Introducción

La hiperplasia interdigital (IH; fibroma interdigital; maíz en bovinos) es el crecimiento de pliegues cutáneos de la unión de la piel y el cuerno en una o ambas garras y la formación de piel interdigital hiperplásica de tamaño variable localizada dentro de la hendidura interdigital (1-3). El HI puede tener una disposición hereditaria en ovinos y bovinos, y los factores predisponentes en el ganado bovino pueden incluir estiramiento de las inserciones de los ligamentos interdigitales distales, pezuñas de forma anormal, sobrepeso de los animales, podredumbre bovina o pisos resbaladizos (1, 4–6). El HI se diagnostica con mayor frecuencia en bovinos adultos y ocasionalmente ocurre en ovejas y cabras (2, 7). El grado de cojera depende del tamaño de la lesión y de la presencia de infección del tejido digital. Se ha notificado que la dermatitis interdigital ovina (OID, escaldadura del pie) y la dermatitis digital bovina (TDC) se producen simultáneamente con el HI en ovinos (3) y bovinos (6, 8), respectivamente. La OID es causada por Fusobacterium necrophorum (F. necrophorum) y a menudo se desarrolla a ambos lados del IH, causando más dolor y cojera (3).

En bovinos, varios estudios abordaron la asociación entre el TDC y el HI (9, 10). Desde la amplia diseminación de las lesiones clásicas de BDD en la población bovina, las sobreinfecciones de lesiones de HI con Treponema spp. asociado a BDD (IH+BDD) han aumentado (11). Las especies de Treponema, implicadas en la TDC, pertenecen principalmente a los filogrupos Treponema medium, Treponema phagedenis y Treponema pedis (12, 13). Estos tres filogrupos son también los principales agentes etiológicos de la dermatitis digital ovina contagiosa (CODD) (14-16). También se han aislado otras bacterias asociadas a la cojera de las lesiones de TOC; en particular, Dichelobacter nodosus (D. nodosus) y F. necrophorum (14, 17). D. nodosus es el principal agente etiológico de la podredumbre ovina y se considera un factor de riesgo para la enfermedad de Alzheimer (14, 18).

Este es el primer reporte de IH+CODD en ovejas, y tuvo como objetivo describir los hallazgos clínicos, histopatológicos y moleculares en dos casos clínicos de IH+CODD.

Presentación del caso

En enero y febrero de 2022, un carnero (Texel, 5 años y 9 meses) y una oveja (cruza, 6 años y 10 meses) fueron inspeccionados clínicamente en el curso del control clínico de la podredumbre del pie. Ambas ovejas fueron fijadas en una manga de garras y todas las extremidades fueron puntuadas para la podredumbre de acuerdo con el Servicio Sanitario Suizo para Pequeños Rumiantes, adaptado de Egerton y Roberts (19), utilizando una escala de 0 (clínicamente sano) a 5 (pérdida completa de la cápsula del cuerno). Todas las extremidades del carnero se puntuaron como 2 (dermatitis interdigital extensa con afectación del cuerno axial), excepto la extremidad anterior izquierda que se puntuó como 3 (dermatitis interdigital grave y subrretorno del cuerno del talón y la planta del pie). Ambas extremidades traseras de la oveja fueron puntuadas como 3. Además, durante el examen se observaron lesiones ulcerativas en el área de la banda coronaria dorso-axial de ambas garras de la extremidad anterior izquierda de la oveja, que se puntuaron como CODD grado 1 según Angell et al. (20). La cojera se puntuó de acuerdo con Angell et al. (21), donde 0 = sano y 3 = cojera grave.

Tanto las extremidades posteriores del carnero como la extremidad posterior izquierda de la oveja mostraron adicionalmente HI con lesiones proliferativas y ulcerativas y fueron diagnosticadas clínicamente de acuerdo con Fiedler et al. (6), Alsaaod et al. (8) y el Comité Internacional para el Registro de Animales ICAR en bovinos como IH+BDD (Figuras 1A, B).

Figura 1. Aspecto clínico de la hiperplasia interdigital asociada a treponemas de dermatitis digital ovina contagiosa en un carnero (A), oveja (B) y tras la cicatrización clínica en la oveja (C). La oveja (B) también mostró signos de podredumbre (puntuación 3).

