Evaluación de P22 ELISA para la detección de anticuerpos específicos de Mycobacterium bovis en el líquido oral de cabras
Evaluación de P22 ELISA para la detección de anticuerpos específicos de Mycobacterium bovis en el líquido oral de cabras
Javier Bezos1,2*, 
Álvaro Roy1, Lucía de Juan1,2, Beatriz Romero1, Inmaculada Moreno3, Alberto Gómez-Buendía1, Irene Agulló-Ros4, Lucas Domínguez1,2 y Mercedes Domínguez3- 1Centro de Vigilancia Sanitaria de 1VISAVET, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, España
- 2Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, España
- 3Unidad de Inmunología Microbiana, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Investigación Carlos III, Madrid, España
- 4Grupo de Investigación en Sanidad Animal y Zoonosis, Departamento de Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas, Facultad de Veterinaria, Universidad de Córdoba, Córdoba, España
El diagnóstico ante mortem de tuberculosis (TB) en rumiantes se basa principalmente en la prueba de tuberculina intradérmica y el ensayo IFN-γ. Las pruebas basadas en anticuerpos (Ab) han surgido como herramientas potenciales para la detección de animales infectados por tuberculosis utilizando suero, plasma o incluso muestras de leche. Los fluidos orales también se han evaluado como muestras alternativas para detectar Abs específicos contra Mycobacterium bovis en cerdos o jabalíes, pero no en rumiantes. El objetivo de este estudio fue, por lo tanto, evaluar el rendimiento de un ELISA en casa para el diagnóstico de tuberculosis (P22 ELISA) en cabras como modelo experimental para el diagnóstico de la tuberculosis utilizando muestras de líquido oral. Las muestras de líquido oral de 64 cabras de un rebaño infectado con tuberculosis (n = 197) y todos los animales de un rebaño libre de tuberculosis (n = 113) se analizaron utilizando el ELISA P22. La sensibilidad estimada (Se) y la especificidad (Sp) fueron del 34,4 % (IC del 95%: 22,4-45,6) y del 100 % (IC del 95%: 97,4-100), respectivamente. El punto de corte óptimo se estableció en el 100 % según el análisis de ROC. Aquellos animales con un nivel más alto de Abs en su líquido oral alcanzaron una puntuación de lesión más alta (p = 0,018). De hecho, al tener en cuenta solo el entorno de los animales con lesiones graves (n = 16), el ELISA mostró un Se del 75 % (IC del 95 %: 53,7-96,2). Los resultados del presente estudio sugieren que el ELISA P22 es muy específico, pero tiene un valor limitado para detectar animales infectados en muestras de líquidos orales. Sin embargo, su rendimiento es significativamente mayor en presencia de lesiones graves.
Introducción
La tuberculosis animal (TB) es una infección zoonótica causada principalmente por Mycobacterium bovis y, más raramente, por otros miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) (1). Los programas de control llevados a cabo para rumiantes como el ganado vacuno y la cabra se basan principalmente en una estrategia de prueba y sacrificio utilizando las pruebas de tuberculina intradérmica única y comparativa (SIT y CIT), ambas basadas en la respuesta inmune mediada por células (2). El ensayo de liberación de interferón gamma (IGRA), que es una prueba de diagnóstico auxiliar oficial para la tuberculosis bovina, se utiliza para maximizar la detección de animales infectados y también se basa en la respuesta inmunitaria celular (3).
Las pruebas serológicas, en los últimos años, han surgido como una posible prueba auxiliar para el ganado, e incluso pueden ser una primera opción para la vida silvestre debido a sus ventajas en comparación con las pruebas basadas en células (4, 5). Además, las pruebas serológicas podrían ser una herramienta de diagnóstico valiosa en forma de pruebas de detección con las que detectar la tuberculosis a nivel de rebaño y se ha demostrado que maximizan la detección de rumiantes infectados por tuberculosis cuando se utilizan en combinación con pruebas basadas en células (6-8). Un ELISA basado en el complejo proteico P22 recientemente desarrollado (P22 ELISA) ha mostrado un alto rendimiento en términos de sensibilidad (Se) y especificidad (Sp) en rumiantes (4, 6, 8, 9).
