Introducción

La encefalopatía espongiforme bovina (EEB) es una encefalopatía espongiforme transmisible causada por una forma mal plegada de la proteína priónica. En general, se considera que la EEB atípica es una enfermedad priónica espontánea o esporádica (1-4). La EEB atípica tiende a ocurrir en bovinos de edad avanzada y tiene una incidencia baja, con una ocurrencia constante a lo largo del tiempo. Dos variantes de EEB atípica se caracterizan como baja (L-BSE) o alta (H-BSE) en función del tamaño relativo del fragmento no glicosilado y su consiguiente aparición en Western blot (4). En 2006, se produjo un caso de H-BSE en una vaca de carne híbrida cruzada roja de 10 años de Alabama con una nueva mutación en el gen de la proteína priónica (PRNP) (5). La vaca afectada tenía una sustitución de lisina (K) por ácido glutámico (E) en el codón 211. Se determinó que el polimorfismo era análogo al E200K en humanos con enfermedad genética de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) (6), y se determinó que el ternero de la vaca tenía el mismo polimorfismo, lo que indica una mutación hereditaria de la línea germinal en el gen de la proteína priónica (7).

La inoculación intracraneal con inóculo H-BSE E211K se ha notificado previamente en un solo novillo receptor EK211 y en una novilla EE211 (8). El novillo receptor EK211 tuvo un período de incubación reducido en relación con la vaquilla EE211 de tipo salvaje. El propósito de este estudio fue comparar las características de transmisión del inóculo E211K al inóculo EE211 en bovinos con los genotipos homocigotos KK211, heterocigotos EK211 y EE211 PRNP de tipo salvaje. Además, evaluamos el efecto del paso serial de H-BSE en el huésped natural para comparar los resultados con los de estudios que han demostrado la aparición de propiedades similares a las de C-BSE en ratones PRNP bovinizados transgénicos (9), ratones de tipo salvaje (10) y hámsteres (11).

Materiales y métodos

Declaración ética

Los experimentos de laboratorio y con animales se llevaron a cabo en espacios de nivel 2 de bioseguridad que fueron inspeccionados y aprobados para la importación de agentes priónicos por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicios Veterinarios del Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal. Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto de Recursos para Animales de Laboratorio, Academia Nacional de Ciencias, Washington, DC, EE.UU.) y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Granja en Investigación y Enseñanza (Federación de Sociedades de Ciencia Animal, Champaign, IL, EE.UU.). El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Nacional de Enfermedades Animales (número de protocolo: ARS-3890), que exige capacitación específica para cada especie en el cuidado de animales para todo el personal que maneja animales.

Animales y procedimientos

Los bovinos utilizados en este experimento fueron producidos por transferencia embrionaria de la descendencia del caso 2006 y/o por cría utilizando semen de un toro EK211 obtenido a través de transferencia embrionaria en el Centro Nacional de Enfermedades Animales. Se incluyeron en el estudio ocho bovinos que representaban tres grupos de genotipos de PRNP: EE211 (n = 3), EK211 (n = 4) y KK211 (n = 1). Los bovinos se dividieron en dos grupos de inoculación y se inocularon intracranealmente con 0,1 g de homogeneizado cerebral de bovinos con H-BSE. Los dos inóculos se originaron a partir de un caso estadounidense de H-BSE en 2006 asociado con el polimorfismo E211K (H-BSE_E211K) y un caso de EEB-H en Estados Unidos en 2004 en un bóvido de genotipo EE211 de tipo salvaje (H-EEB)_EE211) (12). Los terneros de novillos fueron inoculados entre las edades de 2 y 5 meses, excepto un ternero de tipo salvaje que recibió H-BSE_E211K, que fue inoculado a la edad de 14 meses. El procedimiento de inoculación intracraneal ha sido descrito previamente (13). Brevemente, los terneros fueron sedados con xilacina. La zona frontal se recortó y se frotó con exfoliante de clorhexidina. El proceso de preparación concluyó con la aplicación de alcohol etílico. Se realizó una incisión cutánea de 1 cm en la línea media caudal hasta la unión de los huesos frontal y parietal. Se perforó un orificio de 1 mm a través del hueso del cráneo y se avanzó una aguja espinal de calibre 22 a través del orificio. Posteriormente, se inyectó 1 ml de inóculo homogeneizado cerebral al 10% p/v desde la base hasta la cara dorsal del pantorrilla. La piel se cerró con pegamento de tejido. La sedación se revirtió con tolazolina y el ganado fue monitoreado hasta que se recuperó por completo y deambuló normalmente. Los novillos fueron monitoreados diariamente y alojados en una instalación de animales BSL-2Ag.