Después de la desinfección de la piel con cloro activo (AquaJet Anolyte, Reichenburg SZ, Suiza), se administró una anestesia locorregional interdigital a nivel de la falange distal 1 con lidocaína al 2% (Streuli Tiergesundheit AG, Uznach, Suiza). Después de 10 min, se recogió una biopsia del centro de la lesión con un punzón de biopsia estéril (4 mm de diámetro con una profundidad máxima de 7 mm) y se transfirió directamente a una placa de Petri estéril.^®

Después de la toma de muestras de biopsia, se aplicó clortetraciclina (Cyclospray, Dr. E. Graeub AG, Berna, Suiza) por vía tópica a las lesiones sin vendaje. El propietario decidió sacrificar el carnero, y la oveja fue tratada tres veces a intervalos de 2 semanas con controles regulares de las regiones afectadas durante un período de 2 meses. La curación clínica de la lesión CODD se produjo a las 2 semanas y la de IH+CODD a las 6 semanas (Figura 1C).

Tres ovejas de sacrificio, que se mantuvieron junto con las dos ovejas afectadas, pero que no mostraron ningún signo clínico de CODD o IH, sirvieron como controles negativos. Se tomaron dos biopsias post-mortem de cada oveja control, una de la corona y otra de la piel de la hendidura interdigital, y también se transfirieron directamente a una placa de Petri estéril. Las muestras de control se agruparon a nivel animal para el cribado por PCR y se evaluaron por separado mediante histopatología teniendo en cuenta las lesiones histopatológicas más graves.

Se llevaron a cabo inspecciones clínicas periódicas de las patas de ambas ovejas en el marco de un programa continuo de control de la podredumbre de las patas (licencia de experimentación animal no. SZ-34020).

Análisis histopatológicos y biológicos moleculares

Cada biopsia individual fue seccionada longitudinalmente. La mitad de cada biopsia se utilizó para el cribado por PCR y la segunda mitad se fijó en formol tamponado neutro al 10% durante 24 h. A continuación, estas muestras se incrustaron en parafina, se cortaron en secciones de 4 μm y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E), así como con tinción de plata (Warthin-Starry) para una mejor identificación de las espiroquetas y se examinaron microscópicamente.

El ADN se extrajo de las alícuotas de la biopsia utilizando un kit comercial de sangre y tejidos DNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad compatible con la PCR de los aislados de ADN se confirmó mediante PCR estándar de β-actina como se describió anteriormente (22). Posteriormente, los extractos de ADN se examinaron para detectar la presencia de ADN treponémico utilizando PCR de treponema total (TT-PCR) y ensayos de PCR específicos anidados para T. medium, T. phagedenis y T. pedis, y se realizaron de acuerdo con Moe et al. (23) y Evans et al. (24), respectivamente. Todas las pruebas de PCR se realizaron con el GoTaq Green Master Mix (Promega, Suiza). Todos los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, con excepción de la PCR de P. levii con un 2%.^®

A continuación, las alícuotas de amplicón con resultados positivos de TT-PCR y PCR anidada (T. phagedenis) se purificaron en gel utilizando NucleoSpin Gel y PCR Clean-up Kit (Marcherey-Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se sometieron a secuenciación Sanger (Eurofins Genomics) utilizando los mismos pares de cebadores que para la reacción de PCR. La alineación de las secuencias directa e inversa y la identificación de cepas similares se realizaron utilizando el servidor web NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Para encontrar la cepa más similar, solo se utilizó la parte de la secuencia, coincidiendo en la alineación.

Se realizaron PCR para D. nodosus y F. necrophorum según Sullivan et al. (17). Los cebadores para la PCR de P. levii se diseñaron con Primer Blast (NCBI). La secuencia del cebador directo (F-Primer 677) fue 5′-AAGGCAGCTTACAAAAGTA-3′ y la del cebador inverso (R-Primer 812) fue 5′-TTTCGCTTGAGAGCATACAT-3′. Los parámetros de PCR de P. levii fueron los siguientes: 5 min a 95°C, 35 ciclos (1 min, 95°C; 1 min, 54°C; 2 min, 72°C) y 5 min a 72°C. Todos los cebadores se dirigen al gen 16S rRNA, con la excepción de la manguera para F. necrophorum, que leucotoxina (lktA).

Los resultados positivos de la PCR de D. nodosus se analizaron posteriormente mediante PCR cuantitativa (qPCR) según Stauble et al. (25) con un valor de umbral de ciclo (Ct) de < 40 calificado como positivo. Esta qPCR distinguió entre los genes de la proteasa aprV2 y aprB2, lo que permitió la detección y diferenciación directa de cepas virulentas y benignas de D. nodosus, respectivamente.

Para la hibridación fluorescente in situ (FISH), se prepararon e hibridaron secciones seriadas de 4 μm como lo describieron previamente Rasmussen et al. (26). Las sondas de oligonucleótidos incluyeron sondas específicas para el género Treponema y el filotipo 1 de Treponema (PT1). Ambas sondas fueron marcadas con 5′ con el derivado de isotiocianato Cy3 (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania). La señal de hibridación se puntuó de 0 a 3 según Klitgaard et al. (27): 0 = sin hibridación, 1 = hibridación escasa, 2 = hibridación moderada y 3 = hibridación fuerte.