También se han evaluado muestras no invasivas y fáciles de recopilar otras que no sean suero y plasma para la detección de Abs específicos contra varias enfermedades, incluida la tuberculosis, una de las cuales son los fluidos orales (10–13). Estudios anteriores han evaluado el rendimiento del ELISA comparando las muestras de leche con las del suero para el diagnóstico de tuberculosis, y han obtenido un Se y Sp similares (14, 15). Sin embargo, el uso de muestras de leche está restringido a los animales lácteos. El líquido oral, que es un líquido biológico, puede, mientras tanto, permitir el monitoreo rutinario del estado de salud de los animales debido al método mínimamente invasivo y no estresante empleado para recogerlo, que puede ser realizado por personal con un entrenamiento mínimo. Además, a diferencia del caso de las muestras de leche, no es necesario que el animal esté lactante y permita que se muestreen machos y aquellos animales que no producen leche (niños, hembras no lactantes o rebaño de carne) (11) Además, se han propuesto muestras de líquido oral como una muestra biológica alternativa mediante la cual detectar Abs específicos contra M. bovis en ja De hecho, se han utilizado muestras de líquidos orales en la lucha contra otras enfermedades porcinas, como la peste porcina clásica, la gripe o el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (RSPR) (16-20), lo que sugiere que los líquidos orales son muestras valiosas para la vigilancia y el control de la tuberculosis y otras enfermedades en suidas a través del uso de plataformas de
A pesar de su uso en poblaciones de cerdos, pocos estudios han evaluado pruebas serológicas mediante el empleo de muestras de líquido oral en rumiantes para detectar anticuerpos contra el virus de la fiebre aftosa (FMDV) o el virus de Schmallenberg (SBV) en bovinos (22, 23). Con respecto a la tuberculosis, no se han publicado previamente estudios que utilicen muestras de líquido oral para el diagnóstico de tuberculosis basado en anticuerpos en rumiantes domésticos, a su leal saber y entender.
Dada la utilidad de las muestras de líquido oral en otras especies, hemos adaptado un ELISA P22 para analizar muestras de líquido oral en cabras. El objetivo principal del presente estudio fue evaluar, por primera vez, la utilidad de las muestras de líquido oral en lo que respecta a la detección de anticuerpos específicos contra M. bovis en rumiantes.
Materiales y métodos
Diseño de estudio y rebaños de estudio
El estudio se realizó con dos rebaño de cabras de cría de Guadarrama ubicadas en el centro de España, uno de los cuales estaba infectado por M. bovis (rango: animales de 1 a 7 años) y uno de los cuales estaba libre de tuberculosis (rango: animales de 1 a 6 años), que se utilizaron para las estimaciones de Se y Sp, respectivamente. El Se se evaluó en una manada (n = 197) en la que se aisló a M. bovis SB0121. Este rebaño fue sometido a una prueba SIT, una prueba CIT y una IGRA, que mostraron una prevalencia aparente de 87,5, 67,7 y 53,8%, respectivamente. Debido a la alta proporción de reactores, todos los animales fueron sacrificados y sometidos a un análisis post mortem. Se evaluó la presencia de lesiones compatibles con la tuberculosis durante el sacrificio y se recogieron muestras de tejido para el cultivo bacteriológico y el aislamiento de bacterias en el laboratorio. Los animales con cultivo positivo (se aisló M. bovis SB0121) y aquellos con lesiones compatibles con la tuberculosis (n = 64) se incluyeron en el estudio para evaluar el Se del ELISA P22 en muestras de líquido oral. El Sp se evaluó en un rebaño libre de tuberculosis (n = 113), en función de su historial de estado libre de tuberculosis y los resultados negativos obtenidos de las pruebas SIT, CIT y serológicas (P22 ELISA) de los animales en los últimos tres eventos de prueba en los últimos 2 años. La vacuna Gudair (CZ Vaccines, Porriño, España) contra la paratuberculosis de M. avium subsp. (MAP) se había administrado a los animales de ambos rebaño a la edad de 6 meses como parte de sus programas de vacunación.
Los animales incluidos en el estudio fueron sometidos a pruebas SIT y CIT e IGRA. Las muestras de suero y líquido oral se recogieron antes de la prueba intradérmica y se analizaron con un ELISA P22. Los resultados obtenidos se compararon con el análisis post mortem.
Los animales del presente estudio no se consideraron animales de experimentación. Todos los procedimientos de manipulación y muestreo se realizaron de conformidad con la legislación española (Real Decreto 720.7/2011).