Criterios de valoración del estudio, necropsia y recogida de muestras

El ganado fue sacrificado cuando se desarrollaron signos inequívocos compatibles con la EEB. Los signos comenzaron inicialmente como apatía, una posición de cabeza baja y una disminución del consumo de alimento, y progresaron a autoaislamiento, presión de cabeza, tropiezos y renuencia a levantarse. No se permitió que los animales desarrollaran una enfermedad grave en etapa terminal. Los animales fueron sacrificados mediante la administración intravenosa de pentobarbital sódico de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta o según las indicaciones de un veterinario. A cada animal se le realizó una autopsia. Las muestras duplicadas se congelaron y se fijaron en formol neutro tamponado al 10%. Los tejidos recolectados y analizados para este estudio incluyeron los ganglios linfáticos retrofaríngeos, las amígdalas palatinas y el cerebro (corteza cerebral, cerebelo, mesencéfalo incluido el colículo superior y tronco encefálico incluido el obex).

Inmunoensayos y examen microscópico

Las porciones congeladas del tronco encefálico a nivel del óbulo se homogeneizaron y se analizaron para detectar la presencia de PrP^Sc utilizando un kit de inmunoensayo enzimático (EIA) disponible en el mercado (HerdChek; IDEXX Laboratories, Westbrook, ME) de acuerdo con las instrucciones del kit.

Los homogeneizados cerebrales se prepararon de manera similar a los métodos descritos anteriormente (14). Brevemente, las muestras se prepararon en forma de un homogeneizado cerebral al 20% (p/v) en PBS; Se trataron 25-200 μg de proteína total de homogeneizado cerebral con 2,5 μL de proteinasa K (1 mg/ml), 2,5 μL de 20% de sarcosyl/PBS y PBS a un total de 125 μL durante 1 h a 37 °C. La digestión se detuvo con 0,1 mg de Pefabloc durante 20 min a temperatura ambiente. Después de detener la digestión, se extrajeron 25,5 μL para el tratamiento con PNGasa. Posteriormente, 5 μL de tampón de desnaturalización de glicoproteínas y 7 μL de ddH^®₂0 se añadieron a la muestra tratada con PK, que se calentó a 100 °C durante 10 min. A continuación, se añadieron 5 μL de glicotampón, 5 μL de NP-40 y 2,5 μL de PNGasa F a los 25,5 μL previamente eliminados. A continuación, las muestras tratadas con PNGasa se calentaron a 37 °C durante 1 h. Todas las muestras se combinaron con tampón de carga y se calentaron a 100 °C durante 10 minutos antes de la electroforesis en gel. El peso del equivalente tisular cargado fue relativo a la cantidad necesaria para lograr una señal adecuada.

Después de la electroforesis, el gel se transfirió a una membrana de PVDF; A continuación, la membrana se bloqueó durante 60 min con BSA al 3% en TBST al 0,05%. La detección de la señal se logró utilizando el anticuerpo monoclonal anti-PrP SHA31 (concentración de stock 1 mg/mL) (Bertin Technologies, Montigny-le-bretonneux, Francia) o 12B2 (concentración de stock 1 mg/mL) a una dilución de 1-3:10.000, incubado a 4 °C durante la noche o durante 1 h a temperatura ambiente. El SAF-84 (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan) también fue un anticuerpo primario utilizado en una dilución de 1:200 (dilución de stock de 0,2 mg/ml), incubado durante la noche a 4 °C. Posteriormente, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario IgG biotinilado anti-ratón de oveja (GE Healthcare UK Limited, Amersham^TM, Buckinghamshire, Reino Unido), seguido de estreptavidina-HRP. Ambos anticuerpos se diluyeron a 1:10.000 y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Se utilizó ECL más detección (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) junto con un sistema de visualización quimioluminiscente (iBright FL1500, Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, Waltham, MA) para la detección y la obtención de imágenes. El análisis de la migración de Western blot y las glicoformes se realizó utilizando el software iBright Analysis (Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, Waltham, MA).

