de ratas macho al diflubenzurón se asoció con una disminución del peso testicular y la producción diaria de espermatozoides, aunque no se encontraron alteraciones en la morfología de los espermatozoides. La extrapolación de estos resultados a otras especies, sin embargo, requiere precaución, particularmente debido a las diferencias en la fisiología de ambas especies y en las dosis utilizadas. Curiosamente, hay muy pocos informes que evalúen la toxicidad del diflubenzurón en la reproducción del ganado. Un estudio realizado a fines de la década de 1970 con terneros machos jóvenes de Holstein no encontró ningún efecto del diflubenzurón en el esperma (30). Sin embargo, en ese estudio se realizó una sola evaluación del semen. En el presente estudio, la ventana de tiempo (56 días) utilizada casi abarcó el ciclo del epitelio seminífero y la duración de la espermatogénesis en el ganado (31), por lo que pudimos evaluar los efectos potenciales a lo largo del tiempo. Además, mediante el uso de CASA, una técnica analítica mucho más sensible, evaluamos una variedad de criterios de valoración cinéticos de los espermatozoides. Sin embargo, no se detectó evidencia de efectos perjudiciales del diflubenzurón.

Un sesgo potencial de los estudios que evalúan la recuperación de AOC y, por lo tanto, el rendimiento embrionario es la distribución desigual de las vacas que muestran AFC alta o baja. La población de folículos ováricos tiene una distribución similar a Weibull, en lugar de gaussiana, con unos pocos animales que presentan más de 100 folículos antrales en un momento dado (32). Se han reportado donantes que producen más de 500 AOC (33), por lo que una distribución aleatoria de donantes dentro de los tratamientos puede dar lugar a un sesgo significativo. En el presente estudio, utilizamos una estrategia de distribución equilibrada, asegurando que no hubiera diferencias ni en la AFC ni en el número de folículos aspirados o AOC recuperados en la primera sesión de OPU-IVEP entre los grupos GC y DIF.

En novillas, como se observó para toros, no hubo efecto de diflubenzurón en ninguno de los criterios de valoración evaluados. Se esperaban diferencias a lo largo del tiempo, particularmente debido a la tendencia de reducción en la recuperación de AOC en donantes de Bos taurus indicus sometidos a OPU repetidas (34). Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que aborda los posibles efectos peligrosos del diflubenzurón en la calidad de los ovocitos y el potencial de desarrollo en el ganado. En los insectos, el diflubenzurón actúa no solo sobre la formación de quitina, sino también directamente sobre la reproducción en hembras adultas, reduciendo las poblaciones de folículos, la formación de yemas y la fecundidad (13, 35). Los mecanismos subyacentes a estos últimos efectos, sin embargo, no se comprenden completamente. Los posibles efectos perjudiciales sobre la reproducción natural en especies grandes y monoovulares, como el ganado, pueden ser difíciles de demostrar, debido al elevado número de animales necesarios y a la dificultad de controlar otros efectos ambientales. En este sentido, el modelo OPU-IVEP utilizado fue particularmente importante para asegurar la evaluación de un alto número de gametos (>800 por grupo), así como la evaluación de su potencial de desarrollo durante el período crítico que abarca la maduración, la fertilización y el desarrollo temprano del embrión. En ambos grupos (CG y DIF), la recuperación y calidad de los ovocitos, así como las tasas de escisión y embriones, fueron similares, y dentro de las reportadas para la raza Nelore (20, 32, 36). Por lo tanto, los resultados actuales sugieren que no hay interferencia del tratamiento con diflubenzurón en las últimas etapas de la foliculogénesis y la maduración de los ovocitos, de manera diferente a lo que se observa en animales no cordados.

5. Conclusión

En resumen, no hay evidencia de un efecto perjudicial de los tratamientos a corto plazo con diflubenzurón, dentro de la dosis recomendada, sobre la calidad de los gametos o el potencial de desarrollo embrionario en el ganado bovino.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que apoyan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración ética

El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Comité de Ética en el Uso de Animales de Embrapa (Protocolo CEUA-002/2022). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones del autor

MP y JV: conceptualización, supervisión y metodología. MP, RF y JV: financiación. MX, LM, RM, DM, JB y JV: investigación. JV: análisis estadístico. MX, RF, RA y JV: escritura, borrador original y redacción, revisión y edición. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión presentada.

Financiación

El apoyo financiero fue proporcionado por el Proyecto Embrapa 30.19.90.006.00.00 y el Proyecto FAPDF 00193-00000613/2023-95.

Reconocimientos

Los autores agradecen a Champion Farmacoquímica LTDA por suministrar la formulación comercial de diflubenzurón utilizada.

Conflicto de intereses

MX y MP fueron empleados de Bio Biotecnologia da Reprodução Animal. RF y JV fueron empleadas por Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

Los autores restantes declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Referencias