Recogida de muestras de suero y líquido oral
Se recogieron muestras de sangre de la vena yugular mediante punción venosa, utilizando tubos de suero de plástico (BD Vacutainer Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EE. UU.). Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente durante 24 horas y luego se centrifugaron durante 15 minutos a 650 g, después de lo cual los sueros se almacenaron a -20 °C hasta el análisis. Las muestras de líquido oral se obtuvieron de las mismas cabras frotando en seco las bocas de los animales, que se limpiaron de antemano. En el laboratorio, los hisopos secos se introdujeron en tubos de 2 ml con un medio compuesto por 4 μl de azidiol (Panreac, España) y 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Estos hisopos secos se conservaron a 4 °C durante 8 h, después de lo cual las muestras se centrifugaron a 13.000 g durante 5 minutos, y se obtuvo una alícuota de 500 μl del sobrenadante y se almacenó a -20 °C hasta la prueba de ensayo.
P22 ELISA
Las muestras de suero se analizaron empleando un ELISA P22, como se describió anteriormente por Infantes-Lorenzo et al. (4). El protocolo se adaptó a las muestras de líquido oral de la siguiente manera: la dilución óptima del líquido oral se determinó evaluando la reactividad de las muestras diluidas de 1:2 a 1:128, y finalmente se eligió una dilución de 1:2. Se añadieron cien microlitros de anticuerpos de detección a 1:2.000, y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como antes, el anticuerpo secundario [Rabbit anti sheep IgG(H/L)-HRP] (Southern Biotech, EE. UU.) setituló de 1:500 a 1:8,000 para elegir la dilución óptima.
Los resultados se expresaron como un porcentaje de ELISA P22 (E%), que se calculó utilizando la siguiente fórmula:
E%=[media de muestra OD/(2×media de OD de control negativo)] ×100
En el caso de las muestras de suero, los valores del E% de 100 o más se consideraron positivos, como se describe en otra parte (4), mientras que en el caso de las muestras de líquido oral, se calculó un corte utilizando un análisis de la característica de funcionamiento del receptor (ROC), y los valores del E% de 100 o más se consideraron positivos.
Pruebas de tuberculina intradérmicas
Las pruebas SIT y CIT se llevaron a cabo mediante la inoculación intradérmica de 0,1 ml de PPD bovina y aviar (CZ Vaccines, Porriño, España) en el sitio derecho e izquierdo de la región cervical, respectivamente, utilizando una jeringa Dermojet (Akra Dermojet, Pau, Francia). Todas las pruebas se realizaron de acuerdo con la Directiva 64/432/CEE del Consejo y el Real Decreto RD2611/1996, y las reacciones se interpretaron como se describió anteriormente (24).
Ensayo de liberación de interferón-Gamma
Se recogieron muestras de sangre de la vena yugular utilizando tubos evacuados (BD Vacutainer Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EE. UU.) con heparina para detectar la producción de IFN-γ. Las muestras de sangre se procesaron como se describió anteriormente (25). La sangre se incubó a 37 °C en una atmósfera humidificada en presencia de antígenos (PPD-B y PPD-A) durante 18-20 h. Luego, las muestras se centrifugaron a 2500 rpm durante 15 minutos, y se recogió el sobrenadante. La liberación de interferón gamma se midió utilizando un IGRA comercial diseñado para cabras (kit de TB de Bovigam, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y los resultados se interpretaron como se describe en otra parte (26).
Análisis post mortem
Las lesiones gruesas compatibles con TB (TBL) incluyen lesiones nodulares blanquecinas que contienen material caseoso, que pueden ser mineralizadas en el centro y encapsuladas por tejido fibroso (27, 28). La inspección y la puntuación semicuantitativa del TBL presente en los lóbulos pulmonares y los ganglios linfáticos (LN) de los animales sacrificados se llevaron a cabo sobre la base de un modelo anterior de valoración de lesiones propuesto por Vordermeier et al. (29), con algunas modificaciones. Este sistema de puntuación se basa en el tamaño y el número de lesiones, además del porcentaje del órgano afectado, de la siguiente manera: 0, sin lesiones visibles; 1, una pequeña lesión aparente al cortar; 2, <5 lesiones de <10 mm de diámetro; 3, más de cinco lesiones de <10 mm de diámetro o una lesión >10-30 mm de diámetro y/o <50% del En los pulmones, se otorgó un punto extra a los animales que tenían adherencias pleurales. Todos los lóbulos pulmonares (apicales izquierdos, diafragmas izquierdos, apicales derechas, cardíacos rectos, accesorios derecho y diafragmas derecho) se examinaron individualmente y se sumaron las puntuaciones de estos lóbulos para calcular la puntuación pulmonar total. Los LN de la cabeza (retrofaríngeos) y los LN pulmonares (traqueobronquiales y mediastínicos) también se examinaron individualmente, y se sumaron las puntuaciones de los diferentes LN para calcular la puntuación total.