Los tejidos fijados en formol se incluyeron en parafina y se seccionaron con un grosor óptimo (cerebro, 4 μm; linfoide, 3 μm; y otros, 5 μm) para su análisis microscópico. Inmunohistoquímica (IHQ) dirigida a la PrP^Sc se realizó con el anticuerpo monoclonal F99/97.6.1 a una concentración de 5 μg/mL. El examen histomorfológico y la evaluación subjetiva de los tejidos teñidos con IHQ fueron realizados por un patólogo utilizando un microscopio Nikon Eclipse 50i y una cámara DSfi-2 (Nikon Instruments Inc., Melville, NY).

Análisis de supervivencia

Los períodos de incubación previamente publicados de nueve novillos EE211 inoculados con H-BSE EE2004 211 se utilizaron para ayudar en las comparaciones. Uno de estos novillos (#6913) se muestra en el diagrama de transmisión de la Figura 1, pero no constituyó uno de los ocho bovinos mencionados anteriormente, ya que formaba parte de otro estudio de inoculación; La fuente, la dosis y la ruta del inóculo fueron consistentes entre los trabajos publicados anteriormente (15) y este experimento. Los análisis se realizaron con Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Resultados

Todos los bovinos inoculados con el agente de H-BSE de cualquiera de los genotipos fuente, EE211 o E211K (Figura 1), desarrollaron signos clínicos compatibles con EET, incluyendo elevación de la cabeza, hipermetría, déficits propioceptivos y ataxia. La evaluación postmortem de la EIA del tronco encefálico a nivel del óbex confirmó que todos los animales fueron positivos para la enfermedad priónica (Tabla 1). El período de incubación (Figura 2) estuvo influenciado por el genotipo receptor (P < 0.0001, rango logarítmico de Mantel-Cox). Los bovinos con los genotipos EK211 y KK211 tuvieron periodos medios de incubación de 10,3 y 9,5 meses, respectivamente. Los periodos de incubación de los bovinos con genotipo EK211 fueron similares cuando se les inoculó con diferentes genotipos de inóculo (H-BSE_E211K y H-BSE_EE211). El bovino EE211 salvaje tuvo un período medio de incubación de 17,6 meses, que también fue similar para ambos tipos de inóculo (H-BSE_E211K y H-BSE_EE211).

Para evaluar las diferencias entre los perfiles moleculares, realizamos un análisis de Western blot en el óbex y el cerebelo utilizando anticuerpos de unión anti-PrP de los grupos A, B y C (3), que se unen a diferentes epítopos de PrP bovino: 12B2 (₁₀₁WGQGG₁₀₅), SHA31 (₁₅₆YEDRYYRE₁₆₃), y SAF84 (₁₇₁QVYYRPVDQYS₁₈₁) (9). A modo de comparación, se incluyó un novillo con C-BSE (#76) en las manchas. Se observaron diferencias entre las muestras de EEB-C y EEB-H. Se observaron diferencias adicionales entre las muestras de H-BSE en función del genotipo de PRNP receptor. El tronco encefálico a nivel del óbex del novillo 4, con el genotipo KK211, mostró una mayor banda no glicosilada cuando se probó con el anticuerpo SHA31 en comparación con el bovino del genotipo EE211 (Figura 3). Se realizó la digestión de la PNGasa para evaluar el peso de la banda en ausencia de glicosilación. Cuando se sondearon con el anticuerpo de unión a N-terminal 12B2, los pesos moleculares no glicosilados del ganado EK211 y EE211 fueron similares a los del novillo del genotipo KK211 PRNP.