Resultados

El examen clínico reveló un HI grande y bilateral con lesiones proliferativas crónicas del tejido que cubría todo el HI en el carnero, mientras que un HI pequeño con una lesión ulcerosa aguda en la parte superior estaba presente en la oveja (Figuras 1A, B). Ambas ovejas mostraron pasos desiguales y fueron puntuadas como levemente cojas (puntuación = 1), ya que las extremidades afectadas no eran claramente identificables en la locomoción (puntuación = 1).

Los hallazgos histopatológicos fueron similares en las muestras de oveja y carnero (Figuras 2A, B). La epidermis era marcadamente hiperplásica y parcialmente hiperqueratósica (principalmente paraqueratosis) con áreas focal-extensas de necrosis epidérmica con presencia de numerosos neutrófilos. En la epidermis cercana, parte de los queratinocitos mostraban una degeneración celular prominente. En la superficie de la muestra se observaron colonias bacterianas de forma variable. Numerosos linfocitos y células plasmáticas, así como algunos neutrófilos y raramente eosinófilos se infiltraron en la dermis. En ambos casos, se observaron bacterias de forma helicoidal compatibles con espiroquetas en las áreas necróticas de la superficie epidérmica y entre los queratinocitos, visibles con la tinción Warthin-Starry (Figura 2C). En las muestras de los animales control, solo se observó hiperplasia epidérmica leve a moderada e inflamación dérmica linfoplasmocítica leve.

Figura 2. Aspecto histológico de la hiperplasia interdigital asociada a treponemas de dermatitis digital ovina contagiosa en un carnero (A) y una oveja (B). Tinción Warthin-Starry que muestra bacterias de forma helicoidal (flechas) compatibles con espiroquetas en el carnero (C). Aumento (100×).

Las muestras de ADN de las dos biopsias procedentes del carnero y de la oveja dieron positivo en la TT-PCR y en la PCR anidada para T. phagedenis (T. medium y T. pedis no fueron detectables). Las secuencias de nucleótidos obtenidas de los dos productos de PCR de cada biopsia procedentes del carnero y la oveja, respectivamente, mostraron una identidad del 100 y el 95,29% para Treponema PT1 (número de acceso AM942445.1) para el producto TT-PCR y del 95,92 y 97,27% para Treponema PT1 (número de acceso AM942445.1) para el producto de PCR anidado.

Además de Treponema PT1, en ambas biopsias se detectaron D. nodosus y P. levii; mientras que la PCR para F. nechrophorum se mantuvo negativa. La posterior qPCR para D. nodosus fue positiva para la cepa virulenta de D. nodosus (valores de Ct = 24,5 y 24 para dos biopsias originadas en el carnero y la oveja, respectivamente).

Las muestras de las biopsias control de las tres ovejas clínicamente sanas fueron negativas para Treponema spp. (TT-PCR y PCR anidada), D. nodosus, F. necrophorum y P. levii.

Mediante FISH, la sonda general de oligonucleótidos para Treponema spp. reveló una infiltración epidérmica treponémica severa y extensa (puntuación 3) en ambas biopsias de carnero y oveja afectados (Figuras 3A, B). El análisis adicional de FISH con la sonda de oligonucleótidos específicos de Treponema PT1 reveló una fuerte hibridación (puntuación 3) (Figuras 3C, D), nuevamente en ambas biopsias de carnero y oveja afectados. Todas las biopsias procedentes de tres ovejas control fueron negativas para Treponema spp por FISH.

Figura 3. Hibridación fluorescente in situ de biopsias de un carnero (A) y una oveja (B) con sondas para el género Treponema (marcado con Cy3). Sección de la misma biopsia hibridada con sonda de oligonucleótidos específicos de especie (marcada con Cy3) para el filotipo PT1 de Treponema en un carnero (C) y una oveja (D). Los organismos de Treponema aparecen de color amarillo; aumento (60×).

Discusión

De acuerdo con el mejor conocimiento de los autores, este es el primer informe que describe el HI asociado con CODD en ovejas. Se encontraron Treponema spp. en las lesiones proliferativas/ulcerativas de las muestras de tejido interdigital hiperplásico, lo que se confirmó mediante análisis histopatológicos y moleculares. Por el contrario, ni la PCR ni la FISH permitieron detectar Treponema spp. en los animales control.