Se utilizaron muestras de tejido de los pulmones y los LN retrofaríngeo, traqueobronquial y mediastínico de 64 animales con lesiones de tuberculosis se utilizaron para el cultivo bacteriológico en Löwenstein-Jensen con medio piruvato de sodio (Difco, España), como se describió anteriormente (15). Los animales con lesiones compatibles con la tuberculosis en los pulmones o en los diferentes LN analizados en el presente estudio se consideraron positivos para la tuberculosis. A continuación, se realizó una comparación entre los resultados de la ELISA P22 y la puntuación de lesión obtenida para los pulmones y/o los LN de la cabeza y pulmonar.
Análisis estadístico
Los intervalos de confianza del 95 % de Wilson (IC del 95 %) se calcularon para el porcentaje de reactores positivos en las diferentes pruebas. Se realizó un análisis ROC para definir el valor de corte óptimo (Material suplementario). Los valores cuantitativos, como el E% en muestras de líquidos orales con respecto a la puntuación de TBL, se alcanzaron para los dos rebaños diferentes y se compararon utilizando la prueba U de Mann-Whitney. Además, la variación de los valores cuantitativos de las técnicas de diagnóstico con respecto a la puntuación TBL se calculó utilizando un R cuadrado (R2) e interpretado de la siguiente manera: 0,00-0,25 pobre, 0,26-0,50 justo, 0,51–0,75 moderado y 0,76-1,00 sustancial. Todas las pruebas estadísticas se llevaron a cabo utilizando SPSS Statistics 25 (IBM, Nueva York, NY, EE. UU.), y se interpretaron considerando un valor p de 0,05 para determinar la significación estadística.
Resultados
Con respecto al ELISA P22 realizado con muestras de líquido oral, se calculó una curva ROC utilizando muestras de animales infectados con tuberculosis (n = 64) y libres de tuberculosis (n = 113). El punto de corte óptimo se estableció en el 100 %, en el que se observaron los Se y Sp más altos. Un punto de corte más alto o más bajo causó una pérdida de Se con un Sp constante, o viceversa, y fue por esta razón que se eligió un E% de 100 como punto de corte.
En el presente estudio, 22 de los animales infectados por TB con 64TB obtuvieron resultados positivos para el ELISA P22 cuando usaron líquidos orales, lo que produjo un Se estimado del 34,4% (IC del 95%: 22.4-45,6). Todos los animales del rebaño libre de tuberculosis dieron negativo al ELISA P22 al usar muestras de líquido oral, alcanzando un Sp del 100 % (IC del 95 %: 96,7-100; Tabla 1). El uso del punto de corte seleccionado permitió obtener el valor predictivo positivo [100% (IC del 95%: 97,4–100)], el valor predictivo negativo [77,2% (IC del 95%: 71,1–83.2)] y el área debajo de la curva (0,827). Diecinueve de las 22 cabras P22 ELISA-positivas tenían similares lesiones compatibles con la tuberculosis en sus pulmones, y 20 de las 22 las tenían en diferentes LN (17 de 22 en ambas ubicaciones). Teniendo en cuenta solo el entorno de 16 animales con lesiones graves (puntuación de lesión superior a 10), el ELISA mostró un Se del 75 % (IC del 95 %: 53,7-96,2). Además, aquellos animales que fueron positivos para el ELISA P22 en lo que respecta a las muestras de líquido oral tuvieron una puntuación de TBL pulmonar significativamente más alta (p = 0,018) (Figura 1).
TABLA 1. Resultados utilizados para determinar la sensibilidad y especificidad del líquido oral P22 ELISA para el diagnóstico de tuberculosis en cabras.
FIGURA 1. Puntuación de lesión pulmonar para animales negativos y positivos probados con P22 ELISA con muestras de líquido oral.