El porcentaje de la banda digliosilada fue superior al 50% en la EEB-C cuando se sondeó con SHA31. La encefalopatía espongiforme bovina (EEB-C) no se detectó con 12B2, pero cada muestra de EEB-H se detectó con el anticuerpo N-terminal. El porcentaje de bandas digliosiladas en la EEB-H fue dependiente del anticuerpo utilizado y del genotipo del ganado. Se observó una banda densa digliosilada con 12B2 en los novillos 83, 4 y 1, que correspondieron a los genotipos EK211, KK211 y EK211, respectivamente. Cuando se sondearon con SHA31, solo los novillos 4 y 1 conservaron el perfil fuertemente diglicosilado. Los bovinos con el genotipo EE211 de tipo salvaje tuvieron proporciones más similares en términos de bandas digliccosiladas, monoglicosiladas y no glicosiladas para los anticuerpos SHA31 y 12B2, en comparación con las mayores discrepancias observadas en los bovinos con genotipo EK211 y KK211 (Figura suplementaria 1). Cuando se sondearon con el anticuerpo SAF-84, todas las muestras de H-BSE tenían cuatro bandas, con la banda adicional presente entre 14 y 15 kDa (Figura suplementaria 2). La banda monoglicosilada tuvo la mayor proporción de señal. Todas las muestras de H-BSE eran claramente distintas de las de C-BSE según los glicoperfiles que utilizaban SAF-84.

Todos los bovinos presentaron cambios espongiformes e inmunorreactividad para la PrP^Sc en el cerebro (Figura complementaria 3). No hubo diferencias entre genotipos en los tipos o patrones de inmunomarcaje. La mayor densidad de inmunorreactividad se observó en el tronco encefálico, pero la cantidad total de PrP inmunorreactiva^Sc variado entre los bovinos. A nivel de óbex, se presentaron inmunomarcaje particulado, perineuronal, intraglial e intraneuronal. En el neocórtex a nivel de los núcleos basales predominaron los tipos de marcaje particulado, estrellado, perineural e intraneuronal. Inmunomarcaje para PrP^Sc era relativamente escasa en el cerebelo en comparación con otras regiones cerebrales del mismo animal. El marcaje cerebeloso consistió en partículas finas y gruesas en las capas de células moleculares y granulosas. También se observó algún tipo de inmunomarcaje estrellado en la capa molecular.

Discusión

Se evaluó el efecto del polimorfismo K211 PRNP sobre las características de transmisión de la H-BSE después de la inoculación intracraneal. Este estudio demostró que el ganado que portaba al menos un solo alelo K211 tenía períodos de incubación más cortos en comparación con el ganado EE211 de tipo salvaje. Esto fue similar a los hallazgos reportados previamente en un solo animal (8); sin embargo, en el presente estudio se expusieron además las características de transmisión de la EEB-H en un animal homocigoto KK211, se investigó el efecto del inóculo K211 en la transmisión y se trató de determinar si el paso en serie de la EEB-H en el ganado vacuno provocaría cambios en las propiedades de la cepa.

El período de incubación fue similar tanto en el ganado KK211 como en el EK211; la presencia de dos alelos K211 no aceleró significativamente la progresión de la enfermedad. Fue inesperado que el genotipo del donante no influyera en el período de incubación, especialmente cuando los genotipos del donante y del receptor coincidían. En ovejas, se ha demostrado que la homología genotípica entre el donante y el receptor da lugar a tiempos de incubación más cortos en comparación con la transmisión del genotipo heterólogo (16); sin embargo, este no fue el caso cuando los bovinos EK211 o KK211 fueron inoculados con EK211 H-BSE en comparación con EE211 H-BSE.