La OID (escaldadura del pie) es causada por F. necrophorum (3) y su ausencia en ambos casos excluyó la etiología de la OID en nuestro informe. Ambas ovejas se vieron afectadas por la podredumbre del pie ovino causada por D. nodosus. La podredumbre del pie se considera un factor de riesgo para la enfermedad crónica (14, 28). Varios estudios han investigado la asociación de Treponema spp. con lesiones de CODD (14-16) y han planteado la hipótesis de que la CODD se derivaba de lesiones de BDD y puede haber cruzado la barrera de especies, principalmente por el copastoreo con el ganado (29). La CODD es una enfermedad infecciosa progresiva del pie, que se presenta como erosión/ulceración en la banda coronaria y termina en la avulsión de toda la cápsula del casco (20). Se desconocen las vías de infección y transmisión de Treponema spp. en ambos casos descritos, ya que en esta finca no se practicaba el copastoreo. Se sospecha la introducción de treponemas CODD por compra de portadores.

La hiperqueratosis paraqueratósica y la colonización espiroquetal en las áreas necróticas de la superficie epidérmica y entre los queratinocitos fueron las características histopatológicas más destacadas en ambos casos. Estos hallazgos son consistentes con las características histológicas típicas de la TDC (30, 31).

La PCR anidada para las especies de Treponema según Evans et al. (24) fue positiva para T. phagedenis con bandas del tamaño respectivo (400 pb) y negativa para T. medium y T. pedis. El análisis de la secuencia de ambos productos de PCR (T. phagedenis) de dos biopsias mostró que no eran específicos de la especie. De hecho, coincidieron con secuencias derivadas del Treponema PT1 aún no cultivado. Esto indica que especies de Treponema distintas de T. phagedenis están presentes en ambos casos de biopsia de IH+CODD y que la PCR anidada aplicada no es lo suficientemente específica para Treponema spp. en ovejas. Observaciones similares se encontraron mediante la secuenciación de las lesiones DD asociadas a Treponema spp., positivas para T. phagedenis de bisonte europeo en cautiverio (32). El gen 16S rRNA utilizado como diana está altamente conservado y presente en todas las bacterias. Esto podría explicar este fenómeno.

Treponema PT1 es el Treponema spp. más prevalente en las lesiones de TDC (95%), invadiendo profundamente el estrato espinoso (27). Dado que las muestras de la biopsia de control dieron negativo para las bacterias asociadas a la infección del pie conocidas, se sugiere que Treponema spp. está involucrado como patógeno bacteriano primario en las lesiones IH+CODD descritas. P. levii es un patógeno oportunista bien conocido y ya se ha aislado de lesiones de DI y BDD en bovinos (33, 34). En un estudio anterior, se demostró el papel de P. levii en la influencia de los procesos metabólicos globales de la microbiota BDD (35).

La HI se caracteriza por un pliegue de tejido fibroso que sobresale en el espacio interdigital. Representa una enfermedad poco común de los pies en las ovejas. Algo menos del 1% de los corderos suecos de sacrificio mostraron IH en el estudio de prevalencia de podredumbre del pie realizado por König et al. (7). El HI puede ser hereditario; Los carneros particularmente afectados no deben ser criados (3). En nuestro informe, solo la oveja con las lesiones menos graves fue tratada con la administración tópica de clortetraciclina. El tratamiento con clortetraciclina reveló ser eficaz para tratar el CODD (36). Las lesiones grandes de HI que causan cojera crónica pueden extirparse quirúrgicamente bajo anestesia local (37) o pueden tratarse con ácido salicílico como se realiza con éxito en el ganado bovino (8).

Conclusión

Este reporte es la primera descripción de lesiones IH+CODD en ovejas caracterizadas por la presencia de Treponema spp. en el tejido proliferativo y ulcerativo que cubre las lesiones IH. Se confirmó mediante análisis clínicos, histopatológicos y de biología molecular. Se identificaron treponema (PT1), D. nodosus y P. levii y cambios histológicos típicos que incluyen hiperqueratosis paraqueratósica y colonización espiroqueta. El IH+CODD debe considerarse para el diagnóstico diferencial de las lesiones interdigitales en ovejas.

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo/material complementario, las consultas posteriores pueden dirigirse al autor correspondiente.

Declaración ética

El estudio en animales fue revisado y aprobado por la licencia de experimentación animal no. SZ-34020. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los propietarios para la participación de sus animales en este estudio.

Contribuciones de los autores

MA se encargó de la recopilación de datos, los análisis moleculares y la redacción del primer borrador del manuscrito. RS y Nueva Zelanda apoyaron la recopilación de datos. SS realizó los análisis histológicos. NW y TS apoyaron los análisis de los datos. AS editó el manuscrito y supervisó el estudio. Todos los autores contribuyeron al manuscrito y aprobaron la versión final.

Financiación

Este trabajo contó con el apoyo de la Beca Heard Health Management Iniciator del Instituto de Patología Animal y Clínica para Rumiantes, Facultad Vetsuisse, Universidad de Berna, Suiza.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Nota del editor

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Referencias