Al usar las muestras de suero, 56 de las cabras infectadas por Bóvis de 64 M. fueron positivas para el ELISA P22 (E% > 100), con un Se del 87,5% (77.2-93,5, IC del 95%) (Tabla 2). Los animales infectados por M. bovis tenían un E% más alto al emplear el suero (mediana = 653,9 E%; p < 0,0001) que cuando empleaban las muestras de líquido oral (mediana = 66,6 E%) (Figura 2). Se obtuvieron muestras similares de E% para líquido oral (mediana = 46,2 E %) y suero (mediana = 55,2 E%) de animales en el rebaño libre de tuberculosis, y no se observaron diferencias significativas (p = 0,852). Finalmente, hubo una correlación muy pequeña entre los resultados de P22 obtenidos para las muestras de líquido oral y suero (R2 = 0,023) y entre los resultados del E% obtenidos para el líquido oral y las lesiones compatibles con la tuberculosis observadas en los pulmones de las cabras sacrificadas (R2 = 0,142) y la cabeza y los LN pulmonares: retrofaríngeo (R2 La correlación entre el E% del líquido oral y la puntuación total de la lesión fue ligeramente mayor (R2 = 0,225).
TABLA 2. Resumen de las pruebas de diagnóstico de tuberculosis ante mortem (TB) y análisis post mortem en las cabras en estudio.
FIGURA 2. ELISA% en muestras de líquido oral (gris) y suero (blanco) observadas en rebaño sin tuberculosis e infectados con tuberculosis.
Finalmente, con respecto a las técnicas basadas en la respuesta inmune celular, de las 64 cabras en el rebaño infectado con TB, 55 y 37 se consideraron reactores positivos para la prueba SIT [(85,9% (IC 95%: 75.3–92.4)] y la prueba CIT [(57,8% (IC 95%: 455.6–69.1)], respectivamente. En este rebaño, 38/64 animales fueron positivos para IGRA, con una prevalencia aparente del 59,4% (IC del 95%: 47,1-70,5) (Tabla 2). A este respecto, no hubo correlación entre IGRA y los resultados de la puntuación total de la lesión (R2 = 0,004), que fue menor que la correlación observada con E% cuando se utilizaron muestras de líquido oral. Se observó una mala correlación entre las pruebas SIT y CIT y los resultados de la puntuación total de la lesión (R2 = 0,042 y 0,069, respectivamente) (Material complementario).
Discusión
En el presente estudio, se desarrolló y evaluó por primera vez un ELISA interno con el que detectar anticuerpos específicos contra M. bovis en muestras de líquido oral en cabras. Los resultados mostraron un Sp alto pero un Se limitado del ELISA P22 para el diagnóstico de tuberculosis utilizando muestras de líquido oral de cabras.
El ELISA P22 se había evaluado previamente para el diagnóstico de tuberculosis en cabras utilizando sueros y muestras de leche, mostrando resultados prometedores en lo que respecta a Se y Sp (4, 8, 15). Con respecto a las muestras de líquido oral para el diagnóstico de tuberculosis, se llevó a cabo un estudio anterior utilizando un ELISA basado en PPD-B en jabalí (13). Sin embargo, a su leal saber y entender, no se dispone de estudios anteriores que utilicen un ELISA para la detección de anticuerpos específicos contra la tuberculosis en muestras de líquidos orales de rumiantes. Con respecto a Sp, el ELISA P22 logró un excelente Sp del 100 %, que fue mayor que el obtenido por las pruebas serológicas descritas hasta la fecha para el diagnóstico de tuberculosis en cabras utilizando muestras de suero o leche (4, 7). La interferencia de la vacunación contra el MAP en el diagnóstico de tuberculosis en cabras se ha descrito anteriormente en rebaño sin tuberculosis en otros países (30). Además, diferentes estudios han informado de una Sp más baja [58.3 (IC del 95%: 42.2–72.9)−96 (IC del 95%: 90.1–98.4)] del P22 ELISA en cabras vacunadas por MAP que en cabras no vacunadas (4, 31). El Sp más alto obtenido en nuestro estudio [100% (IC del 95%: 96,7-100)] utilizando líquidos orales se relacionó con el Se bajo logrado. Por lo tanto, aunque ambos rebaños estudiados aquí fueron vacunados contra la paratuberculosis por M. avium subsp. (MAP), no se demostró una reacción cruzada en la prueba de líquido oral de la tuberculosis debido a la vacunación MAP en nuestro estudio utilizando el punto de corte recomendado. Sin embargo, a pesar del rendimiento óptimo del ELISA P22 cuando se utilizaron muestras de suero y