Las enfermedades priónicas humanas, como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), se han clasificado en tres etiologías: genética, esporádica y adquirida (17). Durante mucho tiempo se ha teorizado que la H-EEB es de origen esporádico (2). Los períodos de incubación más cortos en el ganado con un alelo K211 sugieren una mejor eficiencia de conversión de la proteína priónica K211 en su forma mal plegada. Trabajos publicados anteriormente han sugerido que la mutación de la línea germinal que produjo una sustitución de aminoácidos E211K podría ser la primera documentación de una forma genética de H-BSE (7). Se está llevando a cabo un estudio de envejecimiento a largo plazo para investigar la posibilidad de una etiología genética de la EEB-H en bovinos que expresan el alelo K211. Todavía se desconoce la causa de la EEB-H esporádica; sin embargo, en humanos, las mutaciones somáticas en el gen de la proteína priónica se han implicado como la causa de algunos casos de ECJ espontánea (17). Un estudio de Won et al. investigó las mutaciones somáticas de K211 en tejidos de ganado (18). Curiosamente, los autores solo encontraron mutaciones somáticas K211 en el bulbo raquídeo; sin embargo, se desconoce el nivel de mutaciones somáticas necesarias para provocar una EEB atípica. Se necesita más trabajo para evaluar la posibilidad de que las mutaciones somáticas de PRNP en el codón 211 puedan provocar H-BSE espontánea.

Nuestros hallazgos sobre los fenotipos clínicos y patológicos de la enfermedad en el ganado bovino fueron similares a los de investigaciones previas de H-BSE_E211K en el ganado bovino (8, 13). La inmunorreactividad se limitó al SNC y no hubo PrP periférica^Sc se detectó mediante técnicas convencionales de inmunoensayo. Esto era esperable dada la vía intracraneal de inoculación. El trabajo futuro investigará el efecto de una ruta de inoculación alternativa en bovinos con H-BSE polimórfica K211.

El análisis del fenotipo molecular reveló diferencias en el peso de la PrP no glicosilada^Sc de novillos con los genotipos KK211 y EK211 PRNP cuando se sondearon con anticuerpos SHA31 y 12B2. Los epítopos de unión para SHA31 y 12B2 son ₁₅₆YEDRYYRE₁₆₃ y ₁₀₁WGQGG₁₀₅ de la secuencia de PrP bovina, respectivamente (9). Usando SHA31, toda la PrP no glicosilada^Sc los fragmentos de bovinos de los genotipos EK211 y EE211 pesaron menos (mostrando un patrón más bajo) que la PrP no glicosilada^Sc fragmentos del animal genotipo KK211 (novillo 4). La diferencia de peso entre los genotipos de ganado fue menos marcada cuando se sondeó con 12B2 de unión a N-terminal. El peso del fragmento no glicosilado en el novillo KK211 fue de ~21 kDa cuando se probó con anticuerpos 12B2 y SHA31. Fueron las muestras circundantes las que demostraron aumentos en los pesos moleculares de ~1,5 kDa cuando se utilizó 12B2. Esto sugiere que hay múltiples sitios de escisión PK, incluido uno entre los epítopos de unión 12B2 y SHA31 que resultó en fragmentos más pequeños solo detectables con SHA31, pero este sitio de escisión adicional no fue evidente en KK211 PrP^Sc, produciendo así una banda no glicosilada más grande.

Comparamos los fenotipos resultantes de la EEB-H en bovinos con la EEB-C. Nuestros resultados no mostraron divergencia de la cepa priónica hacia un fenotipo de EEB-C después del paso intracraneal en serie de la EEB-H_E211K o H-BSE_EE211. Los períodos de incubación en bovinos inoculados con el agente de H-BSE se mantuvieron similares después del paso seriado. Además, no observamos diferencias en la neuropatología posterior al paso seriado. En cuanto a las características moleculares, ninguna de las muestras de H-EEB perdió su capacidad de unión al N-terminal, una característica descriptiva de la EEB-C y la EEB-L (19). El patrón característico de una cuarta banda, de ~14 kDa, se mantuvo en las muestras de H-BSE sondeadas con SAF84 (3). Los ratones transgénicos que sobreexpresan PrP bovina han demostrado la aparición de fenotipos similares a la C-EEB a partir de algunos aislados de H-BSE en un subconjunto de ratones inoculados (9). Aunque no observamos un cambio fenotípico en el huésped natural, numerosos factores pueden explicar la diferencia en los resultados. En primer lugar, solo un pequeño subconjunto (20-25%) de ratones exhibió la aparición del fenotipo similar a la C-BSE. El pequeño tamaño de la muestra de bovinos utilizada en el presente estudio puede haber estado por debajo del umbral estadístico para detectar un evento de tan baja prevalencia. En segundo lugar, es posible que un componente de la cepa menor de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) no estuviera presente en nuestro inóculo de la EEB-H. En tercer lugar, la aparición de la cepa C-BSE puede requerir una modulación fisicoquímica específica del inóculo que no se produjo durante la preparación del inóculo. La ausencia de un fenotipo similar a la C-EEB en nuestros resultados no excluye la posibilidad de que ocurra tal evento, ni nos permite descartar la hipótesis de que la encefalopatía espongiforme bovina C surja de la encefalopatía espongiforme bovina (H-EEB) debido a la extracción de cadáveres (un proceso que altera las propiedades fisicoquímicas) que posteriormente se devolvieron a los rumiantes.

En resumen, el fenotipo molecular de la EEB-H en bovinos con el genotipo KK211 fue distinguible del de los animales con genotipo PRNP EK211 y EE211, aunque todas las muestras de EEB-H conservaron fenotipos moleculares característicos de la EEB-H. Los períodos de incubación de los bovinos KK y EK fueron similares, y ambos fueron significativamente más rápidos que los bovinos de tipo salvaje con H-BSE. En estudios futuros se investigará el efecto de la vía de inoculación y el paso en serie sobre el fenotipo de la cepa de EEB en bovinos.

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio están incluidas en el artículo/Material complementario, las consultas adicionales pueden dirigirse a los autores correspondientes.

Declaración ética

El estudio en animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Nacional de Enfermedades Animales (número de protocolo: ARS-3890). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la legislación local y los requisitos institucionales.

Contribuciones de los autores

EC: Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Administración de proyectos, Recursos, Supervisión, Visualización, Redacción: borrador original, Redacción: revisión y edición. AF: Análisis formal, Investigación, Redacción, revisión y edición. KB: Análisis formal, Investigación, Redacción, revisión y edición. JG: Conceptualización, Curación de datos, Investigación, Administración de proyectos, Recursos, Supervisión, Redacción, revisión y edición.

Financiación

El/los autor/es declara(n) haber recibido apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo. Esta investigación fue financiada en su totalidad por fondos asignados por el Congreso al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola, Maryland, Estados Unidos. Los financiadores del trabajo no influyeron en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Esta investigación fue apoyada en parte por un nombramiento en el Programa de Participación en Investigación del Servicio de Investigación Agrícola (ARS, por sus siglas en inglés) administrado por el Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación (ORISE, por sus siglas en inglés) a través de un acuerdo interinstitucional entre el Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE, por sus siglas en inglés) y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA, por sus siglas en inglés). ORISE es administrada por ORAU bajo el número de contrato del DOE DE-SC0014664.

Reconocimientos

Agradecemos a Quazetta Brown, Martha Church, Ami Frank, Kevin Hassall, Joe Lesan, Leisa Mandell y Trudy Tatum por brindar apoyo técnico a este proyecto.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

El/los autor/es declararon, en el momento de la presentación, ser miembro del consejo editorial de Frontiers. Esto no tuvo ningún impacto en el proceso de revisión por pares ni en la decisión final.

Nota del editor

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Descargo de responsabilidad del autor

Todas las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan necesariamente las políticas y puntos de vista de USDA, ARS, DOE u ORAU/ORISE. Los hallazgos y conclusiones de esta publicación son los de los autores y no deben interpretarse como representativos de ninguna determinación o política oficial del USDA o del gobierno de los EE. UU. Cualquier mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica una recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura. El Departamento de Agricultura es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2023.1301998/full#supplementary-material

Referencias