leche, el presente estudio mostró que la utilidad de las muestras de líquido oral en lo que respecta a la detección de la infección por M. bovis en cabras fue limitada, a diferencia de lo que ocurrió en un estudio anterior con jabalíes que reportó una Se del 67,3 % La realización de una prueba de diagnóstico generalmente se evalúa teniendo en cuenta los resultados de un cultivo bacteriológico que se considera el estándar de oro. Ninguna de las pruebas ante mortem utilizadas para definir la infección de tuberculosis en cabras es perfecta en términos de Se y Sp, y por lo tanto no son indicadores precisos del estado real de la tuberculosis de los animales. A este respecto, los resultados de la serología se utilizaron como referencia para definir el estado de la infección en el estudio del jabalí, y esto podría haber afectado a la precisión de la prueba (13). De hecho, cuando el Se del P22 ELISA realizado con muestras de líquido oral se estimó utilizando los resultados de suero como patrón oro, el Se fue ligeramente más alto en nuestro estudio [39,3% (IC del 95%: 27,6–52,4) datos no mostrados], pero aún más bajo que el reportado para el jabalí.
Es necesario indicar que en el presente estudio, el ELISA P22 alcanzó un Se más alto al usar muestras de suero que cuando se usaron muestras de líquido oral. Además, las técnicas de diagnóstico de Se de TB basadas en la detección de anticuerpos específicos se pueden mejorar mediante el uso de muestras recogidas después de la inoculación de PPD. Este fenómeno, que se denomina efecto impulsor, se ha notificado en diferentes especies (8, 32,33). Se ha sugerido que el efecto de refuerzo en la respuesta de anticuerpos es una metodología valiosa para aumentar la Se de los ensayos serológicos en rumiantes (6, 8). Sin embargo, se requieren más estudios para evaluar este efecto de refuerzo en muestras de líquidos orales.
La Se de las herramientas de detección de anticuerpos es generalmente inferior a la reportada cuando se utiliza herramientas de diagnóstico basadas en la respuesta inmunitaria celular (34). Sin embargo, en este trabajo, se obtuvo un Se más alto cuando se usaron muestras de suero (87,5%) que cuando se usaron las pruebas IGRA (59,4%), SIT (85,9%) y CIT (57,8%), incluso en ausencia del efecto de refuerzo. Estos resultados apoyan el valor de las pruebas serológicas como herramienta para el diagnóstico de la tuberculosis en rumiantes, como se observó en estudios recientes (4, 6, 8, 9), y la importancia de desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico de la tuberculosis para maximizar la detección de animales infectados.
Es bien sabido que la producción y concentración en las muestras de las diferentes inmunoglobulinas (Ig) pueden diferir entre las especies. En este contexto, la concentración de IgG en el líquido oral de las cabras es significativamente menor que en los cerdos (35), lo que puede explicar las diferencias en el Se mencionado anteriormente. Los niveles de anticuerpos IgA en rumiantes son, por el contrario, más altos que en otras especies, lo que podría explicar las diferencias observadas en el diagnóstico al emplear ELISA basados en IgA o IgG para otras infecciones como la enfermedad de Schmallenberg (23). Además, estudios recientes apoyan la teoría de que la detección de IgA en muestras de fluidos orales parece ser más robusta y estable a lo largo del tiempo en cerdos (20). La producción de ab en el líquido oral está relacionada con la inmunidad de la mucosa y, por lo tanto, la estimulación del antígeno local es de suma importancia si se quieren alcanzar altos niveles de IgA en esa muestra. Esto también podría explicar las diferencias observadas entre las muestras de suero y de líquido oral. A este respecto, en el presente estudio, se observó una mejor correlación entre el E% en las muestras de líquidos orales y la gravedad de las lesiones en los LN retrofaríngeos. Estos LN están más cerca de las glándulas salivales en comparación con los LN pulmonares (mediastínico y traqueobronquial), pero se requieren estudios adicionales para confirmar la correlación potencial entre una respuesta inmune local más grave y una mayor producción de anticuerpos en rumiantes.
Por último, es necesario indicar que, en este estudio, se utilizó un modelo de cabra para evaluar el rendimiento del ELISA P22 cuando se utilizaron muestras de líquido oral. Estudios anteriores han mostrado resultados prometedores de plataformas basadas en anticuerpos para el diagnóstico de otras enfermedades (por ejemplo, FMDV o SVB) cuando se utilizan muestras de líquidos orales en ganado (22,23). Los resultados del presente estudio sugieren un rendimiento similar o limitado del P22 ELISA en muestras de líquido oral de ganado debido a la alta presión diagnóstica como consecuencia de los programas oficiales de erradicación, ya que es difícil encontrar animales en una etapa avanzada de infección. Sin embargo, sería interesante la realización de estudios similares para confirmar esta hipótesis.
En conclusión, el uso de biomarcadores de muestras de líquido oral para el diagnóstico de tuberculosis en rumiantes todavía está lejos de aplicarse de forma rutinaria y requiere más validación e investigación. Los resultados generales obtenidos del presente estudio sugieren que el empleo del ELISA P22 para la detección de anticuerpos específicos en muestras de líquidos orales es muy específico, pero tiene un valor limitado en lo que respecta a la detección de animales infectados. Sin embargo, su rendimiento es significativamente mayor en presencia de lesiones graves, detectando una alta proporción de los animales en el rebaño que tienen estas lesiones.
Declaración de disponibilidad de datos
Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo/Material complementario, se pueden dirigir más consultas al autor correspondiente.
Declaración ética
No se requirió una revisión ética y aprobación para el estudio de animales porque los animales en el presente estudio no se consideraban animales de experimentación. Todos los procedimientos de manipulación y muestreo se realizaron de conformidad con la legislación española (Real Decreto 720.7/2011). No se obtuvo el consentimiento informado por escrito para la participación de los propietarios porque los animales tienen un propietario, pero él colabora con nuestro centro de investigación y está al tanto de todos los estudios y publicaciones (prefiere ser anónimo).
Contribuciones del autor
JO, JI-L y JB escribieron el manuscrito y diseñaron las figuras. JO y JI-L realizaron la búsqueda de literatura. JO, JI-L, AG-B e IA-R realizaron los experimentos. JO, JI-L, JB, LJ, IM, IA-R, ÁR, LJ, BR y MD interpretaron los datos. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.
Financiación
Este estudio fue financiado por el proyecto Herramientas para alcanzar la erradicación de la tuberculosis caprina (GoaTBfree) (PID2019-105155RB-C31) y el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación del Gobierno español. JO contó con el apoyo de una beca de contrato de la FPU (Formación de Profesorado Universitario) proporcionada por el Ministerio Español de Ciencia, Innovación y Universidades (FPU18/05197).
Conflicto de intereses
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Nota del editor
Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o reclamo que pueda ser hecho por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Ana Belén Martín y Cristina Viñolo su asistencia técnica.
Material complementario
El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2021.674636/full#supplementary-material
Referencias
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Palabras clave: diagnóstico, cabra, tuberculosis, líquido oral, P22 ELISA
Cita: Ortega J, Infantes-Lorenzo JA, Bezos J, Roy Á, de Juan L, Romero B, Moreno I, Gómez-Buendía A, Agulló-Ros I, Domínguez L y Domínguez M (2021) Evaluación de P ELISA22 para la detección de anticuerpos específicos de Mycobacterium bovis en el líquido oral de cabras. Frente. Veterinario. Sci. 8:674636. doi: 10.3389/fvets.2021.674636
Recibido: 01 de marzo de 2021; Aceptado: 20 de julio de 2021;
Publicado: 11 de agosto de 2021.
Editado por:
Federico Blanco, Instituto Nacional de Tecnología Agrícola (INTA), Argentina
Revisado por:
Semmannan Kalaiyarasu, ICAR-Instituto Nacional de Enfermedades Animales de Alta Seguridad (ICAR-NIHSAD), India
Michele Ann Miller, Universidad de Stellenbosch, Sudáfrica
Gobena Ameni, Universidad de Addis Abeba, Etiopía
Copyright © 2021 Ortega, Infantes-Lorenzo, Bezos, Roy, de Juan, Romero, Moreno, Gómez-Buendía, Agulló-Ros, Domínguez y Domínguez. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución de Creative Commons (CC BY).
*Correspondencia: Javier Bezos, jbezosga@visavet.ucm.es
†Estos autores han contribuido por igual a este trabajo
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